1、第十章第十章 物理作图物理作图(physical mapping)物理作图物理作图:应用分子生物学技术直接将应用分子生物学技术直接将DNA分子标记、基因或克分子标记、基因或克隆标定在基因组的实际位置隆标定在基因组的实际位置物理图的距离物理图的距离:依作图方法而异依作图方法而异,辐射杂种作图的计算单位为辐射杂种作图的计算单位为厘镭厘镭(cR);限制性片段作图与克隆作图的图距单位为限制性片段作图与克隆作图的图距单位为碱基对碱基对(bp)物理作图的方法物理作图的方法 o 限制酶作图限制酶作图(Restriction Mapping)(Restriction Mapping)o 依靠克隆的基因组作图依
2、靠克隆的基因组作图(clone-based mapping)(clone-based mapping)o 荧光原位杂交荧光原位杂交(Fish,Fluorescent in situ (Fish,Fluorescent in situ hybridization)hybridization)o 序标位作图序标位作图 (STS(STS，Sequence taged site)Sequence taged site)1.限制性作图 它是将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置.其只能应用于较小的DNA分子,其上限取决于作图分子中限制酶位点的频率.通常采用的6碱基对识别顺序的限制酶仅适合50Kb以下
3、DNA分子的精确作图.1.1 限制酶作图限制酶作图(Restriction Mapping)基本原理基本原理1Kb EcoR I待检的待检的DNABamHI15Kb6Kb5Kb10Kb9KbEBBH H EH H H H E+BEB6KbEH 4KbEB 5KbBH 方法：n用两种限制酶中的种对DNA分子进行消化，产生片段的大小通过琼脂糖凝放电泳来检测。n第二种酶消化DNA分子，再用琼脂糖凝胶电泳检测片段大小。这些结果可以使我们弄清每种酶的限制位点数目，但切点之间的相对位置还不能确定。n将DNA分子用两种酶同时进行切割可以获得更多的信息。n作部分限制性酶解。这样会产生套更复杂的产物，除了完全消
4、化的，还含部分消化产物。通过测定一个不完全消化片段的大小，构造出正n确的图谱。n缺点 通常，部分限制酶消化为构建完整的图谱提供了必需的信息。如果有多个限制位点集中、这种分析方法就显得笨拙，因为要考虑的不同片段太多。改进方法：在部分消化前将放射性或其他类型的标记物加到要分析的DNA分子两端，结果很多部分限制酶消化产物成为不可见的，因为它们不含有末端片段，因此在琼脂糖凝胶上对标记物进行筛选时不会显现。我们可以利用“可见的”部分限制片段的大小，确定出那些未定位的切点与DNA分子末端的相对位置。限制因素n1.酶切位点的数目n2.限制酶作图的规模受限于限制片段的大小 50KB1.2 限制酶作图的改进n脉
5、冲凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis)n稀有切点限制图绘制 具有7个或8个核等酸识别序列的酶4096bp，16384BP，65536bpn 识别序列包含靶DNA中稀少基序的酶基因组明显缺少某些基序：例如，人类基因组中5GC3序列很稀少，这是因为人类细胞中含有一种酶，能够向这一序列中的胞嘧啶核苷的5位碳原于添加甲基基团，产生的5甲基胞嘧啶不稳定容易脱氨基产生胸腺嘧啶。nSma I 5CCCGGG 78n：5 GCGCGC3：390 kb频n：5GCCCGGCCGC3平均约每10Mb才有一个位点。2.1 大片段大片段DNA的克隆载体的克隆载体v YAC:YA
6、C:酵母人工染色体酵母人工染色体 230-1700Kb230-1700Kbv BAC:BAC:细菌人工染色体细菌人工染色体 300Kb300Kbv PAC:P1 PAC:P1人工染色体人工染色体 300Kb 300Kb v Fosmids:30Kb Fosmids:30Kb2.基于克隆的基因组作图2.2 重叠群组建n重叠群:相互重叠的DNA片段组成的物理图.n重叠群的组建方法 染色体步移法 指纹:系指确定DNA样品所具有的DNA片段;一个克隆的指纹表示了该克隆所具有的限定的顺序特征.常用的指纹分析方法:A 限制性带型(restriction patterns)指纹 B 重复顺序DNA指纹(re
7、petitive DNA fingerprints)C STS目录作图(STS content mapping)D 重复DNA PCR(repetitive DNA PCR)或分散重 复顺序PCR(interspersed repeat element PCR,IRE-PCR)指纹3.荧光原位杂交荧光原位杂交(Fish,Fluorescent in situ hybridization)将探针用荧光标记，与细胞分裂将探针用荧光标记，与细胞分裂中期的染色体杂交，用荧光显微中期的染色体杂交，用荧光显微镜观察信号所处的位置，将探针镜观察信号所处的位置，将探针标定在连锁图上。标定在连锁图上。染色体上的
8、杂交位点提供DNA探针序列的定位信息。应用该方法时，须打开维持染色体DNA螺旋结构。只有这样染色体DNA才能与探针杂交。变性染色体DNA而不破坏其形态的标准方法是将染色体干燥在玻璃载玻片上，再用甲酰胺处理。因为放射性标记很难同时满足灵敏度和分辨率这两个原位杂文成功的必要条件。因此，相隔1Mb才能作为分开的杂文信号被分辨出来机械伸展的染色体 通过改变从中期细胞核中分离染色体的方法而获得 离心产生的离心力可将将染色体伸展到正常长度的20倍。每条染色体仍能识别。这样，相隔200300KB的标记非中期染色体:间期 4.序标位作图序标位作图(STS,Sequence Taged Site)长度长度:10
9、0-500 bp序列已知序列已知,可以设计可以设计PCR反应反应单拷贝单拷贝,在染色体上的位置是唯一的在染色体上的位置是唯一的EST(Expressed sequence tag)大部分可以作大部分可以作STS4.1 STS作图原理条件n独一的STSnDNA片段群4.2 寻找STS的方法:n表达顺序标签(expressed sequence tag，EST)nSSLP（simple sequence length polymorphisrns，SSLPs）n随机基因组顺序EST1990年，Brenneer等首先提出人类基因组大规模cDNA测序计划以来，Adams等最先采纳并最早建立了表达序列标
10、记技术，他们随机挑选cDNA克隆进行单向、一步大规模测序，将所获得的部分cDNA序列称为。EST是一个cDNA克隆快速大规模测序后所获得的端和端部分cDNA随机片段，每个EST长度约200600bp,代表了一个单拷贝基因的部分cDNA表达序列。由于大多数的长度不足400bp,说明一个基因转录本的cDNA序列可能包含多个序列重叠的EST，由于一个基因mRNA剪接点不同可以获得多个cDNA克隆，因此EST既可能对应于一个cDNA的某一部分，又可能代表mRNA的不同剪接方式。n STS作图过程中所必需的第一个要素是可能获得研究的染色体或基因组的DNA片段群，这样的片段群有时也称为作图试剂n方法：放射
11、杂交体和克隆文库放射杂交体是指合有其他生物体染色体片段的啮齿类动物细胞4.3 用于STS 作图的DNA片段不能合成胸苷激酶(TK)或次黄嘌呤磷酸转移酶(HPRT)的缺陷性细胞从人体细胞中获得编码TK和HPRT基因的细胞4.3 STS的物理图定位n辐射杂种不能合成胸苷激酶(TK)或次黄嘌呤磷酸转移酶(HPRT)的缺陷性细胞从人体细胞中获得编码TK和HPRT基因的细胞培养基中添加次黄嘌呤、氨基蝶呤辐射杂种群PCR 检测STS标记，根据STS出现频率，判断标记是否连锁及连锁程度n克隆作图构建全基因组DNA 基因文库构建指定单一染色体的基因文库PCR检测STS分子标记根据重叠STS标记绘制克隆连锁图提取基因组DNA 流式细胞仪分离染色体打断 打断本章主要内容：n物理作图法n常用物理作图法有那几种n常用的指纹分析方法有哪些，它们的分析机理是什么
