1、第四章第四章 蛋白质的共价结构蛋白质的共价结构一、蛋白质通论一、蛋白质通论二、肽二、肽三、蛋白质一级结构的测定三、蛋白质一级结构的测定四、蛋白质的氨基酸序列与生物功能四、蛋白质的氨基酸序列与生物功能五、肽与蛋白质的人工合成五、肽与蛋白质的人工合成一、蛋白质通论一、蛋白质通论蛋白质蛋白质(Protein)(Protein)是生物体的基本组成成份。在人体内蛋白是生物体的基本组成成份。在人体内蛋白质的含量很多，约占人体固体成分的质的含量很多，约占人体固体成分的45%45%，它的分布很广，它的分布很广，几乎所有的器官组织都含蛋白质，并且它又与所有的生命活几乎所有的器官组织都含蛋白质，并且它又与所有的生
2、命活动密切联系。动密切联系。机体新陈代谢过程中的一系列化学反应几乎都依赖于生物催化剂酶机体新陈代谢过程中的一系列化学反应几乎都依赖于生物催化剂酶的作用，而酶的本质就是蛋白质；调节物质代谢的激素有许多也是蛋的作用，而酶的本质就是蛋白质；调节物质代谢的激素有许多也是蛋白质或它的衍生物；其它诸如肌肉的收缩，血液的凝固，免疫功能，白质或它的衍生物；其它诸如肌肉的收缩，血液的凝固，免疫功能，组织修复以及生长、繁殖等主要功能无一不与蛋白质相关。近代分子组织修复以及生长、繁殖等主要功能无一不与蛋白质相关。近代分子生物学的研究表明，蛋白质在遗传信息的控制、细胞膜的通透性、神生物学的研究表明，蛋白质在遗传信息的
3、控制、细胞膜的通透性、神经冲动的发生和传导以及高等动物的记忆等方面都起着重要的作用。经冲动的发生和传导以及高等动物的记忆等方面都起着重要的作用。（一）蛋白质的化学组成和分类（一）蛋白质的化学组成和分类单纯蛋白质的元素组成为单纯蛋白质的元素组成为C 50C 5055%55%、H 6%H 6%7%7%、O 19%O 19%24%24%、N 13%N 13%19%19%，除此之外还有，除此之外还有S 0S 04%4%。有的蛋白质含有。有的蛋白质含有P P、I I。少数含少数含FeFe、CuCu、ZnZn、MnMn、CoCo、MoMo等金属元素。等金属元素。各种蛋白质的含氮量很接近，平均为各种蛋白质的
4、含氮量很接近，平均为16%16%。由于体内组织的主。由于体内组织的主要含氮物是蛋白质，因此，只要测定生物样品中的氮含量，要含氮物是蛋白质，因此，只要测定生物样品中的氮含量，就可以按下式推算出蛋白质大致含量：就可以按下式推算出蛋白质大致含量：蛋白质含量蛋白氮蛋白质含量蛋白氮6.256.25 （凯氏（凯氏(Kjedahl)(Kjedahl)定氮法的计算基础）定氮法的计算基础）单纯蛋白质（单纯蛋白质（simple protein)simple protein)：仅由氨基酸组成，不含其：仅由氨基酸组成，不含其它化学成分。它化学成分。缀合蛋白质缀合蛋白质(conjugated protein)(conj
5、ugated protein)：除含有氨基酸外的各种：除含有氨基酸外的各种化学成分作为其结构的一部分。非蛋白质部分称为化学成分作为其结构的一部分。非蛋白质部分称为辅基辅基(prosthetic group)(prosthetic group)或或配体配体(ligand)(ligand)。单纯蛋白质单纯蛋白质 （按溶解度分类）（按溶解度分类）清蛋白清蛋白球蛋白球蛋白谷蛋白谷蛋白谷醇溶蛋白谷醇溶蛋白组蛋白组蛋白鱼精蛋白鱼精蛋白硬蛋白硬蛋白 缀合蛋白质缀合蛋白质 （按非氨基酸（按非氨基酸 成分分类）成分分类）糖蛋白糖蛋白脂蛋白脂蛋白核蛋白核蛋白磷蛋白磷蛋白金属蛋白金属蛋白血红素蛋白血红素蛋白黄素蛋白
6、黄素蛋白单纯蛋白质分类单纯蛋白质分类结合蛋白质分类结合蛋白质分类 蛋白质蛋白质（按生物学功能分类）（按生物学功能分类）酶酶调节蛋白调节蛋白转运蛋白转运蛋白贮存蛋白贮存蛋白收缩和游动蛋白收缩和游动蛋白结构蛋白结构蛋白支架蛋白支架蛋白保护和开发蛋白保护和开发蛋白异常蛋白异常蛋白（二）蛋白质的形状和大小（二）蛋白质的形状和大小形状形状纤维状纤维状球状球状膜蛋白膜蛋白蛋白质的相对分子量从大约蛋白质的相对分子量从大约600060001 110106 6或更大一些。或更大一些。单体蛋白质单体蛋白质(monomeric(monomeric protein)protein)：仅由一条多肽链组成。：仅由一条多肽
7、链组成。其相对分子量除以其相对分子量除以110110估计氨基酸残基的数目。估计氨基酸残基的数目。寡聚蛋白质寡聚蛋白质(oligomeric(oligomeric protein)protein)：由两条或多条多肽链：由两条或多条多肽链组成。每条多肽链称为亚基组成。每条多肽链称为亚基(subunit)(subunit)。（三）蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次（三）蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次一级结构一级结构(primary structure)(primary structure)：多肽链的氨基酸序列。多肽链的氨基酸序列。二级结构二级结构(secondary structure)(secon
8、dary structure)：多肽链中主链原子的局多肽链中主链原子的局部空间排布即构象，不涉及侧链部分的构象。部空间排布即构象，不涉及侧链部分的构象。三级结构三级结构(tertiary structure)(tertiary structure)：蛋白质的多肽链在各种二蛋白质的多肽链在各种二级结构的基础上再进一步盘曲或折迭形成具有一定规律的三级结构的基础上再进一步盘曲或折迭形成具有一定规律的三维空间结构。维空间结构。四级结构四级结构(quarternary structure)(quarternary structure)：具有二条或二条以上具有二条或二条以上独立三级结构的多肽链组成的蛋白质
9、，其多肽链间通过次级独立三级结构的多肽链组成的蛋白质，其多肽链间通过次级键相互组合而形成的空间结构。键相互组合而形成的空间结构。四、蛋白质功能的多样性四、蛋白质功能的多样性 蛋白质的序列异构现象是蛋白质生物功能多样性和物种蛋白质的序列异构现象是蛋白质生物功能多样性和物种特异性的结构基础。特异性的结构基础。蛋白质的生物学功能：蛋白质的生物学功能：1.1.催化；催化；2.2.调节；调节；3.3.转运；转运；4.4.贮存；贮存；5.5.运动；运动；6.6.结构成分；结构成分；7.7.支架作用；支架作用；8.8.防御与进攻；防御与进攻；9.9.异常功能；异常功能；蛋白质（蛋白质（proteinprot
10、ein）是生活细胞内含量最丰富、功能最）是生活细胞内含量最丰富、功能最复杂的生物大分子，并参与了几乎所有的生命活动和生命过复杂的生物大分子，并参与了几乎所有的生命活动和生命过程。因此，研究蛋白质的结构与功能始终是生命科学最基本程。因此，研究蛋白质的结构与功能始终是生命科学最基本的命题。的命题。生物体最主要的特征是生命活动，而蛋白质是生命活动生物体最主要的特征是生命活动，而蛋白质是生命活动的体现者，具有以下主要功能：的体现者，具有以下主要功能：二、肽二、肽肽是氨基酸的线性聚合物，常称多肽链（肽是氨基酸的线性聚合物，常称多肽链（peptide chainpeptide chain）。）。蛋白质是由
11、一条或多条具有确定的氨基酸序列的多肽链构成蛋白质是由一条或多条具有确定的氨基酸序列的多肽链构成的大分子。的大分子。（一）肽和肽键的结构（一）肽和肽键的结构蛋白质分子中氨基酸连接的基本方式是肽键。蛋白质分子中氨基酸连接的基本方式是肽键。CCNCCNCCNCCNCCH2CHCH2CH2CH2COO-OHCO2HCH2CONH2OHCH3H3N+OOOOHHHHHHHHHSerValTyrAspGlnCH3N-端C-端肽键肽链写法肽链写法：游离：游离-氨基在左，游离氨基在左，游离-羧基在右，氨基酸之间用羧基在右，氨基酸之间用“-”表示肽键。表示肽键。H2N-丝氨酸丝氨酸-缬氨酸缬氨酸-酪氨酸酪氨酸-
12、天冬氨酸天冬氨酸-谷氨酰氨谷氨酰氨-COOHSer-Val-Tyr-Asp-Gln（S-V-Y-D-Q）由于羰基碳由于羰基碳-氧双键的靠拢，允许存在共振结构（氧双键的靠拢，允许存在共振结构（resonance structureresonance structure），），碳与氮之间的肽键有部分双键性质，由碳与氮之间的肽键有部分双键性质，由CO-NHCO-NH构成的肽单元呈现相对的刚性构成的肽单元呈现相对的刚性和平面化，肽键中的和平面化，肽键中的4 4个原子和它相邻的两个个原子和它相邻的两个-碳原子多处于同一个平面碳原子多处于同一个平面上。上。多肽链可以看成由多肽链可以看成由C C串联起来的无
13、数个酰胺平面组成串联起来的无数个酰胺平面组成共振产生的重要结果：共振产生的重要结果：限制绕肽键的自由旋转限制绕肽键的自由旋转 形成酰胺平面形成酰胺平面 产生键的平均化产生键的平均化 肽键呈反式构型肽键呈反式构型sp2sp2sp2sp3共振杂化体共振杂化体（二）肽的物理和化学性质（二）肽的物理和化学性质短肽的晶体是离子晶格，在水溶液中以偶极离子存在。在短肽的晶体是离子晶格，在水溶液中以偶极离子存在。在pH0-14pH0-14范围内，肽键中的亚氨基不能解离。范围内，肽键中的亚氨基不能解离。小肽的滴定曲线和氨基酸的滴定曲线很相似。小肽的滴定曲线和氨基酸的滴定曲线很相似。肽的化学反应也和氨基酸一样，游
14、离的肽的化学反应也和氨基酸一样，游离的氨基、氨基、羧羧基和基和R R基可以发生与氨基酸中相应的基团类似的反应。双缩基可以发生与氨基酸中相应的基团类似的反应。双缩脲反应是肽和蛋白质所特有的，而为氨基酸所没有的一个脲反应是肽和蛋白质所特有的，而为氨基酸所没有的一个颜色反应。颜色反应。一般短肽的旋光度约等于组成该肽中各个氨基酸的旋光度一般短肽的旋光度约等于组成该肽中各个氨基酸的旋光度的总和，但较长的肽或蛋白质的旋光度则不能这样简单相的总和，但较长的肽或蛋白质的旋光度则不能这样简单相加。加。（三）天然存在的活性肽（三）天然存在的活性肽生物体内游离存在着很多活性肽，具有各种特殊的生物生物体内游离存在着很
15、多活性肽，具有各种特殊的生物学功能。学功能。激素：催产素、加压素、舒缓激肽激素：催产素、加压素、舒缓激肽抗生素：短杆菌肽、多粘菌素抗生素：短杆菌肽、多粘菌素E E、放线菌素、放线菌素D D蕈的剧毒毒素：蕈的剧毒毒素：鹅膏蕈碱鹅膏蕈碱还原型谷胱甘肽还原型谷胱甘肽鹅肌肽、肌肽鹅肌肽、肌肽天然肽中含有蛋白质中不存在的天然肽中含有蛋白质中不存在的-肽键、肽键、丙氨酸和丙氨酸和D D型氨基酸。型氨基酸。三、蛋白质一级结构的测定三、蛋白质一级结构的测定蛋白质的一级结构指多肽链中的氨基酸序列。蛋白质的一级结构指多肽链中的氨基酸序列。（一）蛋白质测序的策略（一）蛋白质测序的策略 (1)(1)测定蛋白质分子中多
16、肽链的数目。测定蛋白质分子中多肽链的数目。(2)(2)拆分蛋白质分子的多肽链。拆分蛋白质分子的多肽链。(3)(3)测定多肽链的氨基酸组成。测定多肽链的氨基酸组成。(4)(4)分析多肽链的分析多肽链的N N末端和末端和C C末端残基。末端残基。(5)(5)断裂多肽链内的二硫键。断裂多肽链内的二硫键。(6)(6)多肽链断裂成肽段。多肽链断裂成肽段。(7)(7)测定各个肽段的氨基酸顺序。测定各个肽段的氨基酸顺序。(8)(8)确定肽段在多肽链中的次序。确定肽段在多肽链中的次序。(9)(9)确定原多肽链中二硫键的位置。确定原多肽链中二硫键的位置。将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序将肽段顺序进行叠联以确定
17、完整的顺序 将肽段分离并测出顺序将肽段分离并测出顺序专一性裂解专一性裂解末端氨基酸测定末端氨基酸测定二硫键拆开二硫键拆开纯蛋白质纯蛋白质（二）（二）N-N-末端和末端和C-C-末端氨基酸残基的鉴定末端氨基酸残基的鉴定1.N-1.N-末端分析末端分析（1 1）DNFBDNFB法；法；（2 2）DNSDNS法法（3 3）PITCPITC法法（4 4）氨肽酶法）氨肽酶法2.C-2.C-末端分析末端分析（1 1）肼解法；）肼解法；（2 2）还原法）还原法（3 3）羧肽酶法）羧肽酶法 SangerSanger法。法。2,4-2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链肽链N-
18、N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNPDNP）。）。在酸性条件下水解，得到黄色在酸性条件下水解，得到黄色DNP-DNP-氨基酸。该产物氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-DNP-氨基酸可以用色氨基酸可以用色谱法进行鉴定。谱法进行鉴定。O2NFNO2+H2NCHCROHNCHCROO2NNO2H+H2OO2NNO2HNCHCROOH+氨基酸DNFBN-端氨基酸DNP衍生物DNP-氨基酸在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-N-端氨端氨基酸的游离氨基作用
19、，得到丹磺酰氨基酸。基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰氨基酸。此法的优点是丹磺酰此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到可以达到1 1 1010-9-9molmol。N(CH3)2SO2ClH2NCHCROHNCHCROSO2N(CH3)2+水解N(CH3)2SO2HNCHCROOH+氨基酸丹磺酰氯多肽N-端丹磺酰N-端氨基酸丹磺酰氨基酸 氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的链的N-N-端逐个的向里水解。端逐个的向里水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数
20、量，按反应时间和出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的知道蛋白质的N-N-末端残基顺序。末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为以亮氨酸残基为N-N-末端的肽键速度最大。末端的肽键速度最大。此法是多肽链C-C-端氨基酸分析法端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。H2NCH CROHNCH CROORnCCH
21、HNOHn-1N-端氨基酸 C-端氨基酸ORnCCHH2NOHH2NCH CRONHNH2+H+NH2NH2氨基酸酰肼C-端氨基酸 羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-C-端逐个的水解端逐个的水解AAAA。根据不同的反应时间测。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的而知道蛋白质的C-C-末端残基顺序。末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：目前常用的羧肽酶有四种：A,B,CA,B,C和和Y Y；A A和和B B来自胰脏；来自胰脏；C C来自柑桔叶；来自柑桔叶；Y Y来自面包酵母。来
22、自面包酵母。羧肽酶羧肽酶A A能水解除能水解除Pro,ArgPro,Arg和和LysLys以外的所有以外的所有C-C-末端氨基酸残基；末端氨基酸残基；B B只能水解只能水解ArgArg和和LysLys为为C-C-末末端残基的肽键。端残基的肽键。（三）二硫桥的断裂（三）二硫桥的断裂断裂二硫桥的主要方法是过甲酸氧化法和巯基化合物还原断裂二硫桥的主要方法是过甲酸氧化法和巯基化合物还原法。法。s ss sHCOOOHHCOOOHSOSO3 3H HSOSO3 3H HS SS SS SS SS SS S胰岛素胰岛素HO-CHHO-CH2 2-CH-CH2 2-SH-SHSHSHSHSHSHSHSHSH
23、SHSHSHSHSCHSCH2 2C00HC00H SCHSCH2 2C00HC00HSCHSCH2 2C00HC00HSCHSCH2 2C00HC00HSCHSCH2 2C00HC00HSCHSCH2 2C00HC00HICHICH2 2COOHCOOH作用：作用：这些反应可用于巯基的保护这些反应可用于巯基的保护。-OOCCHCH2SHNH3+CH2OCClO-OOCCHCH2SNH3+OCCH2OCH2-OOCCHCH2SNH3+CH2ClICH2CNH2OCH2CNH2O-OOCCHCH2SNH3+（四）氨基酸组（四）氨基酸组成的分析成的分析用于蛋白的氨基酸用于蛋白的氨基酸组成测定的水解
24、方组成测定的水解方法主要是酸水解，法主要是酸水解，同时辅以碱水解。同时辅以碱水解。氨基酸分析仪图谱氨基酸分析仪图谱（五）多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离（五）多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化纯化1.1.酶裂解法酶裂解法胰蛋白酶胰蛋白酶(trypsin)(trypsin)这是最常这是最常用的蛋白水解酶，专一性强，只断用的蛋白水解酶，专一性强，只断裂赖氨酸或精氨酸的羧基参与形成裂赖氨酸或精氨酸的羧基参与形成的肽键。得到的是以的肽键。得到的是以ArgArg或或LysLys为为C-C-末端残基的肽段，肽段数目等于多末端残基的肽段，肽段数目等于多肽链中肽链中ArgArg和和LysLys总数加总数
25、加1 1。为了减少胰蛋白酶的作用位点，可以通过化学修饰将其侧链为了减少胰蛋白酶的作用位点，可以通过化学修饰将其侧链基因保护起来。用马来酸酐可以保护基因保护起来。用马来酸酐可以保护LysLys残基侧链上的残基侧链上的NHNH2 2，胰蛋白酶就不会水解，胰蛋白酶就不会水解LysLys竣基参与形成的肽键，只能断竣基参与形成的肽键，只能断裂裂ArgArg羧基所形成的肽键；反之，如果用羧基所形成的肽键；反之，如果用1 1，2 2环己二酮修饰环己二酮修饰ArgArg的胍基，则胰蛋白面只能裂解的胍基，则胰蛋白面只能裂解LysLys羧基所形成的肽键。羧基所形成的肽键。如果想增加多肽链中胰蛋白酶的断裂点，可以用
26、丫丙啶处理如果想增加多肽链中胰蛋白酶的断裂点，可以用丫丙啶处理多肽链样品，这时多肽链样品，这时CysCys残基侧链被修饰成类似残基侧链被修饰成类似LysLys的侧链，也的侧链，也具有具有NHNH2 2。这样胰蛋白酶便能断裂。这样胰蛋白酶便能断裂CysCys羧基端的肽键。羧基端的肽键。NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1R R1 1=Lys=Lys和和ArgArg侧链（专一性较强，水解速度快）。侧链（专一性较强，水解速度快）。R R2 2=Pro=Pro 水水解受抑。解受抑。糜蛋白酶糜蛋白酶(chymotrypin)(chymotrypin)或胰凝乳蛋白酶或胰凝乳蛋白
27、酶(C Chymotrypsin)hymotrypsin)：它断裂它断裂PhePhe、TrpTrp和和TyrTyr等疏水氨基酸的羧基参与形成的肽键。等疏水氨基酸的羧基参与形成的肽键。断裂键邻近的基团是碱性的，裂解能力增加；是酸性的，裂断裂键邻近的基团是碱性的，裂解能力增加；是酸性的，裂解能力将减弱。解能力将减弱。NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽链水解位点水解位点R R1 1=Phe,Trp,Tyr=Phe,Trp,Tyr时水解快时水解快;R;R1 1=LeuLeu，MetMet和和HisHis水解稍慢。水解稍慢。R R2 2=Pro=Pro 水解受抑。水解受抑
28、。NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽链水解位点水解位点胃蛋白酶胃蛋白酶(pepsin)(pepsin)它要求被断裂键两侧的残基都是疏水它要求被断裂键两侧的残基都是疏水性氨基酸，如性氨基酸，如Phe-PhePhe-Phe。此外与糜蛋白酶不同的是酶作用的。此外与糜蛋白酶不同的是酶作用的最适最适pHpH，前者是，前者是pH2pH2，后者是，后者是pH8-9pH8-9，由于二硫键在酸性条件，由于二硫键在酸性条件下稳定，因此确定二硫键位置时，常用胃蛋白酶来水解。下稳定，因此确定二硫键位置时，常用胃蛋白酶来水解。R R1 1和和R R2 2Phe,Trp,Tyr;LeuPh
29、e,Trp,Tyr;Leu以及以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。其它疏水性氨基酸水解速度较快。R R1 1=Pro=Pro 水解受抑。水解受抑。NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽链水解位点水解位点嗜热菌蛋白酶（嗜热菌蛋白酶（thermolysinthermolysin）:常用于断裂较短的多肽链。常用于断裂较短的多肽链。R R2 2=Phe,Trp,Tyr;Leu=Phe,Trp,Tyr;Leu，Ile,MetIle,Met以及其它疏水性强的氨以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。基酸水解速度较快。R R2 2=Pro=Pro或或Gly Gly 水解受抑。水解受抑
30、。R R1 1或或R R3 3=Pro =Pro 水解受抑。水解受抑。葡萄球菌蛋白酶（葡萄球菌蛋白酶（Staphylococcal protease)Staphylococcal protease)当裂解在当裂解在磷酸缓冲液磷酸缓冲液(pH7.8)(pH7.8)中进行的，它能在中进行的，它能在GluGlu残基和残基和AspAsp残基的残基的羧基侧断裂肽键。如果改用碳酸氢铵缓冲液羧基侧断裂肽键。如果改用碳酸氢铵缓冲液(pH7.8)(pH7.8)或醋酸或醋酸铵缓冲液铵缓冲液(pH4.0)(pH4.0)时，则只能断裂时，则只能断裂GluGlu残基的羧基侧肽键。残基的羧基侧肽键。梭菌蛋白酶（梭菌蛋白酶
31、（clostripainclostripain）专门裂解专门裂解ArgArg残基的羧基所形残基的羧基所形成的肽键。即使在成的肽键。即使在6mol/L6mol/L尿素中尿素中2020小时内仍具活力，这样对小时内仍具活力，这样对不溶性蛋白质的长时间裂解将是很有效的。不溶性蛋白质的长时间裂解将是很有效的。（Phe.Tyr.Trp）（Arg.Lys）（脂肪族）（脂肪族）胰凝乳胰凝乳蛋白酶蛋白酶胃蛋白酶胃蛋白酶弹性蛋白酶弹性蛋白酶羧肽酶羧肽酶胰蛋白酶胰蛋白酶氨肽酶氨肽酶羧肽酶羧肽酶（Phe.Trp）2.2.化学裂解法化学裂解法 溴化氰溴化氰只断裂由只断裂由MetMet残基的羧基参加形成的肽键。残基的羧基
32、参加形成的肽键。CH3S：CH2CH2CHNHCNHCHCOOR+BrC+NBr-CH3S+CH2CH2CHNHCNHCHCOORCNCH3SCN CH2CHNHCNHCHCOORCH2+H2O+CH2CHNHCOCH2OH3N+CHCOR高丝氨酸内酯羟胺羟胺能专一性地断裂能专一性地断裂Asn-GlyAsn-Gly之间的肽键。但专一性不之间的肽键。但专一性不很强，如很强，如Asn-LeuAsn-Leu及及Asn-AlaAsn-Ala键也能部分裂解。键也能部分裂解。肽段的分离提纯肽段的分离提纯 多肽链用上述方法断裂后，所得的肽段混多肽链用上述方法断裂后，所得的肽段混合物通常使用凝胶过滤、凝胶电泳
33、、离子交换纤维素和离子合物通常使用凝胶过滤、凝胶电泳、离子交换纤维素和离子交换萄聚糖柱层析、高效液相色谱、高效薄层层析等方法进交换萄聚糖柱层析、高效液相色谱、高效薄层层析等方法进行分离提纯。行分离提纯。1.Edman1.Edman化学降解化学降解（六）肽段氨基酸序列的测定（六）肽段氨基酸序列的测定2.2.酶降解法酶降解法 蛋 白 水 解 酶 中 有 一 类 是 肽 链 外 切 酶 或 称 外 肽 酶蛋 白 水 解 酶 中 有 一 类 是 肽 链 外 切 酶 或 称 外 肽 酶（exopeptidases)exopeptidases)，例如氨肽酶和羧肽酶，它们分别从肽链的，例如氨肽酶和羧肽酶，它
34、们分别从肽链的N N端和端和C C端逐个地向里切。因此，原则上只要能跟随酶水解的过端逐个地向里切。因此，原则上只要能跟随酶水解的过程分别定量测出释放的氨基酸，便能确定肽的顺序。然而这种程分别定量测出释放的氨基酸，便能确定肽的顺序。然而这种方法实际上有许多困难，局限性很大，它只能用来测定末端附方法实际上有许多困难，局限性很大，它只能用来测定末端附近很少几个残基的顺序。近很少几个残基的顺序。3.3.质谱法质谱法质谱法一次能测的氨基酸残基一般质谱法一次能测的氨基酸残基一般1010个左右，但质谱法具有个左右，但质谱法具有样品用量少，分析速度快的优点。样品用量少，分析速度快的优点。4.4.根据核苷酸序列
35、的推定法根据核苷酸序列的推定法推定的依据是推定的依据是“中心法则中心法则”。推定法仍需与直接的氨基酸序列分析相配合，如果没有必需推定法仍需与直接的氨基酸序列分析相配合，如果没有必需的部分氨基酸序列分析，就不可能找到正确的密码读框。的部分氨基酸序列分析，就不可能找到正确的密码读框。（七）肽段在多肽链中次序的决定（七）肽段在多肽链中次序的决定A A法水解得到四个小肽：法水解得到四个小肽：A A1 1 Ala-Phe Ala-Phe A A2 2 Gly-Lys-Asn-Tyr Gly-Lys-Asn-Tyr A A3 3 Arg-Tyr Arg-Tyr A A4 4 His-Val His-Val
36、B B法水解得到三个小肽：法水解得到三个小肽：B B1 1 Ala-Phe-Gly-Lys Ala-Phe-Gly-Lys B B2 2 Asn-Tyr-Arg Asn-Tyr-Arg B B3 3 Tyr-His-Val Tyr-His-Val重叠法：重叠法：Ala-Phe-Gly-LysAla-Phe-Gly-LysAsn-Tyr-ArgAsn-Tyr-ArgTyr-His-ValTyr-His-Val（八）二硫桥位置的确定（八）二硫桥位置的确定一般采用胃蛋白酶处理含有二硫键的多肽链一般采用胃蛋白酶处理含有二硫键的多肽链(切点多；酸性环境切点多；酸性环境下防止二硫键发生交换下防止二硫键发生
37、交换)。将所得的肽段利用将所得的肽段利用BrownBrown及及HartlayHartlay的对角线电泳技术进行分离。的对角线电泳技术进行分离。+-+-第二向第二向第一向第一向a ab bBrownBrown和和HartlayHartlay对角线电泳图解对角线电泳图解pH6.5pH6.5图中图中a a、b b两个斑点是由两个斑点是由一个二硫键断裂产生的一个二硫键断裂产生的肽段肽段（九）蛋白质序列数据库（九）蛋白质序列数据库由于测定克隆基因的核苷酸序列比测定蛋白质氨基酸的序由于测定克隆基因的核苷酸序列比测定蛋白质氨基酸的序列更快、更有效，现在大多数蛋白质序列是从核苷酸序列列更快、更有效，现在大多
38、数蛋白质序列是从核苷酸序列翻译成氨基酸序列。要确定一个新序列，研究者所作的第翻译成氨基酸序列。要确定一个新序列，研究者所作的第一件事就是将它与数据库中的其它已知的序列进行比较，一件事就是将它与数据库中的其它已知的序列进行比较，确定其中是否存在同源性。确定其中是否存在同源性。四、蛋白质的氨基酸序列四、蛋白质的氨基酸序列与生物功能与生物功能（一）同源蛋白质的物种差异与生物进化（一）同源蛋白质的物种差异与生物进化1.1.同源蛋白质同源蛋白质在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质称为在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质称为同源蛋同源蛋白质白质。同源蛋白质的氨基酸序列具有明显的相似性称为同源蛋白质
39、的氨基酸序列具有明显的相似性称为序列同源序列同源性性。同源蛋白质一般具有几乎相同长度的多肽链，它同源蛋白质一般具有几乎相同长度的多肽链，它们的氨基酸序列与那些提取它们的物种的亲缘关们的氨基酸序列与那些提取它们的物种的亲缘关系具有同一性。系具有同一性。14106100134323029271817675952514845413887848280706891GlyGlyPheCysGlyGlyGlyArgLysGlyCysLysPheHisProLeuGlyArgTyrAlaAsnTrpTyr707580LysLysLysProProTyrIleGlyThrMetAsnLeu血红素血红素细胞色素细
40、胞色素c c分子的空间结构分子的空间结构不变不变的的AAAA残基残基 35个不变的个不变的AA残基，是残基，是Cyt C 的生物功能所不的生物功能所不可缺少的。其中有的可能参加维持分子构象；有的可缺少的。其中有的可能参加维持分子构象；有的可能参与电子传递；有的可能参与可能参与电子传递；有的可能参与“识别识别”并结合并结合细胞色素还原酶和氧化酶。细胞色素还原酶和氧化酶。不同种属不同种属氨基酸残基的差异数目氨基酸残基的差异数目分歧时间分歧时间(百万年百万年)人人-猴猴150-60人人-马马1270-75人人-狗狗1070-75猪猪-牛牛-羊羊0马马-牛牛360-65哺乳类哺乳类-鸡鸡10-1528
41、0哺乳类哺乳类-猢猢17-21400脊椎动物脊椎动物-酵母酵母43-481,100细胞色素细胞色素C C分子中氨基酸残基的差异数目及分歧时间分子中氨基酸残基的差异数目及分歧时间 细胞色素细胞色素c c肽链中肽链中2727个位置的氨基酸残基对所有已测试的种个位置的氨基酸残基对所有已测试的种属都是相同的，表明这些残基是规定细胞色素属都是相同的，表明这些残基是规定细胞色素c c的生物活性的生物活性所必需。例如第所必需。例如第1414和第和第1717位置上的位置上的CysCys残基可能保证与辅基残基可能保证与辅基血红素连接的必要位置，第血红素连接的必要位置，第7070到到8080位置上的不变肽段可能是
42、位置上的不变肽段可能是细胞色素细胞色素c c与酶相结合的部分。肽链中的可变残基可能是一与酶相结合的部分。肽链中的可变残基可能是一些些“填充填充”或间隔的区域，氨基酸的变换不影响蛋白质的功或间隔的区域，氨基酸的变换不影响蛋白质的功能。能。在不同种属来源的细胞色素在不同种属来源的细胞色素c c中，可以变换的氨基酸残基数中，可以变换的氨基酸残基数目与这些种属在系统发生上的位置有密切关系，即在进化位目与这些种属在系统发生上的位置有密切关系，即在进化位置上相距愈远，则氨基酸顺序之间的差别愈大。细胞色素置上相距愈远，则氨基酸顺序之间的差别愈大。细胞色素c c的氨基鼓顺序分析资料已被用来核对各个物种之间的分
43、类学的氨基鼓顺序分析资料已被用来核对各个物种之间的分类学关系，以及绘制进化树关系，以及绘制进化树(evolutionary tree)(evolutionary tree)即系统发生树即系统发生树(phylogenetic tree)(phylogenetic tree)。根据进化树不仅可以研究从单细胞。根据进化树不仅可以研究从单细胞有机体到多细胞有机体的生物进化过程，而且可以粗略估计有机体到多细胞有机体的生物进化过程，而且可以粗略估计现存的各类种属生物的分歧现存的各类种属生物的分歧(divergence)(divergence)时间。时间。生物生物 与人不同的与人不同的AAAA数目数目黑猩猩
44、黑猩猩 0恒河猴恒河猴 1兔兔 9袋鼠袋鼠 10牛、猪、羊、狗牛、猪、羊、狗 11马马 12鸡、火鸡鸡、火鸡 13响尾蛇响尾蛇 14海龟海龟 15金枪鱼金枪鱼 21角饺角饺 23小蝇小蝇 25蛾蛾 31小麦小麦 35粗早链孢霉粗早链孢霉 43酵母酵母 44 根据细胞色素根据细胞色素 C的的顺序种属差异建立顺序种属差异建立起来的进化树起来的进化树圆圈代表进化中的圆圈代表进化中的分歧点，支干旁的分歧点，支干旁的数字是给定有机体数字是给定有机体谱系的细胞色素谱系的细胞色素c c与其祖先差异的残与其祖先差异的残基数基数（二）同源蛋白质具有共同的进化起源（二）同源蛋白质具有共同的进化起源1.1.氧合血红
45、素蛋白氧合血红素蛋白肌红蛋白、血红蛋白肌红蛋白、血红蛋白链和链和链是珠蛋白，它们有很链是珠蛋白，它们有很高的序列同源。这种同源关系表明随机突变一级结构方面高的序列同源。这种同源关系表明随机突变一级结构方面氨基酸取代和分歧或趋异事件的进化顺序。氨基酸取代和分歧或趋异事件的进化顺序。2.2.丝氨酸蛋白酶类丝氨酸蛋白酶类胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶显示足够的序列同胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶显示足够的序列同源性，它们是经过祖先丝氨酸蛋白酶基因的复制而来。源性，它们是经过祖先丝氨酸蛋白酶基因的复制而来。3.3.一些功能差异很大的蛋白质一些功能差异很大的蛋白质溶菌酶和溶菌酶和乳清蛋白的功能很
46、少相似，但它们的三级结构乳清蛋白的功能很少相似，但它们的三级结构却十分相似。根据它们的序列同源性可以推论出它们的进化却十分相似。根据它们的序列同源性可以推论出它们的进化关系关系具有共同的起源。具有共同的起源。（三）血液凝固与氨基酸序列的局部断裂（三）血液凝固与氨基酸序列的局部断裂在动物体内的某些生物化学过程中，蛋白质分子的部分肽在动物体内的某些生物化学过程中，蛋白质分子的部分肽链必须先按特定的方式断裂，然后才呈现生物活性。蛋白链必须先按特定的方式断裂，然后才呈现生物活性。蛋白质分子的这一特性具有它的重要生物学意义。它是在生物质分子的这一特性具有它的重要生物学意义。它是在生物进化过程中发展起来的
47、，是蛋白质分于的结构与功能具有进化过程中发展起来的，是蛋白质分于的结构与功能具有高度统一性的表现。高度统一性的表现。1.1.血液凝固的生物化学原理血液凝固的生物化学原理血液凝固是一系列复杂的生物化学过程。这一过程的主要血液凝固是一系列复杂的生物化学过程。这一过程的主要环节有二：一是血浆中的凝血酶原受到血浆和血小板中一环节有二：一是血浆中的凝血酶原受到血浆和血小板中一些因子的激活而形成凝血酶些因子的激活而形成凝血酶(thrombin)(thrombin)；二是血浆中的纤；二是血浆中的纤维蛋白原在凝血酶的激活下转变为不溶性纤维蛋白维蛋白原在凝血酶的激活下转变为不溶性纤维蛋白(fibrin)(fib
48、rin)网状结构，使血液变成凝胶。网状结构，使血液变成凝胶。凝血酶原是一种糖蛋白。在凝凝血酶原是一种糖蛋白。在凝血酶原致活物的催化下，凝血血酶原致活物的催化下，凝血酶 原 分 子 中 的 二 个 肽 键酶 原 分 子 中 的 二 个 肽 键(Arg274-Thr275(Arg274-Thr275和和Arg323-Arg323-Ile324Ile324）发生断裂，释放出分）发生断裂，释放出分子量力子量力3200032000的氨基末端片的氨基末端片段形成有活性的凝血酶。段形成有活性的凝血酶。凝血酶由二条肽链通过一个二凝血酶由二条肽链通过一个二硫键交联而成，一条肽键（硫键交联而成，一条肽键（A A链
49、链)含含4949个残基，另一条肽键个残基，另一条肽键含含259259个残基。个残基。纤维蛋白原分子长纤维蛋白原分子长46nm46nm，分子量为，分子量为340 000340 000，属纤维状蛋白，属纤维状蛋白质。每一分子含质。每一分子含6 6条肽链，这条肽链，这6 6条肽链两两相同，分三种类，条肽链两两相同，分三种类，分别称为分别称为链链(含含600600个残基左右个残基左右)、链链(461(461个残基个残基)和和链链(410(410个残基个残基)。整个分子由对称的两部分组成，。整个分子由对称的两部分组成，6 6条肽链的条肽链的N N末端部分集中在中间。纤维蛋白原分子共含末端部分集中在中间。
50、纤维蛋白原分子共含2929个二硫键，个二硫键，6 6条肽链由这些二硫键交联成一个整体分子。肽链的氨基酸之条肽链由这些二硫键交联成一个整体分子。肽链的氨基酸之间有顺序同源现象。间有顺序同源现象。纤维蛋白原一级结构示意图纤维蛋白原一级结构示意图纤维蛋白原转变为纤维蛋白的过程是在凝血酶的作用下，纤维蛋白原转变为纤维蛋白的过程是在凝血酶的作用下，从二条从二条链和二条链和二条链的链的N N末端各断裂一个特定的肽键末端各断裂一个特定的肽键(Arg-Gly-)Arg-Gly-)，释放出二个纤维肽，释放出二个纤维肽A A和二个纤维肽和二个纤维肽B B。A A、B B肽切除后，减少了蛋白质分子的负电荷，促进了纤
