探针的标记物放射性同位素课件.ppt

1、核酸核酸mRNA、DNA蛋白质蛋白质RT-PCRRealtime PCRNorthern blot（RNA）Southern blot（DNA）原位杂交原位杂交指纹分析指纹分析（Finger printing）基因芯片基因芯片（DNA microarray）ELISAWesthern blot免疫组化免疫组化背背 景景主要内容主要内容1.定义、基本概念和发展简史定义、基本概念和发展简史2.原位杂交的基本原理原位杂交的基本原理3.探针探针(probe)与探针的标记物与探针的标记物4.探针标记法与探针的纯化探针标记法与探针的纯化5.探针制备技术探针制备技术6.核酸分子杂交信号的检测核酸分子杂交信号

2、的检测7.地高辛标记寡核苷酸探针的原位杂交方法地高辛标记寡核苷酸探针的原位杂交方法原位杂交组织化学（原位杂交组织化学（ISHHISHH）简称原位杂交）简称原位杂交是将是将分子杂交分子杂交与与组织化学组织化学相结合的一项技术相结合的一项技术在原位检测组织、细胞中的特定核酸序列在原位检测组织、细胞中的特定核酸序列定 义核酸原位杂交技术核酸原位杂交技术：利用放射性或非放射性标记的已知核酸探针，：利用放射性或非放射性标记的已知核酸探针，通过放射自显影或非放射检测系统检测组织、细胞及染色体上特通过放射自显影或非放射检测系统检测组织、细胞及染色体上特异异DNADNA或或RNARNA序列的一种技术，序列的一

3、种技术，一种直接、简便的研究基因定位和表达的方法一种直接、简便的研究基因定位和表达的方法杂交双方：杂交双方：待测核酸序列、核酸探针待测核酸序列、核酸探针待测核酸序列：待测核酸序列：克隆的基因片段，未克隆化的基因组克隆的基因片段，未克隆化的基因组DNADNA和细胞和细胞 总总RNARNA。核酸探针：核酸探针：用放射性同位素、非放射性荧光染料直接或间接标记用放射性同位素、非放射性荧光染料直接或间接标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNADNA或或RNARNA片段。片段。分为分为cDNAcDNA探针、基因组探针、基因组DNADNA探针、寡核苷酸探

4、针、探针、寡核苷酸探针、RNARNA探针等。探针等。基本概念分子杂交分子杂交原位杂交原位杂交探探 针针DNA/RNA核酸分子杂交核酸分子杂交DNA印迹技术印迹技术(Southern blotting)用于用于基因组基因组DNA的定性定量分析、酶切图谱分析、基因的定性定量分析、酶切图谱分析、基因突变分析及限制性片段长度多态性分析（突变分析及限制性片段长度多态性分析（RFLP）等。）等。蛋白质的印迹分析蛋白质的印迹分析(Western blotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。RNA印迹技术印迹技术(Northern blotting)用于用于RNA的定

5、性定量分析。靶核酸是的定性定量分析。靶核酸是RNA；电泳时，；电泳时，凝胶中加入变性剂，防止凝胶中加入变性剂，防止RNA分子形成二级结构分子形成二级结构发展简史发展简史 当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞，探当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞，探 针均采用针均采用同位素同位素标记。标记。同位素标记缺点：污染环境，有害人体，半衰期局同位素标记缺点：污染环境，有害人体，半衰期局 限性限性 19811981，Bauman等首先应用荧光素标记等首先应用荧光素标记cRNA探探针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成功功荧光杂交技术荧光杂交技术。198219

6、82，ShroyerShroyer报道用报道用2 2，4 4二硝基苯甲醛（二硝基苯甲醛（DNPDNP）标记标记DNADNA探针，使该探针，使该DNADNA探针具有抗原性，然后用探针具有抗原性，然后用兔抗兔抗DNPDNP的抗体来识别杂交后的探针，最后经的抗体来识别杂交后的探针，最后经免疫免疫过氧化物酶的方法过氧化物酶的方法来定位杂交探针来定位杂交探针 上述两种方法敏感度不高，应用不够普遍。上述两种方法敏感度不高，应用不够普遍。发展简史发展简史 生物素标记生物素标记探针技术是探针技术是BrigatBrigat（19831983）首先建立的，它利用生物素标记的探针首先建立的，它利用生物素标记的探针在

7、组织切片上检测了病毒在组织切片上检测了病毒DNADNA，通过生物，通过生物素与抗生物素结合，过氧化物酶素与抗生物素结合，过氧化物酶-抗过氧抗过氧化物酶显示系统显示病毒化物酶显示系统显示病毒DNADNA在细胞中的在细胞中的定位。定位。生物素标记探针技术目前已被广泛应生物素标记探针技术目前已被广泛应用用酶促生物素标记技术酶促生物素标记技术发展简史发展简史19871987年年 PezzellaPezzella用用磺基化磺基化DNADNA探针探针，以单克隆，以单克隆抗体识别磺基化探针，通过免疫组化显示结合抗体识别磺基化探针，通过免疫组化显示结合的单克隆抗体，对杂交结合探针定位。的单克隆抗体，对杂交结合

8、探针定位。优点：探针标记简便，不需作切片平移标记，优点：探针标记简便，不需作切片平移标记，敏感度较高。敏感度较高。发展简史发展简史 19871987年，将地高辛标记的有关试剂及药年，将地高辛标记的有关试剂及药盒投放市场。盒投放市场。地高辛标记技术地高辛标记技术引起科技引起科技工作者的极大兴趣。工作者的极大兴趣。标记标记碱性磷酸酶碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶显色显色 优点：完全、方便、省时，敏感性和质优点：完全、方便、省时，敏感性和质量控制较好，可检测人基因组量控制较好，可检测人基因组DNADNA的单拷的单拷贝基因，背景反差好。贝基因，背景反差好。发展简史发展简史 19911991年年 C

9、outonCouton建立将非放射性标记技建立将非放射性标记技术 更 新 为 亲 和 复 合 物 标 记 技 术术 更 新 为 亲 和 复 合 物 标 记 技 术 （Affinity-complex LabelledAffinity-complex Labelled Probes Probes，ACLPACLP）。）。发展趋势：实验室常规技术和临床日常发展趋势：实验室常规技术和临床日常应用的诊断技术。应用的诊断技术。发展简史发展简史原位杂交的基本原理原位杂交的基本原理以以DNA分子复制原理为基础。分子复制原理为基础。两条核苷酸单链片段，在适宜的条件下，通过氢键结合，形两条核苷酸单链片段，在适宜

10、的条件下，通过氢键结合，形成成DNA-DNA、DNA-RNA或或 RNA-RNA 双键分子，应用带有双键分子，应用带有标记的（标记的（放射性同位素放射性同位素，如，如3H、35S、32P，荧光素生物素、，荧光素生物素、地高辛等非放射性物质）地高辛等非放射性物质）DNA或或RNA片段作为核酸探针，与片段作为核酸探针，与组织切片或细胞内待测核酸（组织切片或细胞内待测核酸（RNA或或DNA）片段进行杂交，）片段进行杂交，然后可用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察然后可用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目的目的 mRNA或或DNA 的存在并定位；的存在并定位；应用原位杂交技术，可

11、在原位研究细胞合成某种多肽或应用原位杂交技术，可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白蛋白质质的基因表达。的基因表达。此方法有很高的敏感性和特异性，可进一步从分子水平来探此方法有很高的敏感性和特异性，可进一步从分子水平来探讨细胞的功能表达及其调节机制。讨细胞的功能表达及其调节机制。在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合（杂交），所形成细胞或组织中相应的基因片段相结合（杂交），所形成杂交体杂交体(Hybrids）经显色反

12、应后在光学显微镜或电子显）经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和和tRNA分子。分子。RNA原位杂交技术原位杂交技术 经不断改进，其应用的领域已远超经不断改进，其应用的领域已远超出出DNA原位杂交技术。原位杂交技术。尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析，尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析，已已 成为最有效的分子病理学技术，同时在分析低丰度和成为最有效的分子病理学技术，同时在分析低丰度和罕见的罕见的mRNA表达方面已展示了分子生物学的一重要方表达方面已展示了分子生物学的一重要方向。向。原位杂交的基本原理原位杂

13、交的基本原理原理：碱基互补配对原则原理：碱基互补配对原则 定义定义：在某些理化因素作用下，在某些理化因素作用下，DNADNA双链解开双链解开 成两条单链的过程。成两条单链的过程。方法：方法：过量酸、碱、加热、变性试剂如尿素、过量酸、碱、加热、变性试剂如尿素、甲酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。甲酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。变性后其它理化性质变化：变性后其它理化性质变化：OD260OD260增高增高粘度下降粘度下降 比旋度下降比旋度下降浮力密度升高浮力密度升高 酸碱滴定曲线改变酸碱滴定曲线改变生物活性丧失生物活性丧失DNA变性变性(denaturation)DNADNA变性的本质是双链

14、间氢键的断裂变性的本质是双链间氢键的断裂DNADNA的紫外吸收光谱的紫外吸收光谱增色效应：增色效应：DNADNA变性时其溶液变性时其溶液OD260OD260增高的现象。增高的现象。变性引起紫外吸收值的改变变性引起紫外吸收值的改变解链曲线：解链曲线：如果在连续加热如果在连续加热DNADNA的过程中以温的过程中以温度对度对A260A260值作图，所得的曲线称为解链曲线值作图，所得的曲线称为解链曲线。热变性热变性Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，双链双链DNADNA变性一半所需要的温度称为变性一半所需要的温度称为DNADNA的解

15、链温度，又称熔解的解链温度，又称熔解温度温度,Tm)。其大小与其大小与G+C含量成正比。含量成正比。熔解温度熔解温度(melting temperature,Tm)Tm=（G+C）%0.41+69.3 DNA复性复性在适当条件下，变性在适当条件下，变性DNA的两条互补链的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性复性。热变性的热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为这一过程称为退火退火(annealing)。减色效应减色效应:DNA复性时，其溶液复性时，其溶液OD260降低。降低。DNA复性复性复性复性RNADNA核酸核

16、酸的变性、复性和杂交的变性、复性和杂交变性变性（加热）（加热）探针探针杂交杂交（缓慢冷却）（缓慢冷却）复性复性（缓慢冷却）（缓慢冷却）复性复性：在一定条在一定条件下，变性件下，变性DNA DNA 单链单链间碱基重新配对恢复间碱基重新配对恢复双螺旋结构，伴有双螺旋结构，伴有A A260260减 小（减 色 效 应减 小（减 色 效 应）,DNA的功能恢复的功能恢复。1.1.核酸分子的浓度：一般适宜的探针浓度为核酸分子的浓度：一般适宜的探针浓度为0.10.10.5g0.5g 2.2.核酸分子的长度：核酸探针的长度控制在核酸分子的长度：核酸探针的长度控制在5050300bp300bp 3.3.温度：

17、适宜的复性温度是较温度：适宜的复性温度是较TmTm值低值低2525。4.4.离子强度：离子强度过低，不利于复性。离子强度：离子强度过低，不利于复性。5.5.核酸分子的复杂性。核酸分子的复杂性。影响复性速度的诸多因素影响复性速度的诸多因素(1)使用的探针不同：RNA原位杂交中多采用RNA或寡核苷酸探针，避免了应用双链DNA探针在杂交反应中存在的两条链之间的复性和第二条链的竞争性杂交问题。cRNA-RNA杂交体比DNA-DNA、cDNA-RNA杂交体性能稳定，在杂交反应后可用RNA酶洗脱，以除去未结合的探针，因此特异性更强。(2)检测的目的不同：RNA原位杂交检测和分析的主要为内源性基因，包括细胞

18、内固有基因、异常基因和变异基因。以正确反映组织与细胞之间相互关系及功能和代谢状态、探索疾病发病机理、观察治疗的疗效和评估疾病的预后等。其次为对外源性基因检测，以获得病毒和细菌类型等病原学诊断。而DNA原位杂交主要为外源性基因检测。(3)有较高的灵敏度：在检出细胞和组织内在低拷贝核苷酸时，RNA原位杂交能获得较好定位。RNA原位杂交特点原位杂交特点RNA原位杂交也存在某些不足之处，为使RNA原位杂交标准化和克服其不足之处必须注意以下几点：(1)探针种类选择、制备和标记要适合靶核酸和组织的特点；(2)有效制止组织和细胞内RNA降解；实验流程严防RNA酶污染(3)杂交信号有效的放大和显色技巧；(4)

19、阳性结果判别,不仅需要有阳性和阴性标本对照，有条件需要观测Northern杂交和免疫组化对同一组织的冰冻切片和石蜡切片中，基因及其产物两者表达之间联系。近几年来RNA原位杂交技术进展：非同位素标记的探针制备和标记技术的进步、杂交信号放大的应用、组织预处理的改进、RNA原位杂交和免疫组化双重检测技术和激光共聚焦显微镜在多重RNA原位杂交中应用等。RNA原位杂交不足之处原位杂交不足之处探针探针(probe)一小段用同位素、生物素或荧光染料等标记一小段用同位素、生物素或荧光染料等标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否

20、有膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。同源的核酸分子存在。核酸探针的长度控制在核酸探针的长度控制在50300bp 基因组基因组DNA探针探针 cDNA探针探针 RNA探针探针 寡核苷酸探针寡核苷酸探针核酸探针的种类（来源）核酸探针的种类（来源）RNA探针是指带有标记的能与组织内相对应的核苷酸序列互补结合的一段单链cDNA或cRNA分子。1.单链单链cDNA探针探针：由于cDNA中不存在内含子及其它高度重复序列，又克服了双链cDNA探针在杂交反应中两条链之间复性的缺点，从而提高了杂交反应的敏感性。但由于单链cDNA探针的制备比较困难，在RNA原位杂交中已很少见有应用。2.cRNA探针

21、：探针：是以cDNA为模板，通过体外转录而获得的。因为它是一种单链探针，因此也避免了应用双链cDNA探针做杂交反应时存在的两条之间的复性问题。cRNA与RNA之间形成的杂交体要比cDNARNA杂交体稳定，不受RNA酶的影响。杂交反应后可用RNA酶处理，以除去未结合的探针。cRNA探针的杂交饱和水平比双链DNA探针高出8倍，应用广泛。cRNA探针的缺点是：探针的制备过程比较复杂，它对RNA酶敏感，易受破坏。RNA探针探针RNA探针探针3.寡核苷酸探针：寡核苷酸探针：人工合成的寡核苷探针是以核苷酸为原料，避免了真核细胞中存在的高度重复序列带来的不利影响。由于大多数寡核苷酸序列较短，不需要纯化，组织

22、穿透性极好。根椐目的基因的特异性序列设计的探针，特异性较强。合成的寡核苷酸探针的缺点缺点是：探针长度必须适宜，探针太长可造成内部错误配对杂交，探针太短可形成非特异性结合。它与mRNA形成的杂交体不如cRNARNA杂交体稳定，再则探针较短，所携带的标记物少，敏感性较低。1.1.高度灵敏性；高度灵敏性；2.2.高度特异性；高度特异性；3.3.标记物与探针结合，应绝对不能影响探针与模板的结合标记物与探针结合，应绝对不能影响探针与模板的结合能力及结合的特异性；能力及结合的特异性；4.4.当用酶促方法进行标记时，应对酶促活性（当用酶促方法进行标记时，应对酶促活性（KmKm值）无多值）无多大影响，以保证标

23、记反应的效率和标记产物的比活性；大影响，以保证标记反应的效率和标记产物的比活性；5.5.较高化学稳定性，保存时间长，标记及检测方法简单；较高化学稳定性，保存时间长，标记及检测方法简单；6.6.对环境无污染，对人体无损伤；对环境无污染，对人体无损伤；7.7.价格低廉等。价格低廉等。探针制备技术探针制备技术-探针的标记物探针的标记物 放射性同位素：放射性同位素：3H、32P、35S、125I等。等。非放射性同位素：非放射性同位素：生物素生物素 荧光、荧光、地高辛素、地高辛素、辣根过氧化酶、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等。碱性磷酸酶等。不同的同位素探针其穿透力，定位和不同的同位素探针其穿透力，定位和半衰

24、期各不相同，无一种同位素探针半衰期各不相同，无一种同位素探针具有穿透力强、定位好和半衰期长所具有穿透力强、定位好和半衰期长所有优点。由于半衰斯短，性能不稳定，有优点。由于半衰斯短，性能不稳定，污染环境和危害健康等，在污染环境和危害健康等，在RNA原原位杂交中应用同位素标记探针已日趋位杂交中应用同位素标记探针已日趋减少。减少。地高辛标记的地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素标记的探针在优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点，其应用越来越广

25、泛。干忧等缺点，其应用越来越广泛。探针制备技术探针制备技术-常用探针标记物常用探针标记物探针制备技术探针制备技术-3232P P：释放：释放-粒子粒子,能量高能量高,穿透力极强穿透力极强3535S S：放射性亦较强，但：放射性亦较强，但-粒子能量较低，粒子能量较低，因此其检测灵敏度较因此其检测灵敏度较3232P P稍低。稍低。3 3H H：适用于细胞原位杂交。适用于细胞原位杂交。125125I I和和131131I I：碘放射性同位素在：碘放射性同位素在7070年代曾被年代曾被 广泛应用于核酸探针的标记。广泛应用于核酸探针的标记。放射性核素标记物（灵敏度极高）放射性核素标记物（灵敏度极高）探针

26、制备技术探针制备技术-无放射性污染，稳定性好无放射性污染，稳定性好半抗原：生物素、地高辛半抗原：生物素、地高辛配配 体：生物素体：生物素荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明化学发光物质化学发光物质:可以像放射性核素一样直接对可以像放射性核素一样直接对X光光胶片进行曝光。胶片进行曝光。光密度或电子密度标记物：如金、银等，适用于光密度或电子密度标记物：如金、银等，适用于细胞原位杂交，可以在光镜或电镜下进行观察。细胞原位杂交，可以在光镜或电镜下进行观察。非放射性标记物非放射性标记物在RNA原位杂交中，不仅要选择适当的探针，而且还要使探针得到有效的标记。探针标记法：酶反应法和化

27、学反应法。主要为末端标记法与体外转录法。末端标记法是将标记物导入线型DNA或RNA的5端或3端的一种标记法，末端标记适用于合成寡核苷酸探针的标记，用末端标记制备的探针一般携带的标记分子较少。酶反应法酶反应法探针制备技术探针制备技术-体外转录法是一种制备与克隆片段序列相同的单链RNA探针的方法。体外转录时，先将靶核苷酸序列克隆到含噬菌体转录启动子的载体中，然后在RNA聚合酶的作用下，以DNA为模板，以含有标记的三磷酸苷标记的三磷酸苷为原料，对启动子下游的序列进行转录，而启动子本身并不被转录。体外转录常用噬菌体转录启动子，如大肠杆菌噬菌体T3、T7。当两个不同的噬菌体转录启动子结合在载体多克隆位点

28、的两侧，用适当的限制性内切酶在插入序列的下游将质粒线性化。SP6噬菌体的RNA聚合酶对SP6启动子序列具有高度的亲和性，从而启动下游的转录，在4种三磷酸核糖核苷和相应的噬菌体RNA聚合酶存在的条件下，即转录成RNA。如反应物中含有标记的三磷酸核糖核苷，所有的RNA就被标记。体外转录法体外转录法探针制备技术探针制备技术-非同位素标记法又可分为直接标记法和间接标记法。直接标记法：即直接标记法：即化学反应法，是将标记物直接结合到探针化学反应法，是将标记物直接结合到探针上，当探针与组织内相应靶核苷酸结合后，即可显色观察。上，当探针与组织内相应靶核苷酸结合后，即可显色观察。这类标记探针必须符合标记物在杂

29、交过程中不丢失，又不影响杂交反应为条件。大量已发表的文献表明，由于检出杂交信号受到多种因素制抑，只能限于靶RNA丰富的细胞或组织中，RNA杂交对低拷贝的基因检测不理想。间接标记法：间接标记法：将标记物结合在探针上，通过特异性抗体识将标记物结合在探针上，通过特异性抗体识别，由特异性抗体结合多种酶，对检测的杂交信号作放大。别，由特异性抗体结合多种酶，对检测的杂交信号作放大。这一类标记法已展示极好的发展前景。探针制备技术探针制备技术-酶促标记法酶促标记法（一）切口平移法（一）切口平移法（nick translation)1、利用、利用DNase I在在DNA双链上造成单双链上造成单链切口链切口2、利

30、用大肠杆菌、利用大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I的的53 核酸外切酶活性在切口处将旧链核酸外切酶活性在切口处将旧链从从5 末端逐步切除末端逐步切除3、在、在DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合酶催聚合酶催化下，以互补的化下，以互补的DNA单链为模板依次单链为模板依次将将dNTP连接到切口的连接到切口的3 末端末端-OH上，上，合成新的合成新的DNA链，同时将标记的核苷链，同时将标记的核苷酸掺入到新的酸掺入到新的DNA链中链中Mg2+离子离子只能标记双链只能标记双链DNA，使用探针时要预先变性后再使用，而且标记时，使用探针时要预先变性后再使用，而且标记时DNA片段不太小片段不太小（二）随机引物法（二）

31、随机引物法 其原理是随机引物能与各种其原理是随机引物能与各种单链单链DNA模板结合，作为合成新模板结合，作为合成新链的引物，在链的引物，在DNA聚合酶的催化聚合酶的催化下，按下，按53 方向合成一新的方向合成一新的DNA链，其核苷酸序列与模板链，其核苷酸序列与模板DNA完全互补。另一单链完全互补。另一单链DNA模板同样合成一条新的完全互补模板同样合成一条新的完全互补的的DNA链。合成时，带放射性核链。合成时，带放射性核素标记的核苷酸掺入到新合成的素标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中分子中一般对基因组一般对基因组DNA进行标记时用这种方法的效果较好进行标记时用这种方法的效果较好随机引物法所具

32、有的优点：随机引物法所具有的优点：1、能进行双链、能进行双链DNA、单链、单链DNA或或RNA探针的标记探针的标记2、操作简单方便，避免因、操作简单方便，避免因DNaseI处理浓度掌握不处理浓度掌握不当所带来的一系列问题当所带来的一系列问题3、标记活性高，标记活性可达、标记活性高，标记活性可达108cpm/gDNA以以上上4、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记（三）（三）PCR标记法：标记法：将标记的核苷酸作为将标记的核苷酸作为PCR反应的底物，以待标记反应的底物，以待标记的的DNA为模板，经为模板，经PCR反应，标记的核苷酸掺入反应，标记的核苷酸掺入到新合

33、成的到新合成的DNA分子中。分子中。某些标记探针必须经纯化后方可使用。因为在探针标记过程中，某些标记探针必须经纯化后方可使用。因为在探针标记过程中，反应液中仍存在一些未被结合到探针中去的剩余反应液中仍存在一些未被结合到探针中去的剩余dNTP等小分等小分子。子。为将掺入并结合到为将掺入并结合到cDNA、cRNA和标记寡核苷酸与游离标记和标记寡核苷酸与游离标记寡核苷酸分开，常使用乙醇沉淀法或酚寡核苷酸分开，常使用乙醇沉淀法或酚/氯仿抽提法进行纯化氯仿抽提法进行纯化乙醇沉淀法的原理是：DNA可被乙醇沉淀，而未掺入DNA的dNTP则保留在上清液中，由此反复乙醇沉淀能将两者分开。核酸溶液中去除蛋白质的酚

34、/氯仿抽提法的原理是：交替使用酚、氯仿这两种不同的蛋白质变性剂，以增加去除蛋白质杂质的效果。因为酚虽能有效地变性蛋白质，但它不能完全抑制RNA酶的活性，而且酚能溶解10-15%的水，从而溶解一部分ploy(A)RNA。为克服这两方面的局限，混合使用酚与氯仿，对于RNA提取，显得更加重要，氯仿还能加速有机相与液相分层，去除植物色素和蔗糖。探针制备技术探针制备技术-1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除片段，可去除dNTP和和蛋白质蛋白质2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将大分子、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将大分子DNA和小分子和小

35、分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷酸（、磷酸根离子及寡核苷酸（80bp)等物质等物质分离，常用凝胶基质是分离，常用凝胶基质是Sephadex G-503、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此法则是利用离心的方的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针式来纯化探针探针制备技术探针制备技术-放射性同位素标记探针放射性同位素标记探针放射自显影放射自显影 非放射性同位素标记探针非放射性同位素标记探针偶联反应偶联反应+显色反应显色反应核酸分子杂交信号的检测核酸分子杂交信号的检测Ve

36、rmot J.2000.Endocrinology.Diao HL.2007.Fertil&SterilXie HR et al.2007.PANS35S35S地高辛地高辛地高辛标记寡核苷酸探针的原位杂交方法地高辛（Digoxigenin 简写Dig-）又称异羟基洋地黄毒甙配基，这种类固醇半抗原仅限于洋地黄类植物，其抗体与其它任何固醇类似物如人体中的性激素等无交叉反应；地高辛配基标记于脱氧尿嘧啶三磷酸核苷（dUTP）上形成Dig-11-dUTP。通过随即引物或缺口平移法（多用随机引物法），将Dig-11-dUTP与探针的核酸分子相连，构成Dig-配基标记的核酸探针。采用人工方法可将地高辛的线型

37、间隔臂与采用人工方法可将地高辛的线型间隔臂与dUTP连连接起一来形成接起一来形成DIG-11-dUTP，通过体外转录将，通过体外转录将DIG-11-dUTP掺入到掺入到RNA探针中，寡核苷酸探针的标记探针中，寡核苷酸探针的标记则是利用末端转移酶催化，在单链则是利用末端转移酶催化，在单链3-羟基端直接添羟基端直接添加加DIG-11-dUTP尾巴尾巴，从而使地高辛掺入到序列末，从而使地高辛掺入到序列末端端,达到标记的目的。达到标记的目的。地高辛标记寡核苷酸探针的原位杂交方法将这种标记的探针与组织、细胞或染色体原位核酸将这种标记的探针与组织、细胞或染色体原位核酸分子之间的同源序列在一定条件下互补杂交

38、；分子之间的同源序列在一定条件下互补杂交；用偶联有酶或荧光素的羊抗地高辛抗体用偶联有酶或荧光素的羊抗地高辛抗体Fab（抗原（抗原结合片断）结合物作为酶标或荧光标记；结合片断）结合物作为酶标或荧光标记；用显色底物使杂交部位显色或产生荧光以达到检测用显色底物使杂交部位显色或产生荧光以达到检测目的。目的。地高辛标记寡核苷酸探针的原位杂交方法近年来，地高辛（近年来，地高辛（Digoxigonin）标记技术引起科技工作者）标记技术引起科技工作者的极大兴趣。的极大兴趣。1987年，地高辛标记的有关试剂及药盒投放市场。年，地高辛标记的有关试剂及药盒投放市场。地高辛标记法显示的颜色为紫蓝色（标记碱性磷酸酶地高

39、辛标记法显示的颜色为紫蓝色（标记碱性磷酸酶-抗碱抗碱性磷酸酶显色系统），有较好的反差背景。性磷酸酶显色系统），有较好的反差背景。地高辛较放射性标记系统安全，方便、省时间。同时在敏感地高辛较放射性标记系统安全，方便、省时间。同时在敏感性和质量控制方面比生物素标记技术要优越，可以检测出人性和质量控制方面比生物素标记技术要优越，可以检测出人基因组基因组DNA中的单拷贝基因。中的单拷贝基因。地高辛标记寡核苷酸探针的原位杂交方法CCCCC C取材、切片取材、切片杂交流程杂交流程观察、照相观察、照相地高辛标记探针的显色检测 常用免疫酶学显色检测方法有两类：Dig-HRP检测系统，检测系统，以以DAB/H2

40、O2为底物，结果为棕色；为底物，结果为棕色；以以4-氯氯-1-萘酚萘酚/H2O2为底物，结果为为底物，结果为蓝色蓝色。Dig-AKP检测体系，检测体系，以以BCIP/NBT为底物，结果为为底物，结果为蓝紫色蓝紫色沉淀。沉淀。与免疫细胞化学方法相似，如应用酶促反应会较单一信号的标记物如荧光具有更高的灵敏度。同样是酶促化学反应，AKP灵敏度和分辨率较HRP高约10倍左右，但HRP的优点为廉价、稳定。差异表达基因验证在围植入期子宫中的定位在围植入期子宫中的定位 原位杂交Bar:80m化学发光检测 能通过X 光片记录下很轻微的信号1、使用封闭剂对杂交后的膜进行处理,以阻止抗体对膜的特异性吸引,2、加入

41、结合有碱性磷酸酶的抗地高辛半抗原的抗体(Anti-DIG-AP),形成酶联抗体-半抗原复合物,3、加入化学发光底物CSPD或CDP-StarTM,使其与膜上的杂交探针所结合的抗体复合物充分反应,4、最后在X光片上曝光,以记录化学发光信号。化学发光检测在尼龙膜上的效果优于在纤维素膜上的效果。地高辛标记探针的显色检测 地高辛标记探针的显色检测 化学显色显色原理相同，显色底物是5-溴-4-氯-3 吲哚酚磷酸盐(也称X-磷酸盐，BCIP)和氮蓝四唑盐(NBT)，它与酶联抗体-半抗原（Anti-DIG-AP）复合物在酶促作用下发生反应，于数分钟内开始呈现蓝紫色，随时间延长，颜色逐渐变深，通常于24h终止

42、反应。如用坚固红(FRAS-MX)产生的底物为玫瑰红色，用坚固蓝(FBAS-MX)则产物为紫绿色，而BCIPNBT为紫蓝色地高辛标记的核酸探针较稳定，根据告在-20储存可达2年，随时可以取用，不像放射性标记的探针有半衰期所致的时间限制。现实应用中，人们仍喜欢采用新鲜的地高辛配基标记36个月以内的核酸探针。为节省核酸探针的用量，凡使用过的含有探针的 杂交液也可反复多次使用，特别是对于已知的重复性实验，对于细胞或组织内未知mRNA的检测，仍宜采用使用过的探针杂交液为佳。与放射性标记相比，地高辛标记探针具有非放射性探针的优点，对人体无害，不受半衰期限制，探针可长期保存。与生物素标记探针相比，地高辛探

43、针不受组织、细胞中内源性生物素的干扰，敏感性高。地高辛标记cRNA探针在原位杂交细胞化学中已愈来愈得到广泛的应用，下面较详细的叙述其操作过程。组织和器材的特殊处理组织和器材的特殊处理 取材、固定、切片取材、固定、切片 杂交前处理杂交前处理 探针的制备和预杂交探针的制备和预杂交 杂交反应杂交反应 杂交后处理杂交后处理 检测杂交信号，进行结果分析检测杂交信号，进行结果分析地高辛标记探针原位杂交地高辛标记探针原位杂交操作步骤操作步骤器材的特殊处理器材的特殊处理 DNADNA：稳定性较好，一般不需特殊处理。稳定性较好，一般不需特殊处理。常规的石蜡或冷冻切片均适用于组织或常规的石蜡或冷冻切片均适用于组织

44、或细胞内的细胞内的DNADNA原位杂交原位杂交 RNARNA：RNARNA酶酶几乎无处不在，而且一般的几乎无处不在，而且一般的消毒方法不能将其灭活。因此，当检测消毒方法不能将其灭活。因此，当检测RNARNA或用或用RNARNA作为探针时，从标本准备到作为探针时，从标本准备到杂交结束前，都要注意预防杂交结束前，都要注意预防器材的特殊处理器材的特殊处理 取材的器具用火焰灼烧过取材的器具用火焰灼烧过 标本尽早固定，固定剂可灭活部分标本尽早固定，固定剂可灭活部分RNARNA酶酶 所用玻璃器皿均须所用玻璃器皿均须0.10.1二乙基焦碳酸盐二乙基焦碳酸盐（DEPCDEPC）水）水浸泡（浸泡（37 37 ，

45、2h2h）,蒸馏水清洗，蒸馏水清洗，高压消毒去除高压消毒去除DEPCDEPC，然后，然后180180处理处理3h3h以上以上 塑料器材最好用灭菌的一次性用品。塑料器材最好用灭菌的一次性用品。0.10.1二乙基焦碳酸盐（二乙基焦碳酸盐（DEPCDEPC）水）水RNARNA酶抑制剂，有毒须去除酶抑制剂，有毒须去除器材的特殊处理器材的特殊处理 不适宜高温的可用新鲜配制的不适宜高温的可用新鲜配制的DEPCDEPC在室温在室温处理处理2 23h3h，再置于，再置于8585条件下干燥条件下干燥1h1h，使，使有毒的有毒的DEPCDEPC失活失活 所用所用试剂用试剂用DEPCDEPC水，终浓度水，终浓度0.

46、05%-0.1%0.05%-0.1%配配制制，配好后室温处理过夜或室温搅拌，配好后室温处理过夜或室温搅拌20min20min，然后高压消毒然后高压消毒 所用操作都要带所用操作都要带手套手套 玻片：玻片：热肥皂刷洗，自来水，清洁液中浸泡热肥皂刷洗，自来水，清洁液中浸泡24h24h，DEPCDEPC浸泡浸泡2h2h以上，以上，1803h1803h后，以去除任何后，以去除任何RNARNA酶。无尘存酶。无尘存放放 粘附剂粘附剂多聚赖氨酸、明胶；多聚赖氨酸、明胶；玻片硅化处理：玻片硅化处理：2%2%氨丙基三乙氧基硅烷（氨丙基三乙氧基硅烷（APESAPES）丙酮）丙酮液浸泡液浸泡3min,3min,丙酮洗

47、去丙酮洗去APESAPES，DEPCDEPC处理过的蒸馏水清洗。处理过的蒸馏水清洗。锡箔纸包裹无尘存放。锡箔纸包裹无尘存放。工作台等平时工作台等平时用手接触的地方用手接触的地方7070酒精或酒精或1010SDSSDS擦拭擦拭器材的特殊处理器材的特殊处理取取 材材 总的目的总的目的是既要充分保留被测核酸，（是既要充分保留被测核酸，（特别是特别是RNA）不被降解，又要尽可能维持原有组织或）不被降解，又要尽可能维持原有组织或细胞的形态结构。细胞的形态结构。基本要求基本要求与免疫组织化学技术相似，即与免疫组织化学技术相似，即组织要组织要求新鲜求新鲜和和迅速投入固定液迅速投入固定液。取材过程中避免手指、

48、唾液和未经取材过程中避免手指、唾液和未经RNA酶抑制酶抑制 处理的器具接触标本处理的器具接触标本 整个操作过程带手套和口罩。整个操作过程带手套和口罩。兼顾到三个方面：兼顾到三个方面：保持细胞结构保持细胞结构 最大限度保持细胞内核酸水平，最大限度保持细胞内核酸水平，DNA比较稳定，固定比较稳定，固定剂的种类和浓度并不十分重要，而剂的种类和浓度并不十分重要，而RNA容易降解，因容易降解，因此固定十分重要。此固定十分重要。使探针易于进入细胞或组织使探针易于进入细胞或组织 4%多聚甲醛多聚甲醛 2-6小时（培养细胞小时（培养细胞30分钟）分钟）常用固定剂：常用固定剂：多聚甲醛、多聚甲醛、醋酸醋酸-酒精

49、的混合液和酒精的混合液和Bouin固定剂固定剂 固固 定定组织样品储存组织样品储存储存：储存：所使用的容器、刀具等均经高压消毒或清洁后用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水清洗。为 防 止 R N A 迅 速 降 解，标 本 离 体 后，先 切 成1.51.2cm大小，其厚度不超过0.2cm，应迅速投入4 多聚甲醛溶液内，置4 冰箱内2-4小时。再将组织移入30 蔗糖PBS溶液内，4 冰箱内过夜。次日可将标本储存于-80 低温冰箱内保存。新鲜标本的储存新鲜标本的储存组织样品制备组织样品制备组织制片组织制片冷冻切片冷冻切片以厚以厚530um最佳。先将组织在最佳。先将组织在-20 恒冷切片机恒冷切片

50、机内停留内停留,待温度回升后，然后在恒冷冰冻切片机内切成待温度回升后，然后在恒冷冰冻切片机内切成7m薄片。薄片。切片贴在预先清洁、高温处理并涂以粘附剂的载玻片上切片贴在预先清洁、高温处理并涂以粘附剂的载玻片上40 烤箱内干燥切片烤箱内干燥切片2小时后储存在小时后储存在-80超低温冰箱内备超低温冰箱内备用。上述处理的切片在用。上述处理的切片在-20可保存周，在可保存周，在-70可保可保存数月之久存数月之久石蜡包埋切片石蜡包埋切片，应脱蜡经梯度酒精脱水。一般不提倡浸入，应脱蜡经梯度酒精脱水。一般不提倡浸入二甲苯溶液，如细胞内二甲苯溶液，如细胞内mRNA含量高时应用二甲苯脱蜡。含量高时应用二甲苯脱蜡