1、第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第一节第一节 细胞形态结构的观察方法细胞形态结构的观察方法第二节第二节 细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法第三节第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术细胞培养、细胞工程与显微操作技术第一节第一节 细胞形态结构的观察方法细胞形态结构的观察方法一、一、光学显微镜技术光学显微镜技术(light microscopy)二、二、电子显微镜技术电子显微镜技术(Electro microscopy)三、三、扫描遂道显微镜扫描遂道显微镜(Scanning tunneling microscope,STM)电子显微镜电子显微镜扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜光学
2、显微镜光学显微镜0.1nm1nm10nm100nm 1m100m1mm1cm10 m(一一)普通复式光学显微镜技术普通复式光学显微镜技术一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术光学显微镜的组成部分：光学显微镜的组成部分：照明系统，包括光源和聚光器；照明系统，包括光源和聚光器；光学放大系统，由物镜和目镜组成光学放大系统，由物镜和目镜组成机械装置，用于固定材料和观察方便。机械装置，用于固定材料和观察方便。光镜样本制作光镜样本制作:经过固定剂因定、包埋、经过固定剂因定、包埋、5m薄薄 切片、观察切片、观察常用的固定剂：甲醛等常用的固定剂：甲醛等常用的包埋剂：石蜡常用的包埋剂：石蜡分辨率：指区分开两个质点
3、间的最小距离。分辨率：指区分开两个质点间的最小距离。最大分辩率：最大分辩率：0.2m（二）相差和微分干涉显微镜技术（二）相差和微分干涉显微镜技术相差显微镜（相差显微镜（phase contrast microscope）：）：1932年年PZernike发明，发明，1953年年,诺贝尔物理奖。诺贝尔物理奖。最大特点：可以观察最大特点：可以观察未经染色的标本和活细胞未经染色的标本和活细胞。基本原理：把透过标本的可见光的光程差变成振幅基本原理：把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。变得清晰可见。相差显
4、微镜与普通光学显微镜不同之处：相差显微镜与普通光学显微镜不同之处：1.环形光阑环形光阑(annular diaphragm):位于光源与聚光器之位于光源与聚光器之间。间。作用作用:使透过聚光器的光线形成空心光锥使透过聚光器的光线形成空心光锥,焦聚到标本上。焦聚到标本上。2.相位板相位板(annular phaseplate):在物镜中加涂有氟化镁在物镜中加涂有氟化镁的相位板，将直射光或衍射光的相位推迟的相位板，将直射光或衍射光的相位推迟1/4。A+相板：相板：将直射光推迟将直射光推迟1/4，两组光波合轴后光波相，两组光波合轴后光波相 加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变加，振幅加大，标本结构
5、比周围介质更加变 亮，形成亮反差（或称负反差）。亮，形成亮反差（或称负反差）。B+相板：相板：将衍射光推迟将衍射光推迟1/4，两组光线合轴后光波相，两组光线合轴后光波相 减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），结构比周围介质更加变暗。结构比周围介质更加变暗。微分干涉显微镜（微分干涉显微镜（differential interference microscope）1952年，年，Nomarski发明，适于研究发明，适于研究活细胞中较大活细胞中较大的细胞器。的细胞器。优点优点:能显示结构的三维立体投影影像，立体感特能显示结构的三维立体投影影像，立体感特别强，
6、适合于显微操作别强，适合于显微操作(基因注入、核移植、转基基因注入、核移植、转基因因)。原理原理:利用两组平面偏振光的干涉，加强利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的影像的明暗效果明暗效果能显示结构的三维立体投能显示结构的三维立体投影。标本可厚一点，折射率差别更大，故影。标本可厚一点，折射率差别更大，故影像立体感更强。影像立体感更强。录像增差显微镜技术（录像增差显微镜技术（video-enhance microscopy）计算机辅助的计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下显微镜可在高分辨率下研究活细胞中的颗粒细胞器的运动。研究活细胞中的颗粒细胞器的运动。(三三)荧光显微镜技术荧光显微镜技术(Fl
7、uorescence Microscopy)原理与应用：原理与应用：利用较短波长的光使样品受到激火，产生较长利用较短波长的光使样品受到激火，产生较长 波长的荧光，可作观察和分辩样品中产生荧光波长的荧光，可作观察和分辩样品中产生荧光 物质的成分和位置。物质的成分和位置。包括：直接荧光标记技术包括：直接荧光标记技术;间接免疫荧光标记技术间接免疫荧光标记技术 在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性 定位：如绿色荧光蛋白定位：如绿色荧光蛋白(GFP)的应用的应用Singapores National Institute of Education UKUni
8、versity of Florida French SingaporeSouth Korea (四四)激光共焦扫描显微镜技术（激光共焦扫描显微镜技术（Laser Scanning Confocal Microscopy）原理与应用：原理与应用：利用共焦光路和激光扫描技术获取生物样品不同层利用共焦光路和激光扫描技术获取生物样品不同层面的图像，再通过计算机组合成三维重构的影像。面的图像，再通过计算机组合成三维重构的影像。排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率辨率(1.41.7(1.41.7倍倍)，可重构样品的三维结构。，可重构样品的三维结构。二
9、、二、电子显微镜技术电子显微镜技术（一）电子显微镜的基本知识（一）电子显微镜的基本知识（二）主要电镜制样技术（二）主要电镜制样技术（三）扫描电镜（三）扫描电镜 Scanning electron microscope，SEM Scanning probe microscope，SPM（一）（一）电子显微镜的基本知识电子显微镜的基本知识显微显微镜镜分辨分辨本领本领光源光源透镜透镜真空真空成像原理成像原理LMLM200nm200nm可见光可见光（400-700nm400-700nm）玻璃玻璃透镜透镜不要求真空不要求真空利用样品对光的吸收利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色形成明暗反差和颜色变化变化
10、TEMTEM0.2nm0.2nm电子束电子束（0.01-0.9nm0.01-0.9nm）电磁电磁透镜透镜1.33x101.33x10-5-51.33x101.33x10-3-3PaPa利用样品对电子的散利用样品对电子的散射和透射形成明暗反射和透射形成明暗反差差1.1.电镜与光镜的比较电镜与光镜的比较2.2.电镜与光镜光路图比较电镜与光镜光路图比较3.3.电子显微镜的基本结构电子显微镜的基本结构Figure:Early images of cells.(A)Drawings of a living plant cell(a hair cell from a Tradescantia flower
11、),observed dividing into two daughter cells over a period of 2.5 hours by Eduard Strasburger in 1880.(B)A comparable living cell photographed recently through a modern light microscope.(B,courtesy of Peter Hepler.)（二）主要电镜制样技术（二）主要电镜制样技术 超薄切片技术超薄切片技术(ultrathin section)：用于电镜：用于电镜观察的样本制备观察的样本制备。固定样品：锇酸
12、和戊二醛固定样品：锇酸和戊二醛包包 埋：环氧树脂，埋：环氧树脂，进进 样：以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片，样：以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片，切片厚度：切片厚度：4050nm，染染 色：采用重金属盐染色，以增大反差。色：采用重金属盐染色，以增大反差。负染色技术（负染色技术（Negative staining）：）：负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料
13、沉积，从而出现负染效果，凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达分辨力可达1.5nm左右。左右。AB冰冻蚀刻技术（冰冻蚀刻技术（Freeze etchingFreeze etching）冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。质颗粒和膜表面结构。膜质双分子膜质双分子层的疏水断层的疏水断铂铂碳碳快速冷冻深度蚀刻技术（快速冷冻深度蚀刻技术（quick freeze deep etching）特点：特点：富有立体感富有立体感不需包埋不需包埋不需固定不需固定保持样品的真实结构保持样品的真实结构主要用于观察胞质中的细胞
14、骨架纤维及其结合蛋白主要用于观察胞质中的细胞骨架纤维及其结合蛋白4.电镜三维重构技术电镜三维重构技术 电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结 合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。电镜三维重构技术与电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核射线晶体衍射技术及核 磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学 （Structural Biology）主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的 主要实验手段主要实验手段5.扫描电镜技术扫描电镜技术扫
15、描电镜扫描电镜(Scanning electron microscope，SEM)电子电子“探针探针”扫描，激发样品表面放出二次扫描，激发样品表面放出二次电电 子，探测器收集二次电子成象。子，探测器收集二次电子成象。CO2临界点干燥法防止引起样品变形的表面临界点干燥法防止引起样品变形的表面 张力问题张力问题三、三、扫描遂道显微镜扫描遂道显微镜 （Scanning tunneling Microscope,STM）(80(80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器年代发展起来的检测样品微观结构的仪器)包括：包括：SPMSPM、AFMAFM、磁力显微镜、摩擦力显微镜等磁力显微镜、摩擦力显微镜等原理：
16、扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼原理：扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，如量子力学中的隧道效应（隧道电流）、此间相互作用力，如量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等，并在计算机显示出来，从原子间作用力、磁力、摩擦力等，并在计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示系统。和数据采集、处理、显示系统。分辩率：分辩率：0.10.10.2nm;0.2nm;纵
17、分辩率：纵分辩率：0.001nm0.001nm1000g10min20000g20min80000g1h150000g1h*g=1.12rn210-5r:半径半径;n:每分种旋转数每分种旋转数(rpm)第二节细胞组分的分析方法第二节细胞组分的分析方法一、离心技术一、离心技术用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物蔗糖和甘油的最大密度为蔗糖和甘油的最大密度为1.3g/cm1.3g/cm3 3，所以只能用，所以只能用于分离在于分离在1.3g/cm1.3g/cm3 3以下的细胞器或细胞结构；而以下的细胞器或细胞结构；而CsClCsCl的最大密度可达的最大密度可
18、达1.9g/cm1.9g/cm3 3以上，可用于分离以上，可用于分离密度大于密度大于1.3g/cm1.3g/cm3 3的的DNADNA分子。分子。*在原理上在原理上,由于具有不同密度的颗粒随由于具有不同密度的颗粒随CsClCsCl密密度梯度的度梯度的形成重新分配形成重新分配，所以又称为浮力密度离，所以又称为浮力密度离心；而蔗糖和甘油则是在被离心的物质在下降的心；而蔗糖和甘油则是在被离心的物质在下降的过程中由于过程中由于密度的不同密度的不同而被阻止在不同的部位而被阻止在不同的部位,故是重力密度离心。故是重力密度离心。密度梯度离心密度梯度离心densitycentrifugation二、细胞内核酸
19、、蛋白质、酶、糖类与脂质等二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类与脂质等的显示方法（细胞化学法）的显示方法（细胞化学法）原理原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊：利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布与位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布与含量。含量。DNA分布：分布：Feulgen反应反应 原理：切片先用稀盐酸处理使原理：切片先用稀盐酸处理使DNA，分子中脱分子中脱氧核糖与嘌呤之间的连接键打开，形成醛基，再与氧核糖与嘌呤之间的连接键打开，形成醛基，再与Schi
20、ff 试剂作用使细胞核试剂作用使细胞核DNA显紫红色。显紫红色。*Schiff试剂：无色亚硫酸品红复合物试剂：无色亚硫酸品红复合物多糖的存在：多糖的存在：PAS（periodic acid Schiff reaction）原理：过碘酸的氧化作用先使糖分子的原理：过碘酸的氧化作用先使糖分子的乙二醇乙二醇基基 变为乙二醛基，后者继而与变为乙二醛基，后者继而与Schiff试剂结试剂结 合，形成紫红色反应产物。颜色反应的深合，形成紫红色反应产物。颜色反应的深 浅取决于组织内多糖的乙二醇分子的多寡。浅取决于组织内多糖的乙二醇分子的多寡。蛋白质的检测：蛋白质的检测：Million反应反应原理：氮汞试剂与组
21、织中的蛋白质侧链上的酪氨原理：氮汞试剂与组织中的蛋白质侧链上的酪氨 酸残基反应形成红色沉淀。酸残基反应形成红色沉淀。脂类脂类物质包括脂肪和类脂：脂类脂类物质包括脂肪和类脂：原理：标本用甲醛固定，冷冻切片，脂类保存较好。原理：标本用甲醛固定，冷冻切片，脂类保存较好。多用苏丹染料、油红多用苏丹染料、油红O、尼罗蓝等溶于脂类的染料染尼罗蓝等溶于脂类的染料染色，使脂质呈色。也可用四氧化锇（色，使脂质呈色。也可用四氧化锇（OSO4）染色，染色，脂肪酸或胆碱可使脂肪酸或胆碱可使OSO4还原为还原为OSO2而呈黑色。而呈黑色。三、特异蛋白抗原的定位与定性（免疫细胞化学）三、特异蛋白抗原的定位与定性（免疫细胞
22、化学）免疫荧光技术（免疫荧光技术（Immunofluorescence technique)：将免疫学方法与荧光标记技术相结：将免疫学方法与荧光标记技术相结合用来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。合用来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。特点：快速、灵敏、有特异性，但其分辨率特点：快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限。有限。蛋白电泳蛋白电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹反应与免疫印迹反应(Western-Blot)。Get one more technique molecular biological analysisSouthern hybridization免疫电镜技术：免疫电镜技术：免
23、疫铁蛋白技术免疫铁蛋白技术 免疫酶标技术免疫酶标技术 免疫胶体金技术免疫胶体金技术 应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等骨架蛋白的定位等体外培养的体外培养的BHK21细胞经选择性抽提细胞经选择性抽提后用抗后用抗Mr280103核骨架蛋白抗体进行核骨架蛋白抗体进行免疫胶体金标记的结果免疫胶体金标记的结果LYTUCell Biology四、细胞内特异核酸的定位与定性四、细胞内特异核酸的定位与定性原位杂交技术原位杂交技术：用标记的核酸探针通过分子杂交确定
24、特：用标记的核酸探针通过分子杂交确定特殊核苷酸序列要染色体上或细胞中的位置的方法称为原殊核苷酸序列要染色体上或细胞中的位置的方法称为原位杂交。位杂交。光镜水平的原位杂交技术（光镜水平的原位杂交技术（in situ hybridization (同位素标记或荧光素标记的探针）同位素标记或荧光素标记的探针）电镜水平的原位杂交技术（电镜水平的原位杂交技术（in situ hybridization）（生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）标记结合）PLETHORA proteins as dose-dependent master regula
25、tors of Arabidopsis root development 1、PCR技术技术 对于已知全部或部分核苷酸序列的基因对于已知全部或部分核苷酸序列的基因,可以通过可以通过聚合酶链反应聚合酶链反应(PCR),以基因组以基因组DNA或或cDNA模板扩模板扩增得到目的基因片段。增得到目的基因片段。PCR指数期指数期对对始模板始模板进行定量。进行定量。（2）TaqMan法法490nm荧光荧光供体供体（CFP）430nm激发光激发光受体受体（YEPYEP）受体受体（YEPYEP）490nm荧光荧光供体供体（CFP）430nm激发光激发光530nm黄色荧光黄色荧光FRET TaqMan法法Taq
26、酶有酶有53外切核酸酶活性，可水解探针外切核酸酶活性，可水解探针引物浓度：引物浓度：50-900nM探针浓度：探针浓度：50-250nM4、其他与常规、其他与常规PCR相同相同五、应用放射自显影技术研究生物大分子在细胞五、应用放射自显影技术研究生物大分子在细胞内的合成动态内的合成动态 利用放射性同位素的电离辐射对乳胶的感光利用放射性同位素的电离辐射对乳胶的感光 作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位 与半定位的一种细胞化学技术。与半定位的一种细胞化学技术。步骤步骤:同位素标记的生物大分子前体掺入；细胞内同位素标记的生物大分子前体掺入；细胞内 同位素所在位置
27、的显示。同位素所在位置的显示。六定量细胞化学分析技术六定量细胞化学分析技术 利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些 物质（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。物质（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。包括：紫外光显微分光光度测定法包括：紫外光显微分光光度测定法可见光显微分光光度测定法可见光显微分光光度测定法流式细胞仪（流式细胞仪（Flow Cytometry）主要应用：用于定量测定细胞中的主要应用：用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某或某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相细胞一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；从细胞群体中分
28、离某些特异染色的细胞；的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；分离分离DNA含量不同的中期染色体。含量不同的中期染色体。第三节细胞培养、细胞工程与显微操作系统第三节细胞培养、细胞工程与显微操作系统一、细胞培养一、细胞培养动物细胞培养类型：动物细胞培养类型：原代培养细胞原代培养细胞(primary culture cell)：取下细胞、取下细胞、组织的器官后立即进行培养组织的器官后立即进行培养(1-10代以内代以内)。传代培养细胞（传代培养细胞（sub-culture cell）：）：适应在体适应在体外培养的持续传代培养的细胞。外培养的持续传代培养的细胞。细胞株细胞株(cell strain
29、):正常二倍体，接触抑制正常二倍体，接触抑制细胞系细胞系(cell line):亚二倍体，接触抑制丧失，亚二倍体，接触抑制丧失，色体明色体明 显改变，容易传代培养。显改变，容易传代培养。常用的细胞系：常用的细胞系：Hela细胞系细胞系(子宫颈瘤细胞子宫颈瘤细胞)BHK21(Baby hamster kidney)CHO(chinese hamster ovary)*培养细胞一般不保持体内原有细胞形态，存在培养细胞一般不保持体内原有细胞形态，存在形态：形态：成纤维样细胞成纤维样细胞(fibroblast like cell)上皮样细胞上皮样细胞(epithelial like cell培养方法：
30、贴壁培养，悬浮培养培养方法：贴壁培养，悬浮培养原代培养的步骤：原代培养的步骤：取组织块，剪碎，消化分散细胞连接处取组织块，剪碎，消化分散细胞连接处(胰酶胰酶或或EDTA)，无菌、培养液中培养。无菌、培养液中培养。细胞系细胞系(Cell line)：在培养条件下可进行无限分在培养条件下可进行无限分裂的动物或植物细胞群。裂的动物或植物细胞群。细胞株细胞株(Cell strain):通过选择法或克隆形成法从通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特定性质或标原代培养物或细胞系中获得的具有特定性质或标志志(Marker)的培养物称为细胞株，细胞株的特定的培养物称为细胞株，细胞株的特定性质
31、功标志必须在整个培养期始终保持。性质功标志必须在整个培养期始终保持。贴壁培养贴壁培养:分散的细胞悬浮在培养瓶中很快分散的细胞悬浮在培养瓶中很快(几十分几十分中至几小时中至几小时)就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁，贴就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁，贴壁后的细胞形态形成多态，呈单层生长，所以此法壁后的细胞形态形成多态，呈单层生长，所以此法又叫单层细胞培养。单层培养的细胞保持接触抑制又叫单层细胞培养。单层培养的细胞保持接触抑制特性。特性。悬浮培养悬浮培养:悬浮培养的细胞在培养过程中不贴壁，悬浮培养的细胞在培养过程中不贴壁，一直悬浮在培养液中生长。如一直悬浮在培养液中生长。如T细胞的培养。悬浮细胞的培养。悬
32、浮培养条件较为复杂，难度也大一些，但是容易同时培养条件较为复杂，难度也大一些，但是容易同时获得大量的培养细胞。获得大量的培养细胞。w植物细胞植物细胞类型：单倍体细胞培养（花药培养）类型：单倍体细胞培养（花药培养）原生质体培养原生质体培养（体细胞培养）（体细胞培养）w非细胞体系（非细胞体系（cell-free system）LYTUCell Biology二、细胞工程二、细胞工程细胞分化的定向诱导：细胞分化的定向诱导：基因工程基因工程 组织工程组织工程细胞融合：细胞融合：杂种细胞杂种细胞 单克隆抗体单克隆抗体显微注射显微注射 克隆动物克隆动物2.细胞融合技术：脾细胞(B淋巴细胞)骨髓瘤细胞杂交瘤
33、细胞长命不分泌抗体分泌抗体短命分泌抗体长命(Khler和Milstein,Jerne)1984年Nobel生理学及医学奖脾细胞脾细胞(B淋巴细胞淋巴细胞)骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞脾细胞脾细胞/脾细胞脾细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞/骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞脾细胞脾细胞筛选出筛选出不能长期存活不能长期存活不能长期存活不能长期存活HAT培养基筛选原理培养基筛选原理内源性途径内源性途径(主要途径主要途径 谷氨酰胺谷氨酰胺 or单磷酸尿苷酸单磷酸尿苷酸外源性途径外源性途径(旁路途径旁路途径)(Hypoxanthine Guznine Phosphoribosyl Transf
34、erase)次嘌呤次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)胸腺嘧啶激酶胸腺嘧啶激酶(Thymidine kinase,TK)B淋巴细胞：淋巴细胞：HGPRT+，TK+骨髓瘤细胞：骨髓瘤细胞：HGPRT-，TK-存活存活死亡死亡外源性途径外源性途径(旁路途径旁路途径)浆细胞自浆细胞自发或诱发发或诱发突变突变脾脾B细胞用细胞用SRBC免疫免疫(注注射射X蛋白蛋白)不能在不能在HAT培养基培养基上生长的骨髓细胞上生长的骨髓细胞(带有带有X蛋白的抗体蛋白的抗体)细胞融合细胞融合转到转到HAT培养基上培养基上非融合细胞死亡非融合细胞死亡杂交瘤细胞生长杂交瘤细胞生长在多孔塑料板孔内培养
35、单个细胞在多孔塑料板孔内培养单个细胞(HAT培养液培养液)培养2周杂交瘤细胞可继续繁殖杂交瘤细胞可继续繁殖优良杂交瘤细胞优良杂交瘤细胞检测单克隆抗体接种动物接种动物,大量生大量生产单克隆抗体产单克隆抗体细胞大量培养罐大细胞大量培养罐大量生产克隆抗体量生产克隆抗体冷冻保藏淘汰不合格的细胞亲代死亡使用与蛋白质或脂质藕联的亲脂性或亲水性的使用与蛋白质或脂质藕联的亲脂性或亲水性的荧光分子荧光分子,如如GFP,LUC等等检测活体表面或细胞内部的分子运动以及各种检测活体表面或细胞内部的分子运动以及各种结构上分子动态变化率的大小。结构上分子动态变化率的大小。原理：利用高能量激光束的照射使特定区域的原理：利用
36、高能量激光束的照射使特定区域的荧光不可逆的猝灭。光漂白的恢复可通过非漂荧光不可逆的猝灭。光漂白的恢复可通过非漂白区的荧光分子在膜上或胞质中运动至光漂白白区的荧光分子在膜上或胞质中运动至光漂白区来完成。区来完成。一、荧光漂白恢复技术一、荧光漂白恢复技术(Fluorescence recovery after photobleaching,FRAP)第四节第四节 细胞及生物大分子的动态变化细胞及生物大分子的动态变化酵母双杂交系统应用酵母双杂交系统应用ADADPromoterRNA polymerseABCDNA-BindingDomainBait ProteinPrey ProteinTransc
37、riptionActivatingRegionReporter GeneDNA-Binding Site三、荧光共振能量转移技三、荧光共振能量转移技(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具离变化的有力工具,检测某一细胞中两个蛋白分子检测某一细胞中两个蛋白分子是否存在直接的相互作用。是否存在直接的相互作用。490nm荧光荧光供体供体（CFP）430nm激发光激发光受体受体（YEPYEP）受体受体（YEPYEP）490nm荧光荧光供体供体（CFP）430nm激发光激发光530nm黄色荧光黄色荧光FRET对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈
