1、 导师导师 唐唐 伟伟 学生学生 王王 鑫鑫 专业专业 神经内科神经内科 研究研究背景背景 老年性痴呆即阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)是老年人最常见的以进行性痴呆为特征的神经系统退行性变性疾病。目前临床上治疗老年痴呆缺乏有效的措施。近年来流行病学研究发现，单纯生活方式的改变可以影响AD的发生和进展，但机理不清楚。丰富环境（EE）干预作为生活方式改变的一种形式，可促进脑损伤及神经变性疾病的恢复，包括外伤性颅脑损伤，癫痫持续状态，帕金森病等。丰富环境：1947年美国人Hebb提出丰富环境的概念，这一模式被广泛用来研究环境对脑功能的影响，包括对正常动物模型以及各种中枢神经系
2、统损伤模型的研究。1978年丰富环境首次被定义为：复杂的无生命物与社会刺激的复合体。即动物的饲养环境空间增大，内置物体丰富而新奇,成员较多，不仅提供了多感官刺激和运动的机会，而且赋予了相互间社交行为的可能。突触可塑性：突触可塑性是神经可塑性的主要表现，可分为结构可塑性和功能可塑性。突触结构可塑性指突触形态的改变以及新的突触连接形成和传递功能的建立，是一种持续时间较长的可塑性。突触功能可塑性指突触的反复活动引致突触传递效率的增加或降低 突触的数密度(Nv)、平均面积(S)、面密度(Sv)被认为是突触可塑性形态学研究的可靠参数 突触素的表达和突触的形成是一致的，突触素是突触发生的一个重要标志，突触
3、重建时突触素含量明显增多 老年性痴呆最主要的病理改变是脑内胆碱能神经系统损伤及胆碱能神经元丢失，也是造成学习记忆能力下降的直接原因，因此本实验应用鹅膏蕈氨酸基底前脑注射，破坏模型动物脑内胆碱能神经系统，造成胆碱能神经元丢失，可模拟老年性痴呆 本课题采用鹅膏蕈氨酸基底核前脑注射破坏模型动物，造成胆碱能神经元丢失，以模拟老年性痴呆，从神经行为学、组织形态学、生物化学、分子生物学角度探讨丰富环境对AD大鼠学习记忆及神经元突触可塑性影响，旨在揭示丰富环境干预AD作用机制，为丰富环境治疗AD临床推广应用奠定理论基础技术路线研究方法1、材料及丰富环境准备 Wistar大鼠，40只，雄性，体重160180g
4、,清洁级,随机分为标准环境正常组、标准环境模型组，丰富环境模型组，丰富环境正常组各10只 丰富环境模型参照文献加以改进，鼠笼规格为120cm100cm60cm，笼内设有金属制小桥和斜架、直径3cm隧道(聚氯乙烯树脂材料制成)、塑料跑笼、金属链条、各种形状及颜色的塑料玩具(球、盒、铃档等)和木制积木，每2-3d清洁并更换1次。笼内安装有L形隧道、塑料转轮、小球等玩具，每笼5只，持续时间为28 d。标准环境正常组、标准环境模型组大鼠饲养于普通鼠笼中，笼内有垫料。环境温度保持23-25C，维持12 h照明、12 h黑暗的光照周期，实验动物自由进食、饮水。在丰富环境与正常环境条件下培养8周2、动物模型
5、制作将大鼠用10%水合氯醛麻醉，脑立体定位仪固定平颅头位，参照大鼠脑定位图谱,在前囟前(AP)0.8mm、中线旁开(ML)3.0mm处，距颅骨表面深度(DV)7.5mm双侧各注鹅膏蕈氨酸（购自sigma公司）1l(10g/L溶于0.5 M PBS中)，标准环境对照组注射等量PBS3 指标检测 3.1 采用物体识别实验（ORT）和物体位置实验(OLT)评价大鼠的非空间学习、记忆能力，两种测试任务没有任何刺激源，不会影响动物的自主活动物体识别实验是利用啮齿类动物喜欢对新物体识别实验是利用啮齿类动物喜欢对新的物体进行探测的行为来判断动物是否记的物体进行探测的行为来判断动物是否记住了先前遇过的物体，如
6、果记住了旧的物住了先前遇过的物体，如果记住了旧的物体，则动物应对旧的物体的探索时间少于体，则动物应对旧的物体的探索时间少于新的物体新的物体物体辨识实验（物体辨识实验（ORT）示意图）示意图物体位置辨识实验（物体位置辨识实验（OLT）示意图）示意图 结果以辨识指数表示，越高即表示动物的学习记忆能力越好，反之学习记忆能力差。辨识指数（DI）计算公式：DI=(Tn Tf)/(Tf+Tn)其中Tn代表大鼠在识别期探索新物体的时间，Tf代表大鼠在识别期探索旧物体的时间。3.2 海马突触形态可塑性检测（1）电镜标本制备及观察 3%戊巴比妥麻醉断头剥脑取海马固定丙酮梯度脱水浸透包埋切片(厚600A0)230
7、目铜网捞片3%柠檬酸铅+0.1%醋酸铀双重电子染色观察突触Nv、Sv，S 突触的数密度(NV)即单位参照系体积中突触的数目，是揭示参与某一神经活动过程的神经元接点数目的直接指标。突触的面密度(SV)为单位参照系体积中的突触面积，突触数量和大小的综合性指标，反映的是突触连接带表面积在组织中的密度 平均面积(S)为突触连接带的平均面积（2）组织切片制备 麻醉取左侧大脑半球福尔马林固定脱水透明石蜡包埋切片 取脑：每组随机取7只大鼠麻醉，断头处死，在冰台上快速取出脑组织，分离出左侧大脑半球，将附着在脑组织上的脑膜剥离干净后，从前额开始冠状位将脑组织切成从前至后切成4部分（3）免疫组织化学反应 滴加3%
8、过氧化氢甲醇溶液，室温孵育10 min,PBS冲洗加非免疫性动物血清，室温孵育30min加突触素抗体，4C孵育24h,PBS冲洗滴加第二抗体，室温孵育30min,PBS冲洗加链亲和素过氧化物酶溶液，室温孵育30 min,PBS洗3次DAB显色3-10 min贴片、常规脱水、透明封片 阴性对照组省去第一抗体，其余步骤相同。在全自动图像分析系统测定海马突触素免疫反应物的光密度值(OD值)，同时在相同的光学条件下测定相应每张切片胼胝体OD值作背景，免疫反应物的OD值减去背景OD值得到校正OD值，即免疫反应物的光密度值 预期目标 丰富环境可能会改善拟老年痴呆(AD)大鼠学习记忆，增强海马突触的可塑性，促进突触结构重建。丰富环境可成为AD重要治疗手段。研究进度 2011年3月2011年6月 模型制作、神经行为学测定。2011年7月2011年10月 检测海马突触形态可塑性指标突触数密度(Nv)、突触面密度(Sv)及平均面积(S)的变化；大鼠海马突触素进行定量分析 2011年11月以后 总结实验结果，补充实验，结果分析，整理资料，撰写论文。谢谢谢谢
