1、 应用微生物学应用微生物学Applied Microbiology应用微生物学应用微生物学概论概论微生物的生长微生物的生长微生物的代谢微生物的代谢微生物的遗传与遗传育种微生物的遗传与遗传育种微生物基因工程微生物基因工程应用微生物的基因操作系统应用微生物的基因操作系统酶工程与生物转化酶工程与生物转化微生物发酵微生物发酵微生物代谢工程微生物代谢工程概 论基本概念基本概念应用微生物学的发展应用微生物学的发展微生物细胞的结构微生物细胞的结构重要的应用微生物重要的应用微生物定义应用微生物学应用微生物学:以一定的直接或间接应用目标研究微生物及以一定的直接或间接应用目标研究微生物及其相互作用和与环境的作用的
2、科学。其相互作用和与环境的作用的科学。(applied microbiology)微生物学与相关的生物技术相结合，以实现微生物学与相关的生物技术相结合，以实现一定的一定的直接或间接应用目标。直接或间接应用目标。(microbiology in application)微生物的特点资源量大（多样性丰富）资源量大（多样性丰富）生物量大（生长迅速）生物量大（生长迅速）可塑性大（便于操作）可塑性大（便于操作）个体小（便于运输、携带）个体小（便于运输、携带）完成自然界的物质循环完成自然界的物质循环造福人类造福人类引起灾难引起灾难当前人类面临的问题资源的压力资源的压力环境的挑战环境的挑战传染病的新生与复发
3、传染病的新生与复发微生物的应用部分细胞细胞基因基因基因产物（酶、蛋白质）基因产物（酶、蛋白质）代谢产物代谢产物应用微生物学需解决的问题微生物菌种的获得和优化微生物菌种的获得和优化微生物培养条件的建立和优化微生物培养条件的建立和优化微生物的应用微生物的应用应用微生物学研究的一般流程 提出问题（工业、农业、环境、健康、国防提出问题（工业、农业、环境、健康、国防）微生物？微生物？No Yes 菌种菌种 解决问题解决问题 发酵发酵 解决问题解决问题 应用应用 解决问题解决问题应用微生物学的发展应用微生物学的发展 微生物学的发展是与应用紧密联系的逐步建立方法认识微生物逐步建立方法认识微生物 Leenwe
4、nhock(1673)显微镜 Jenner(1798)牛痘 Basteur(1860s)发酵、低温灭菌、自然发生 Koch (1881)纯培养微生物形成产业微生物形成产业 Fleming(1929)青霉素 Waksman(1944)链霉素 现代生物技术现代生物技术 Cohen(1972)DNA 重组微生物细胞的结构细胞壁细胞壁形态保持、物质交换、信号识别形态保持、物质交换、信号识别细胞膜细胞膜转运转运细胞质细胞质酶、反应场所酶、反应场所细胞核细胞核遗传物质遗传物质核外遗传物质核外遗传物质线粒体、质粒线粒体、质粒重要的应用微生物重要的应用微生物病毒：病毒：?-噬菌体噬菌体细菌：大肠杆菌细菌：大肠
5、杆菌(E.coli)棒杆菌棒杆菌(Corynebacterium)放线菌：链霉菌放线菌：链霉菌(Streptomyces)酵母菌：酿酒酵母酵母菌：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisia)真菌：曲霉真菌：曲霉(Aspergillus)第一章 微生物的生长微生物生长的条件微生物生长的条件培养基培养基生长动力学生长动力学 微生物细胞的化学组成细胞中几种主要元素的含量(干重的百分数)细胞干物质中主要组分和含量(%)元素细菌酵母菌霉菌C505345504063N1215 7.512.4710O203040H877细菌酵母菌霉菌蛋白质508032752040碳水化合物1228276371
6、0 脂类520215440核酸1020681灰分物质210710510 微生物生长的条件物质条件水水 aw=P/P0 微生物类群 最低aw值 细菌0.91 酵母菌0.88 霉菌0.80 耐干霉菌0.65 耐高渗酵母菌0.60微生物生长的条件物质条件碳源和氮源碳源和氮源O H P S K Ca Mg FeMn Cu Zn Mo Co Ni V B Cl Na Si 维生素、氨基酸等维生素、氨基酸等 微生物生长的条件环境条件pH 中性（弱酸、碱）、嗜酸、嗜碱中性（弱酸、碱）、嗜酸、嗜碱温度温度 最适、生长、耐受最适、生长、耐受氧气氧气 严格（专性）好氧、兼性、耐氧厌氧、严格厌氧严格（专性）好氧、兼
7、性、耐氧厌氧、严格厌氧压力压力渗透压渗透压极端环境微生物极端环境微生物(extremophile)不可培养微生物不可培养微生物(VBNC vive but non-cultured)极端微生物与不可培养微生物极端微生物与不可培养微生物极端环境微生物极端环境微生物(extremophile):依赖于一种或多种依赖于一种或多种极端物化因子生存的微生物极端物化因子生存的微生物嗜热菌：嗜热菌：50-80C (hyperthermophiles80C)嗜冷菌：嗜冷菌：16C嗜酸菌：嗜酸菌：9嗜盐菌：嗜盐菌：3M嗜压菌嗜压菌不可培养微生物不可培养微生物(VBNC vive but non-cultured
8、)培养基 提供微生物生长所需物质与环境条件提供微生物生长所需物质与环境条件的体系的体系培养基的组成要素碳源、氮源、提供各种元素的无机盐碳源、氮源、提供各种元素的无机盐生长因子或含生长因子的物质生长因子或含生长因子的物质水、固化基（固体培养基）水、固化基（固体培养基）pH、渗透压（糖、盐浓度）、灭菌条件、渗透压（糖、盐浓度）、灭菌条件培养基的种类按物理状态：固体、液体、半固体按物理状态：固体、液体、半固体按化学组成：合成、丰富、半合成按化学组成：合成、丰富、半合成按使用目的：种子、发酵、筛选、再按使用目的：种子、发酵、筛选、再 生、生、富集富集培养基的选择和设计原则培养基的选择和设计原则适用：利
9、于达到目的适用：利于达到目的 利于下游工艺利于下游工艺 重复性好重复性好经济：原料价格经济：原料价格 原料用量原料用量 全工艺综合平衡全工艺综合平衡安全：环境影响安全：环境影响 生物安全生物安全培养基的选择和设计是应用微生物学研究的重要内容培养基的选择和设计是应用微生物学研究的重要内容生长动力学增值曲线增值曲线（Multiplication curve）：）：细胞数细胞数-时间时间生长曲线生长曲线（growth curve）：）：细胞量细胞量-时间时间0 010102020303040405050606070700 04 48 8121216162020增值增值曲线曲线生长生长曲线曲线微生物生
10、长的实验计量显微计数显微计数菌落计数菌落计数浊度测定浊度测定细胞干重细胞干重微生物生长的数学描述 比生长速度比生长速度(specific growth rate)=dx/xdt 细菌 0.6-1.2 酵母菌 0.3-0.5 放线菌 0.1-0.3 真菌 0.1-0.3 生物量倍增时间生物量倍增时间(biomass doubling time)td=ln2/增值度增值度(multiplication degree)x/xo第二章 微生物的代谢微生物初级代谢微生物初级代谢微生物次级代谢微生物次级代谢代谢调节代谢调节 微生物的代谢 微生物细胞所进行的生化反应的总和微生物细胞所进行的生化反应的总和物质
11、代谢物质代谢 细胞内及细胞与环境间的物质转换的过程细胞内及细胞与环境间的物质转换的过程能量代谢能量代谢 载体载体信息代谢信息代谢微生物初级代谢微生物初级代谢微生物从环境摄取物质、获得能量、合成自身新物质微生物从环境摄取物质、获得能量、合成自身新物质的过程的过程 营养物 废弃物 能量（用于生长）能量 合成代谢合成代谢 （用于运动和物质转运）细胞组分 酶 分解代谢分解代谢 能量来源重要的初级代谢途径糖酵解途径糖酵解途径 糖代谢的共同分解途径糖代谢的共同分解途径三羧酸循环三羧酸循环 将糖最终氧化为二氧化碳和水，并产生大量能量将糖最终氧化为二氧化碳和水，并产生大量能量磷酸戊糖途径磷酸戊糖途径 产生四碳
12、糖、五碳糖和七碳糖等多种中间产物产生四碳糖、五碳糖和七碳糖等多种中间产物EDED途径途径 细菌代谢葡萄糖产生乙醇的途径细菌代谢葡萄糖产生乙醇的途径氨基酸合成途径氨基酸合成途径糖酵解途径糖酵解途径(Embden-Meyerhof pathway)GLC HXK ZWF SOL GND G6P G15L P6G RU5P PGI F6P PFKFBP F16P FBA GLYG3P DHAP GAP TPI TDH P13G PGK 3PG GPM 2PG ENO PEP PYK PDC ADH PYR ACA ETH三羧酸循环三羧酸循环(Krebs cycle)PYR ACoA MDH CIT
13、MAL OAA CTT FUM ACO FUM ICI SDH OSM IDP SUC SUCC AKG LSC KGD磷酸戊糖途径磷酸戊糖途径氧化（氧化（产生产生NADPH）RU5P P6G G15L G6P RKI RPE非氧化非氧化 R5P X5P （分子重排分子重排）TKL TKL GAP S7P E4P TKL F6PED途径 存在于某些缺乏完整EMP途径的微生物中，是微生物特有的,将2-酮-3脱氧-6-磷酸葡糖酸（KDPG）裂解为丙酮酸和3-磷酸甘油醛。氨基酸合成途径氨基酸合成途径 GLC 3PG Ser,Gly,Met（3磷酸甘油酸衍生型）磷酸甘油酸衍生型）PPP R5P PEP
14、 Phe,Try,Trp （芳香族芳香族氨基酸）氨基酸）His PRY Ala,Val,Leu（丙酮酸衍生型）丙酮酸衍生型）OAA Asp ASA Lys（草酰乙酸衍生型）草酰乙酸衍生型）TCA Asn HS Thr AKG Met Ile Arg Glu Gln（酮戊二酸衍生型）酮戊二酸衍生型）Pro微生物次级代谢微生物次级代谢 次级代谢是相对于初级代谢的概念，指微次级代谢是相对于初级代谢的概念，指微生物在一定的生长时期（一般为稳定期）以初生物在一定的生长时期（一般为稳定期）以初级代谢物为前体、合成对微生物生命活动没有级代谢物为前体、合成对微生物生命活动没有明确功能的物质的过程。明确功能的物
15、质的过程。次级代谢（前体聚合、次级代谢（前体聚合、初级代谢初级代谢 结构修饰、装配）结构修饰、装配）营养物营养物 前体前体 次级代谢物次级代谢物 （初级代谢物）（初级代谢物）次级代谢的生物学意义次级代谢的生物学意义 次级代谢的生理意义目前尚无定论，但它肯定对微生物是有意次级代谢的生理意义目前尚无定论，但它肯定对微生物是有意义的，否则这种需要多种酶类协同参与、并在精细的调节机制控义的，否则这种需要多种酶类协同参与、并在精细的调节机制控制之下的代谢过程是不会在生物体内保存下来的。制之下的代谢过程是不会在生物体内保存下来的。维持初级代谢的平衡维持初级代谢的平衡次级代谢产物作为储藏物质的一种形式次级代
16、谢产物作为储藏物质的一种形式使菌体在生存竞争中占优势使菌体在生存竞争中占优势与细胞分化有关与细胞分化有关青霉素 S CH3R-CO-NH-HCCH C B A CH3 OC-N-CH COOH侧链：R-CO-母核：噻唑环 A，-内酰胺环 B青霉素的生物合成代谢调节代谢调节 细胞为维持正常的生理功能，细胞为维持正常的生理功能，它的组分、代谢物、能量和电子载它的组分、代谢物、能量和电子载体的合成大体上应保持恒定。当环体的合成大体上应保持恒定。当环境或细胞自身发生某种变化时，可境或细胞自身发生某种变化时，可以通过一定的反馈作用来达到平衡以通过一定的反馈作用来达到平衡生长，这种反馈作用即代谢调节。生长
17、，这种反馈作用即代谢调节。代谢调节的位点 DNA RNA 酶 底物 底物 产物 （营养物）（或中间物）底物进入，酶的活性，酶的合成代谢调节的本质：酶的调节酶合成的调节：诱导与阻遏酶合成的调节：诱导与阻遏基因水平基因水平酶活性的调节：反馈抑制酶活性的调节：反馈抑制蛋白质水平蛋白质水平适应现象例例1，大肠杆菌乳糖代谢：大肠杆菌乳糖代谢：半乳糖苷酶 乳糖-半乳糖+葡萄糖 E.coli生长于无乳糖培养基，半乳糖苷酶：3 分子/细胞 E.coli生长于含乳糖培养基，半乳糖苷酶：3000-5000 分子/细胞例例2，大肠杆菌色氨酸代谢：大肠杆菌色氨酸代谢：E.coli生长于无色氨酸培养基，合成色氨酸合成酶
18、，当色氨酸浓度增加时，色氨酸合成酶浓度下降。细胞需要某种酶时才合成，反映出细胞的自我调节机理。这种诱细胞需要某种酶时才合成，反映出细胞的自我调节机理。这种诱导物诱导可诱导酶的产生与辅抑物抑制可阻遏酶的产生的现象称适应导物诱导可诱导酶的产生与辅抑物抑制可阻遏酶的产生的现象称适应现象。现象。乳糖：诱导物诱导物(inducer)色氨酸：辅抑物辅抑物(corepressor)底物与诱导物底物不等于诱导物底物不等于诱导物对 半乳糖苷酶乳糖IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）苯基半乳糖苷苯基硫代半乳糖苷作底物+-+-作诱导物+-乳糖操纵子 i P O Z Y A 调节基因 i：编码阻遏蛋白启动子 P：有CAP(
19、CAP与cAMP复合物)和RNase两个位点操纵基因 O：阻遏蛋白结合位点结构基因 Lac Z：半乳糖苷酶 Lac Y：半乳糖苷透性酶 Lac A：半乳糖苷转乙酰酶 协同诱导和顺序诱导协同诱导协同诱导 I a、b、c a b c顺序诱导顺序诱导 A B C D I a B b C c操纵子(operon)I P O S1 S2 S3 调节基因调节基因 启动基因启动基因 操纵基因操纵基因 结构基因结构基因 变构变构 (+or-)外界信号外界信号调节蛋白调节蛋白I or CoR 操纵子：一组功能相关的基因共同组成的转录单位，操纵子：一组功能相关的基因共同组成的转录单位，它们结构上紧密联系、功能上协
20、同表达，接受同一调控序它们结构上紧密联系、功能上协同表达，接受同一调控序列的调控。列的调控。诱导与阻遏 调节调节 调节蛋白活性调节蛋白活性 操纵子操纵子 结构基因结构基因 酶合成酶合成诱导诱导 正正 打开打开 表达表达 诱导诱导 负负 打开打开 表达表达 阻遏阻遏 正正 关闭关闭 不表达不表达 阻遏阻遏 负负 关闭关闭 不表达不表达 反馈抑制反馈抑制：反馈抑制：在合成代谢途径中，代谢终产物抑制途径中第一个酶的作用。E1 E2 E3 E4 A B C D E反馈抑制能对环境变化做出快速反应反馈抑制能对环境变化做出快速反应特点：特点：1，只有终产物或其结构类似物有反馈抑制 2，受抑制的是途径中的第
21、一个酶 3，反馈抑制是可逆的别构酶别构酶(allosteric enzyme)有多亚基和四级结构有多亚基和四级结构有结合底物的活性中有结合底物的活性中心和结合调节物的别心和结合调节物的别构中心构中心活性中心和别构中心活性中心和别构中心在酶分子的不同部位在酶分子的不同部位分支生物合成途径的调节 P1 A B C P2协同反馈抑制协同反馈抑制同功酶反馈抑制同功酶反馈抑制累积反馈抑制累积反馈抑制顺序反馈抑制（细调）顺序反馈抑制（细调）协同反馈抑制协同反馈抑制 P1 A B C P2 合成代谢途径中的第一个酶有几个变构中心，分别可与不同终产合成代谢途径中的第一个酶有几个变构中心，分别可与不同终产物结合
22、，每一种终产物对第一个酶都没有反馈抑制作用，只有当几物结合，每一种终产物对第一个酶都没有反馈抑制作用，只有当几种终产物同时过量时才有反馈抑制作用。种终产物同时过量时才有反馈抑制作用。同功酶反馈抑制同功酶反馈抑制 P1 A B C P2 合成代谢途径中的第一个酶有几种结构略有不同的同功酶，每一合成代谢途径中的第一个酶有几种结构略有不同的同功酶，每一种终产物只对一种同功酶有反馈抑制作用，只有当几种终产物同时种终产物只对一种同功酶有反馈抑制作用，只有当几种终产物同时过量时，才使几种同功酶同时被作用而抑制合成反应。过量时，才使几种同功酶同时被作用而抑制合成反应。积累反馈抑制积累反馈抑制 P1 A B
23、C P2 每一种终产物对第一个酶都有一定的反馈抑制作用，他们合在一每一种终产物对第一个酶都有一定的反馈抑制作用，他们合在一起达到最大程度的反馈抑制。起达到最大程度的反馈抑制。顺序反馈抑制顺序反馈抑制 P1 A B C P2 合成代谢途径中的第一个酶的效应物不直接是终产物而是代谢分合成代谢途径中的第一个酶的效应物不直接是终产物而是代谢分支点的中间物，每一种终产物抑制分支后的第一个酶，使分支点的支点的中间物，每一种终产物抑制分支后的第一个酶，使分支点的中间物积累，然后抑制合成代谢途径的第一个酶。中间物积累，然后抑制合成代谢途径的第一个酶。这一调节作用可根据不同终产物的量分别调节，是一种细调。这一调
24、节作用可根据不同终产物的量分别调节，是一种细调。在许多分支代谢的调节中，细调与粗调往往同时发生。在许多分支代谢的调节中，细调与粗调往往同时发生。第三章 微生物的遗传与菌种选育微生物的遗传物质微生物的遗传物质基因突变基因突变基因重组基因重组遗传育种遗传育种 微生物的遗传物质核酸核酸(DNA RNA)染色体染色体染色体外遗传物质染色体外遗传物质DNA是遗传物质的实验证明肺炎双球菌转化肺炎双球菌转化 S-dead，S-alive，R-alive S dead-S-S R噬菌体感染噬菌体感染 T2(DNA-32P,protein-35S)-E.coli-上清上清T2（35S）沉淀沉淀E.coli（32
25、P ）双螺旋模型双螺旋模型遗传育种基本过程基本过程 基因突变、重组、导入、敲除 筛选 出发菌株 包含变异株的群体 优良变异株 目的株 检验 检验产生变异株产生变异株选择变异株选择变异株检验变异株检验变异株基因突变遗传物质小范围的改变，只涉及一对或少数几遗传物质小范围的改变，只涉及一对或少数几对碱基，又称点突变。对碱基，又称点突变。基因突变的类型基因型基因型 置换：置换：GA,CT 转换转换(transition)；G,A C,T颠换颠换(transversion)移码移码(frameshift)：DNA分子中一对或几对核苷酸的增加或缺失分子中一对或几对核苷酸的增加或缺失表型表型 形态：造成形态
26、发生改变的突变形态：造成形态发生改变的突变 致死：造成个体死亡或生活力下降（半致死）的突变致死：造成个体死亡或生活力下降（半致死）的突变 条件致死：在一定条件下有致死效应的突变条件致死：在一定条件下有致死效应的突变 生化：没有形态效应的突变，如营养缺陷、抗药性等生化：没有形态效应的突变，如营养缺陷、抗药性等翻译翻译 同义、错义、无义同义、错义、无义(UAG,UGA,UAA)基因突变的特性稀有性稀有性 突变率低（可通过理化处理提高突变率）突变率低（可通过理化处理提高突变率）随机性随机性独立性独立性 Kmr 10-5,Apr 10-6,Kmr Apr 10-11可逆性可逆性 回复突变率也很低回复突
27、变率也很低稳定性稳定性突变率：一个世代或一定时间内发生突变的概率。突变率：一个世代或一定时间内发生突变的概率。几种微生物每次复制的突变率 微生物微生物基因组大小基因组大小（bp）突变率突变率（碱基）（碱基）突变率突变率（基因组）（基因组）噬菌体M136.41037.21070.0046噬菌体4.91047.71080.0038噬菌体T2、T41.71052.41080.0040大肠杆菌4.61065.410100.0025酿酒酵母1.21072.210100.0027粗糙脉胞菌4.21077.210110.0030平均 0.0034诱变剂 能引起微生物遗传物质发生改变的能引起微生物遗传物质发生
28、改变的化学物理因子化学物理因子化学：碱基类似物（化学：碱基类似物（5-溴尿嘧啶、羟胺、亚硝酸）溴尿嘧啶、羟胺、亚硝酸）烷化剂（亚硝基胍、硫酸二乙酯）烷化剂（亚硝基胍、硫酸二乙酯）物理：短波（紫外线）物理：短波（紫外线）射线（射线（X-射线、射线、射线）射线）诱变剂的作用诱变剂诱变剂诱变作用诱变作用对对DNA的影响的影响诱变能力诱变能力5-溴尿嘧啶溴尿嘧啶碱基错配碱基错配转换转换(AT GC)弱弱羟胺羟胺胞嘧啶脱酰胺胞嘧啶脱酰胺转换转换(GCAT)弱弱亚硝酸亚硝酸A、C、G脱酰胺脱酰胺转换转换(AT GC)、缺失、缺失中中亚硝基胍亚硝基胍A、C烷基化烷基化转换转换(GCAT)强强硫酸二乙酯硫酸二
29、乙酯A、C烷基化烷基化转换转换(GCAT)强强溴化乙啶溴化乙啶嵌入碱基对嵌入碱基对移码移码弱弱紫外线紫外线嘧啶二聚嘧啶二聚转换转换(GCAT)、巅换、巅换、缺失、移码缺失、移码中中射线射线DNA单链或双链断裂单链或双链断裂结构改变、缺失结构改变、缺失强强基因突变的应用-诱变育种虽然分子生物学技术已普遍用于育种，诱变育种仍是虽然分子生物学技术已普遍用于育种，诱变育种仍是重要而基本的育种方法。重要而基本的育种方法。诱变育种的基本步骤：诱变育种的基本步骤：出发株出发株诱变剂处理诱变剂处理初筛初筛复筛复筛鉴定鉴定 一般要进行多次，以积累有益突变。一般要进行多次，以积累有益突变。诱变谱系：诱变谱系：诱变
30、剂处理诱变剂处理1 诱变剂处理诱变剂处理2出发株出发株 中间株中间株1 中间株中间株2 目的株目的株 诱变育种的关键环节出发株：性状、潜力出发株：性状、潜力诱变处理：诱变剂选择、剂量诱变处理：诱变剂选择、剂量筛选：方法、筛选量筛选：方法、筛选量High-throughput screening致死率与诱变效果0 020204040606080801001001201200 05 510101515存活数存活数突变株数突变株数突变株的筛选初筛：弃去大量无价值菌株初筛：弃去大量无价值菌株复筛：选出少数有价值菌株复筛：选出少数有价值菌株方法：方法：直接测定直接测定 利用可观察现象利用可观察现象 营养
31、限制培养基营养限制培养基 选择培养基选择培养基组成型育种 半乳糖苷酶半乳糖苷酶加诱导酶抑制剂加诱导酶抑制剂 培养基：培养基：乳糖乳糖+邻硝基邻硝基-D-岩藻糖苷（诱导型酶抑制剂）岩藻糖苷（诱导型酶抑制剂）只有组成型能利用乳糖只有组成型能利用乳糖交替培养法交替培养法 培养基培养基1：乳糖：乳糖 培养基培养基2：葡萄糖：葡萄糖 交替培养使组成型优势扩大交替培养使组成型优势扩大交替培养法交替培养法组成型组成型诱导型诱导型组成型：诱导型组成型：诱导型1061061:1乳糖乳糖106-108106 2x10650:1葡萄糖葡萄糖107-1092x105-2x10750:1乳糖乳糖108-10102x10
32、6-4x1062500:1葡萄糖葡萄糖109-10114x105-4x1072500:1乳糖乳糖1010-10124x106-8x106125000:1葡萄糖葡萄糖1011-10138x105-8x107125000:1营养缺陷型育种 营养缺陷型营养缺陷型 C-A B C B 积累积累 A B C D 积累积累 D 抗反馈抑制育种原理：原理：产物产物+酶（结合于调节中心）酶（结合于调节中心）反馈抑制反馈抑制 类似物类似物+酶（结合于调节中心）酶（结合于调节中心）影响生长影响生长 抗类似物的变异株抗类似物的变异株 类似物与酶的调节中心不能结合类似物与酶的调节中心不能结合 产物与酶的调节中心不能结
33、合产物与酶的调节中心不能结合 反馈抑制解除反馈抑制解除 产物能过量积累产物能过量积累抗反馈抑制育种举例苏氨酸苏氨酸 C.crenatum AS 1.542 0 mg/ml MNNG LR-1458 AHVr 6mg/ml A)：使G的7位和A的3位N部分甲基化，中性pH加热，G(少量A)碱基脱落，再用0.1 mol NaOH处理，加热到90C使糖基脱落硫酸二甲酯处理后加稀酸:A先断裂(AG)，再用0.1 mol NaOH处理，加热到90C使糖基脱落DNA与肼反应(C+T)：C、T脱落成核糖脲，与哌啶作用在C、T处切断DNA DNA与肼反应时加2M NaCl(C)：可抑制T脱落双脱氧法双脱氧法4
34、种反应体系中掺入ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP，反应分别止于A、C、G、T控制dNTP与ddNTP的比例，可得不同长度的DNA片段M13噬菌体序列分析系统M13噬菌体：丝状噬菌体，基因组为环状单链DNA，在细胞内的复制型(RF)为环状双链DNA MCS LacZ M13mp18 (7.25kb)质粒的稳定性质粒稳定性的检测方法：质粒稳定性的检测方法：100%一定代期或时间一定代期或时间选择性培养基选择性培养基 非非选择性培养基选择性培养基 非非选择性培养基选择性培养基(M)选择性培养基选择性培养基(m)质粒丢失率质粒丢失率=(M-m)/M 100%质粒不稳定性的分类分离不稳定性
35、分离不稳定性(segregational instability)：质粒在细胞培养过程整个质粒的丢失质粒在细胞培养过程整个质粒的丢失结构不稳定性结构不稳定性(structural instability)：重组质粒外源重组质粒外源DNA的丢失或发生缺失、插的丢失或发生缺失、插入、重排等入、重排等分离不稳定的影响因素与改善途径影响因素影响因素载体类型载体类型克隆克隆DNA的来源的来源质粒大小质粒大小质粒拷贝数质粒拷贝数分配功能分配功能温度温度改善途径改善途径选择恰当质粒选择恰当质粒确定适宜的克隆基因来源确定适宜的克隆基因来源限制插入片断大小限制插入片断大小用高拷贝数质粒用高拷贝数质粒引入稳定功能
36、或编码必需产引入稳定功能或编码必需产物的基因物的基因结构不稳定的影响因素与改善途径影响因素影响因素强启动子的存在，产物过量强启动子的存在，产物过量可能影响质粒的复制等功能可能影响质粒的复制等功能DNA复制时经过单链为中介，复制时经过单链为中介，引起分子内重排引起分子内重排DNA重复序列在复制时引起重复序列在复制时引起缺失缺失改善途径改善途径用低拷贝数质粒或染色体插用低拷贝数质粒或染色体插入载体入载体用热诱导启动子，时间控制用热诱导启动子，时间控制基因表达基因表达引入使单链引入使单链DNA高效转化为高效转化为双链双链DNA的序列的序列除去引起缺失作用的序列除去引起缺失作用的序列期中思考题 请各列举1个可应用微生物来解决的实际问题和不可应用微生物来解决的实际问题，并简单说明理由。
