1、第第 六六 章章Cncnc-micro测定微生物生长繁殖的方法微生物的生长规律影响微生物生长的主要环境因素微生物培养法概论有害微生物的控制内容提要 测生长量计繁殖数测定生长繁殖的方法测定生长繁殖的方法Cncnc-microNoImage微生物的纯培养纯培养纯培养的分离方法的分离方法 稀释倒平板法 划线法 选择培养基分离法 单细胞挑取法 Viable cell count1.dilute sample1 ml9 ml10 100 1000 104 105 106 107cell no/ml2.plate out 0.1 ml Inoculating an agar plate to obtain
2、 single coloniesMixed culturePure cultureMixed cultureOral swabSwab from sole of shoeEach colony was examined microscopically选择培养基分离法1.dilute sample1 ml9 ml10 100 1000 104 105 106 107牛肉膏培养基牛肉膏培养基土豆培养基土豆培养基高氏培养基高氏培养基含N量法DNA/RNA法叶绿素法菌体内重要组成测定法测生长量(直接法)称重量法测体积法N6.25=PrCncnc-microNoImage比 浊 法生理指标法测生长量(间
3、接法)计繁殖数比例计数法血球计数板法液体稀释法平板菌落计数法滤膜培养法各种型号的全自动血球计数仪微生物的连续培养微生物的生长规律微生物的个体生长和同步生长Cncnc-microNoImage单细胞微生物的典型生长曲线微生物的高密度培养离心法抑制合成法获得同步生长(synchronous growth)的方法：诱导法选择法过滤法同步培养(synchronous culture)Cncnc-microNoImage使培养基中细菌同时分裂，处于相同的生长阶段叫同步生长。生长曲线(growth curve)描述细菌生长规律总菌数活菌数培养时间.指数期.稳定期.衰亡期.延滞期细菌数目（个/ml）对数缩短
4、延滞期的意义和方法延滞期(lag phase)出现原因本期特点影响本期限长短因素Cncnc-microNoImage延滞期出现原因 把细菌接种到新鲜的培养基中培养时，并不立即进行分裂繁殖，细菌增殖数为，这时需要合成多种酶，辅酶和某些中间代谢产物，要经过一个调整和适应过程。Cncnc-micro延滞期特点生长速率常数等于零菌体粗大 代谢活力强对不良条件抵抗能力降低含量增加Cncnc-microNoImage影响延滞期限长短因素接种龄接种量培养基成分Cncnc-microNoImage缩短延滞期的意义和方法可以缩短生产周期，提高设备利用率。接种对数生长期的菌种，采用最适菌龄 加大接种量用与培养菌种
5、相同组成分的培养基Cncnc-microNoImage指数期(对数期)(exponential phase)特点该期的细菌生产中多被用做种子和科学试验材料 活菌数和总菌数接近 酶系活跃，代谢旺盛。生长速率最大，generation time最短。细胞的化学组成及形态，生理特性比较一致Cncnc-microNoImagex2x1t2t1培养时间Lg 细胞数/mlt2 -t13.322(lgx2-lgx1)生长速率常数R=t2 -t13.322(lgx2-lgx1)代时G=指数期生长的数学模型繁殖代数 n=3.322(lgx2-lgx1)影响指数期的因素菌种营养成分营养物浓度培养温度Cncnc-m
6、icroNoImage稳定期(stationary phase)出现原因 营养的消耗有害代谢产物积累PH值EH值等理化条件不适出现原因Cncnc-microNoImage营养物比例失调稳定期特点活菌数保持相对稳定，总菌数达最高水平。细菌代谢物积累达到最高峰。芽孢杆菌这时开始形成芽孢。这是生产收获时期。Cncnc-microNoImage衰亡期(decline phase/death phase)特点细菌死亡数大于增殖数,活菌数明显减少,群体衰落 细胞出现多形态,大小不等的 畸形,变成衰退型 细胞死亡,出现自溶现象。Cncnc-microNoImage连续培养连续培养(continuous cu
7、lture)(open culture)(continuous culture)(open culture)将微生物置于一定容积的培养基中培养，最后一次收获，叫分批培养，将微生物放在恒定的容积的流动系统中培养称为连续培养。优点：缩短发酵周期；便于自动控制；产物质优点：缩短发酵周期；便于自动控制；产物质 要要 量均一量均一 缺点：菌种易退化；易染杂菌缺点：菌种易退化；易染杂菌Cncnc-microNoImage微生物的高密度培养 （high cell-density culture,HCDC）指微生物在液体培养基中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术。现代高密度培养技术主要是
8、用于基因工程菌生产多肽类药物。选取最佳培养基成分和各成分含量补料提高溶解氧的浓度防止有害代谢产物的生成 影响微生物生长的主要环境因素NoImageCncnc-microNoImage温度PH氧气温度 生长速度温度停此生长致死最低最高最适嗜冷微生物（低温微生物）中温微生物嗜热微生物（高温微生物）低温对微生物的影响 嗜冷微生物（低温微生物）系在低温下仍能起催化作用 细胞膜含较多的不饱合脂肪酸在低温下仍具有通透性。上下班嗜冷机制：Cncnc-microNoImage嗜热微生物的嗜热机制细胞内的具强抗热性 产生的多胺，热亚胺和高温精胺物质对蛋白质等组织结构具有保护作用。一一一一一口口口核酸也具有热稳定
9、性的保护结构。细胞膜含有较多的饱和脂肪酸和直链脂肪酸，使膜具有稳定性。上 低温对微生物的影响代谢降低 生长繁殖停滞 仍然存活 常在低温下对菌种和食品保藏。Cncnc-microNoImagePH 影响细胞膜透性与稳定性 影响物质溶解度 影响细胞表面电荷分布 因此影响微生物生长、繁殖，发育。各类微生物能够生长的PH值较宽，但细胞内部PH值却接近中性。Cncnc-microNoImage微生物的活动也能改变环境中的PH值嗜酸性微生物嗜碱性微生物耐酸及耐碱微生物根据氢离子浓度对微生物分类 Cncnc-microNoImage氧气氧气专性好氧菌（obligate or strict aerobes）兼
10、性厌氧菌（facultative anaerobes）NoImageCncnc-microNoImage耐氧菌（aerotolerant anaerobes）厌氧菌（anaerobes）微好氧菌（microaerophilic bacteria）超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶（SODSOD）和）和过氧化氢酶过氧化氢酶 （Catalase）超氧化物歧化酶（超氧化物歧化酶（SODSOD）功能：使好氧菌免受超氧化物阴离子自由基的毒害2H2O2 _Catalase_ 2H2O+O2过氧化氢酶（过氧化氢酶（Catalase）厌氧菌（anaerobes）将环境中氧吸掉；抽真空；深层培养氧对其有毒能量来源于发
11、酵无氧呼吸环式光合磷酸化或甲烷发酵O2.-超氧阴离子自由基 普遍存在H2O+1/2O2 过氧化氢酶（好氧菌）2H2O过氧化氢酶（耐氧菌）NADH2NADO2.+2H+H2O2+O2 -SOD（好氧菌及耐氧菌）1 1 1 细胞内缺泛SOD、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶A.+B.A:B 共价结合均裂固体培养法液体培养法好氧菌的固体培养厌氧菌的固体培养好氧菌的液体培养厌氧菌的液体培养试管培养三角瓶（摇瓶）台式发酵罐高层琼脂柱厌氧培养皿Hungate rool-tube technique厌氧罐厌氧手套箱微生物培养法实验室培养法生产实践中的培养微生物装置固体培养法液体培养法好氧菌-曲法培养 厌氧菌-堆积
12、培养发酵罐（Fermenter）.Brewer 皿.高层琼脂柱亨盖特技术 厌氧罐anaerobic jarAnaerobic Glove Box厌氧菌的培养Different culture methodsLiquid CultureBatch culture Batch&Continuous culture10 ml20 ml-1 L1 L-1000LFermentor挂曲小曲红曲近代人工踏制大曲近代人工踏制大曲A whole process of DA-QU prepationfermenterfermenter 有害微生物的控制Cncnc-microNoImage几个基本概念物理灭菌因素
13、的代表高温化学杀菌剂、消毒剂和治疗剂消毒消毒(disinfection)(disinfection)：杀死或消除物体上的病原微生：杀死或消除物体上的病原微生 物的方法物的方法灭菌（灭菌（sterilitionsterilition）：杀死物体上全部微生物的方法）：杀死物体上全部微生物的方法防腐防腐(antisepsis)(antisepsis)：用理化方法防止抑制微生物生长：用理化方法防止抑制微生物生长 的方法的方法几个基本概念几个基本概念化疗化疗(chemotherapy)(chemotherapy)：利用对病源菌具有高度毒力而：利用对病源菌具有高度毒力而 对宿主基本无毒的化学物质来抑制对宿
14、主基本无毒的化学物质来抑制 宿主体内病源微生物的生长繁殖宿主体内病源微生物的生长繁殖 高温灭菌辐射作用高渗作用干燥超声波Cncnc-microNoImage控制微生物的物理因素高温灭菌高温灭菌多数细菌，酵母菌和霉菌的营养细胞和病毒在50-65 10 min可以致死。F 一般噬菌体6580 致死，放线菌霉菌的孢子比营养细胞抗热性强，7680 10min可以杀死 B 细菌芽孢，在100 下20min才能致死，嗜热脂肪芽孢杆菌可在80 条件下生活，在120，12min才能杀死，BBBBBBBBBBB 同种微生物老龄菌比幼菌耐热。Cncnc-microNoImage高温灭菌高温灭菌干热灭菌(dry h
15、eat sterilization)湿热灭菌(mosist heat sterilization)焚烧灭菌法：常用与废弃物动物尸体等处理。烘烤灭菌法；实验室用干燥箱烘烤接种工具。Cncnc-microNoImage湿热灭菌(mosist heat sterilization)煮沸灭菌法（煮沸消毒法）高压蒸汽灭菌法间歇灭菌法巴斯德消毒法：（巴氏消毒法）该法比干热灭菌效果好，因为蛋白质在有水的情况下容易凝固，如含水50，蛋白质凝固温度为56；含水蛋白质凝固温度为160-170Cncnc-microNoImage煮沸灭菌法（煮沸消毒法）物品在水中煮沸 15min，可杀死所有营养细胞和一部分芽孢。在水
16、中加入的 a2CO3或的碳酸效果更好。此法适合注射器和解剖用具的消毒。Cncnc-microNoImage高压蒸汽灭菌(normal autoclving)是湿热灭中最好方法，通常在1.05kg/cm2,的压力下面（此时温度121）处理1530min。要排冷，否则会形成假压，虽然压力达到要求，温度却达不到相应高度，而影响灭菌效果。间歇灭菌法(fractional sterilization)是用常压蒸汽反复几次进行灭菌的方法。Cncnc-microNoImage主要用于不宜高压灭菌的培养基，不耐热的药物和营养物等方法是将待灭菌物品置于蒸锅内加热到沸腾维持15-30min杀死营养细胞，取出冷却后
17、在37恒温培养24小时，使芽孢萌发，再用此法灭菌，反复三次，即可达到灭菌目的。巴氏消毒法(pasteurization)是食品（牛奶）酿造（啤酒）工业中常用的方法。Cncnc-microNoImage具体做法是61.762.8处理30min或71.6度处理15min，这样即可杀死病原微生物。又不致损坏营养，可保留食品饮料原有用味。根据结核杆菌在62下15min被致死。低温维持法;高温瞬时灭菌辐射 可见光紫外线（非电离辐射）Cncnc-microNoImageX射线与r射线 紫外线 O紫外线（非电离辐射）杀菌机制：诱导核酸形成胸腺嘧啶二聚体，从而干扰GGGGGGGG了核酸的复制H Cncnc-m
18、icroNoImage各种微生物对紫外线抗性 干细胞强于湿细胞芽孢，孢子强于营养细胞多倍体 二倍体 单倍体Cncnc-microNoImageX X射线与射线与r r射线射线直接学说 间接学说 r r射线是放射性元素Co60发射出的高能射线，F 具强穿透能力，500干伦琴剂量用于诱变育种，10万伦琴以上具杀菌作用。G Cncnc-microNoImageCncnc-microNoImage高渗作用等渗溶液对微生物生长有利细菌处于低渗液中会吸水膨胀乃至破裂细胞处于高渗液中会脱水引起质壁分离导致死亡。J Cncnc-microNoImage控制微生物的化学物质(因素)表面消毒剂表面消毒剂抗代谢物抗
19、生素化学治疗剂溶液状态气体状态生物药物素酸和碱 重金属极其盐类有机化合物 氧化剂 卤素 染色剂 表面活性剂 Cncnc-microNoImage表面消毒剂(surface disinfactant)酸和碱酸和碱 Cncnc-microNoImage 前面讲过微生物细胞中的DNA，RNA，CL，Pr，E只有在中性条件下才能体现活性，因此强酸碱具杀菌作用。医院病房常用乙酸消毒。重金属极其盐类是杀菌剂和防腐剂，作用最强的是Hg,Ag,Cu,作用机理：使蛋白质变性，使酶失活。（与E的SH结合。）00202Hgcl2（升汞）溶液对大多数细菌有致死作用。CuSO4对真菌、藻类有强杀伤力，波尔多（CuSO4
20、碳）防植物病害。另外还有砷，铋、锑的化合物是治疗梅毒的特效药。011 AgNO3 可消毒皮肤，1浓度新生儿点眼预防眼炎Cncnc-microNoImage有机化合物有机化合物醇、醛、酚是常用的杀菌剂。杀菌机制 损伤CW 使蛋白质变性（细胞膜，E失活）抑制脱氢酶，氧化酶活性。NoImageCncnc-microNoImage有机化合物有机化合物甲醛：纯甲醛为气体，3740水液为福尔马林。醇是脱水剂蛋白质变性剂,70乙醇杀菌效果最好。酚：35的石碳酸溶液几分钟即可致死细菌甲酚杀菌力最强，煤酚皂液（来苏尔）为甲酚和肥皂的混合液。Cncnc-microNoImage氧化剂氧化剂K2MnO4使菌体蛋白质
21、氧化，使酶失活。77777 013浓度可用于皮肤，果品、餐具、消毒。H2O2清洗伤口。Cncnc-microNoImage酪AA+I2二碘酪氨酸 卤素 碘杀菌力强，37碘溶于7083的乙醇中成碘酒。氯及氯化物常用于水及食品消毒与水结合放出原子氧（O）用于消毒。上下氯，碘是常用的消毒剂氯，碘是常用的消毒剂Cncnc-microNoImage染色剂干扰菌体氧化还原电位 阻碍芽孢的形成。NoImageCncnc-microNoImage表面活性剂具有降低表面张力效应的物质叫表面活性剂。常用的有新吉尔灭等，去污剂，肥皂等。一落表面张力降低可抑菌或杀菌。五彩缤纷 Cncnc-microNoImage抗代
22、谢物(antimetabolite)有些化合物在结构上与生物体所必需的代谢物很相似，以至可以和特定的酶结合，从而阻碍了酶的功 能。干扰代谢的正常代谢。这些物质称为抗代谢物。NoImageCncnc-microNoImage叶酸 磺胺类药物 氨基酸 5甲基色氨酸 吡哆醇 异烟肼 嘌呤 6巯基嘌呤抗代谢物代谢物二氢蝶啶二氢蝶啶二氢蝶酸二氢蝶酸二氢叶酸二氢叶酸四氢叶酸四氢叶酸核核 酸酸氨基酸氨基酸前前 体体 PABA酶酶酶酶酶酶GluTMPCOOHH2NNH2SO2RCOOHH2NNH2SO2R磺胺药(sulphonamides,sulfa drugs)抑菌机理 TMP:三甲基苄二氨嘧啶 (磺胺增效
23、剂)选择素力是由微生物在代谢过程中产生（有的可人工合成）具 有一定浓度下抑制或杀死其他微生物的有机化合物。F 每种抗生素都有一定的杀菌范围，称为抗菌谱。G 抗生素的诞生 神奇的抗生素 抗药性抗生素(antibiotic)抗生素的诞生 1928年A.Fleming发现青霉素1940弗罗里提纯出青霉素各种抗生素被相继发现并应用人工合成半合成抗生素被相继开发出来 青霉素（penicillin）英国科学家A.Fleming爵士与弗莱明共同获得1945年诺贝尔生理学和医学奖.1940提纯出青霉素澳大利亚病理学家霍华德.弗罗里人工合成半合成抗生素被相继开发出来 6-氨基青霉烷酸神奇 的抗生素 抑制细胞壁的
24、形成影响细胞膜的功能干扰蛋白质合成抑制核酸复制和固醇结合影响细胞膜透性作用于呼吸链影响能量利用氨苄青霉素（ampicillin）和蛋白结合影响膜屏蔽作用白点是强度各异的抗生素，最底下的青霉素完全没有黑环，显示它对链球菌已毫无作用 抗药性(antibiotic resistance)菌体内产生了钝化 或分解药物的酶F 改变细胞膜的透性而导致抗药性细胞内被药物作用的部位发生了改变，目前典型的例子是核糖体发生了改变。J 抗生素 核糖体结合 蛋白质不能合成救护途径泵出机制第一次用药剂量要足 避免在一个时期或长期多次使用同种抗生素 不同抗生素（或其他药物）混合使用 对现有抗生素改造 筛选新抗生素 可怕的抗药性(antibiotic resistance)Cncnc-micro生物药物素(biopharmaceutin)具有多种生理活性的比抗生素疗效更为广泛的微生物次生代谢产物Cncnc-microNoImage酶抑制剂免疫调节剂受体拮抗剂抗氧化剂.
