1、本课内容本课内容蛋白质的产率问题蛋白质的产率问题蛋白质工程概要蛋白质工程概要蛋白质工程的应用实例蛋白质工程的应用实例蛋白质的产率问题蛋白质的产率问题 在基因工程菌株中，影响外源蛋白质产率的因素包在基因工程菌株中，影响外源蛋白质产率的因素包括载体相关因素和宿主相关的因素。括载体相关因素和宿主相关的因素。与载体有关的因素主要有：与载体有关的因素主要有：表达载体拷贝数的调控表达载体拷贝数的调控 启动子的强弱与转录调控启动子的强弱与转录调控 转录终止子的效应转录终止子的效应 密码子的使用频率密码子的使用频率 信号肽的特征与分泌调控信号肽的特征与分泌调控 影响产率的宿主因素主要有二：影响产率的宿主因素主
2、要有二：mRNAmRNA的稳定性；的稳定性；宿主的蛋白质降解系统。宿主的蛋白质降解系统。载体拷贝数载体拷贝数 通过调控基因拷贝数来提高外源基通过调控基因拷贝数来提高外源基因表达产量被称作因表达产量被称作基因的剂量效基因的剂量效应应，是一个对生产过程产生较大，是一个对生产过程产生较大影响的因素。影响的因素。在多数情况下可以理解为质粒拷贝在多数情况下可以理解为质粒拷贝数的多少，与数的多少，与oriori有关。在克隆实验有关。在克隆实验中常使用拷贝数中常使用拷贝数100100的多拷贝质粒。的多拷贝质粒。在以在以E.coliE.coli为宿主的生产中，常使为宿主的生产中，常使用可以根据培养温度调整拷贝
3、数的用可以根据培养温度调整拷贝数的runawayrunaway质粒（如质粒（如pCP3pCP3），），42 42 时时拷贝数最高可达几千个。拷贝数最高可达几千个。lacZampr复制起点复制起点ori启动子的强度启动子的强度 启动子的强度是指一个启动子能启动子的强度是指一个启动子能够多大程度地结合够多大程度地结合RNARNA聚合酶并聚合酶并引发转录过程。引发转录过程。原核基因的启动子主要包括原核基因的启动子主要包括-35-35和和-1010区，真核基因启动子则主要是区，真核基因启动子则主要是TATATATA盒与一些上游转录活化序列盒与一些上游转录活化序列UASUAS。这些序列被称作。这些序列被
4、称作顺式作用顺式作用元件元件（ciscis序列）。序列）。一般认为启动子的强度与一般认为启动子的强度与ciscis序列序列的最佳配置相关，在人工构建强的最佳配置相关，在人工构建强启动子时主要是尝试把不同基因启动子时主要是尝试把不同基因的启动子的的启动子的ciscis序列进行重组。序列进行重组。-35-10RNA 聚合酶原核基因启动子原核基因启动子UASTATARNA聚合酶真核基因启动子真核基因启动子启动子启动子 根据表达的方式可以把启动子分为两类：根据表达的方式可以把启动子分为两类：构成性表达启动子：持续表达构成性表达启动子：持续表达 诱导性表达启动子：只在诱导条件下表达。诱导性表达启动子：只
5、在诱导条件下表达。宿主宿主启动子启动子构成性表达构成性表达诱导表达诱导表达大肠杆菌大肠杆菌E.coliE.colilac,tac,ara pBAD,lac,tac,ara pBAD,P PL L,T7T7枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌蛋白酶、淀粉酶基因蛋白酶、淀粉酶基因的启动子的启动子酿酒酵母酿酒酵母S.cerevisiaeS.cerevisiaeADH1ADH1，TDH3TDH3GAL1GAL1，PHO5PHO5毕赤酵母毕赤酵母P.pastorisP.pastorisGAPGAPAOXAOX诱导性表达诱导性表达 强力启动子的优点是表达的蛋白质多，但是随着强力启动子的优点是表达的蛋白质多，但是随着m
6、RNAmRNA和蛋白质的大量合成与积累，反而会阻碍细和蛋白质的大量合成与积累，反而会阻碍细胞的生长，或激活宿主的蛋白质降解系统。胞的生长，或激活宿主的蛋白质降解系统。这都会造成目的蛋白产量的下降。如果目的蛋白对这都会造成目的蛋白产量的下降。如果目的蛋白对宿主细胞有毒性的话就更是如此。宿主细胞有毒性的话就更是如此。因此在实际生产中，更多使用的是那些仅在需要时因此在实际生产中，更多使用的是那些仅在需要时才进行强力表达的诱导性启动子。才进行强力表达的诱导性启动子。E.coliE.coli的诱导表达系统几乎全部是利用的诱导表达系统几乎全部是利用E.coli E.coli 来源来源的各种操纵子中的启动子
7、，如的各种操纵子中的启动子，如laclac启动子。启动子。E.coli E.coli 的乳糖操纵子的乳糖操纵子lac operonlac operon 乳糖操纵子包含启动子乳糖操纵子包含启动子P Placlac、操纵、操纵基因基因O O和和3 3个结构基因个结构基因lacZlacZ：-半乳糖苷酶半乳糖苷酶lacYlacY：-半乳糖苷透性酶半乳糖苷透性酶lacAlacA：-半乳糖苷转乙酰酶半乳糖苷转乙酰酶 操纵子上游的操纵子上游的lac I lac I 编码阻遏蛋白编码阻遏蛋白。lac Ylac Ylac Alac AO Olac Ilac Ilac Zlac ZP Placlac乳糖操纵子乳糖
8、操纵子调节基因调节基因启动子启动子操纵操纵基因基因P P 异乳糖与阻遏蛋白结合，导致其构象变化，异乳糖与阻遏蛋白结合，导致其构象变化，和和DNADNA的亲和性降低，不能与操纵基因的亲和性降低，不能与操纵基因O O结结合，对合，对P Placlac的阻遏被解除，的阻遏被解除，lac lac Z Z等基因的转等基因的转录得以进行。录得以进行。IPTGIPTG：异乳糖的类似物，可作为：异乳糖的类似物，可作为laclac启动子启动子的诱导物，其好处是不会被降解，使启动子的诱导物，其好处是不会被降解，使启动子一直被诱导。一直被诱导。阻遏蛋白阻遏蛋白乳糖乳糖,Lactose,Lactose转录转录lac
9、Ylac Ylac Alac AO Olac Ilac Ilac Zlac ZP PlaclacP PIPTGIPTG异乳糖异乳糖转录终止子转录终止子 从生产角度来说，不必要的长序列转录产物的生产从生产角度来说，不必要的长序列转录产物的生产会额外地耗费能量。会额外地耗费能量。当对特定基因进行强力表达时，转录可能会波及该当对特定基因进行强力表达时，转录可能会波及该基因的下游区域，既会给宿主带来额外负担，也会基因的下游区域，既会给宿主带来额外负担，也会使质粒的稳定性下降。使质粒的稳定性下降。因此为了提高生产性能，往往会在目的基因下游添因此为了提高生产性能，往往会在目的基因下游添加终止子序列。如加终
10、止子序列。如E.coliE.coli中的中的rRNArRNA基因基因rrnBrrnB的终止的终止子、子、T7T7噬菌体的终止子等。噬菌体的终止子等。目的基因目的基因SDSD启动子启动子终止子终止子密码子使用频率密码子使用频率 不同物种对各种密码子的使用频不同物种对各种密码子的使用频率不同，原因之一是细胞中各种率不同，原因之一是细胞中各种tRNAtRNA分子所占的比例不同。分子所占的比例不同。在工业水平的生产中，密码子的在工业水平的生产中，密码子的选择会明显地影响蛋白质的纯度选择会明显地影响蛋白质的纯度和产量。基因中如果高频率出现和产量。基因中如果高频率出现对应于少量对应于少量tRNAtRNA的
11、密码子，蛋白的密码子，蛋白产量会明显降低。产量会明显降低。因此一条重要的基因设计原则就因此一条重要的基因设计原则就是要选择是要选择最适密码子最适密码子：对应于最：对应于最多多tRNAtRNA分子的密码子。分子的密码子。GCA GCA GCG GCG GCC GCC GCU GCU丙氨酸的同义密码子丙氨酸的同义密码子tRNAtRNA信号肽与分泌生产信号肽与分泌生产 外源蛋白质在宿主菌中表达外源蛋白质在宿主菌中表达时可能会遇到细胞毒性问题，时可能会遇到细胞毒性问题，另一些蛋白则可能因过剩表另一些蛋白则可能因过剩表达而形成不溶性的包涵体。达而形成不溶性的包涵体。采用细胞外分泌的方法生产采用细胞外分泌
12、的方法生产是避免上述情况发生的有效是避免上述情况发生的有效手段。手段。分泌至细胞外的目的蛋白不分泌至细胞外的目的蛋白不仅可以正确折叠，而且表达仅可以正确折叠，而且表达量较高，并有利于分离与精量较高，并有利于分离与精制。制。乳酸克鲁维酵母乳酸克鲁维酵母信号肽信号肽 信号肽位于分泌蛋白质的信号肽位于分泌蛋白质的N-N-末端，由末端，由1530aa1530aa组成，组成，末端还存在一段可被信号肽酶切断的序列。如：酵末端还存在一段可被信号肽酶切断的序列。如：酵母蔗糖酶信号肽：母蔗糖酶信号肽：信号肽的重要性就在于它是蛋白质向细胞外分泌的信号肽的重要性就在于它是蛋白质向细胞外分泌的充分必要条件，因此研究人
13、员开发了一系列利用信充分必要条件，因此研究人员开发了一系列利用信号肽进行蛋白分泌表达的载体。号肽进行蛋白分泌表达的载体。细菌中细菌中B.subtilis B.subtilis 是理想的蛋白质分泌生产宿主，酵是理想的蛋白质分泌生产宿主，酵母母S.cerevisiaeS.cerevisiae、P.pastorisP.pastoris和曲霉属的霉菌则是比较和曲霉属的霉菌则是比较适合作分泌蛋白生产的真核生物宿主。适合作分泌蛋白生产的真核生物宿主。MLLQAFLLAGFAAKISA SN N宿主的蛋白降解系统宿主的蛋白降解系统 影响蛋白质表达量的一个重要的宿主因素是宿主本影响蛋白质表达量的一个重要的宿主
14、因素是宿主本身的蛋白酶的作用，应对的策略之一是寻找相应蛋身的蛋白酶的作用，应对的策略之一是寻找相应蛋白酶缺陷的突变株。白酶缺陷的突变株。如如E.coli BL21E.coli BL21（DE3DE3）是基因表达实验中最常与是基因表达实验中最常与pETpET系列质粒配合使用的宿主菌，系列质粒配合使用的宿主菌，B B株系天然缺失株系天然缺失lonlon蛋白酶（蛋白酶（K12K12有）。研究人员又向其引入了蛋白有）。研究人员又向其引入了蛋白酶酶OmpTOmpT的缺失突变，有利于提高蛋白产量。的缺失突变，有利于提高蛋白产量。另一种策略是将目的蛋白与其它已知蛋白（如另一种策略是将目的蛋白与其它已知蛋白（
15、如GSTGST，谷胱甘肽硫转移酶）通过谷胱甘肽硫转移酶）通过基因融合基因融合的方法进行融合的方法进行融合表达，也能适度避免目的蛋白质的降解。表达，也能适度避免目的蛋白质的降解。融合蛋白表达融合蛋白表达 蛋白质的在结构与功能上蛋白质的在结构与功能上都具有模块化的特点，其都具有模块化的特点，其结构域往往在结构和功能结构域往往在结构和功能上都有相当的独立性。上都有相当的独立性。这就使通过这就使通过DNADNA重组技术重组技术产生融合蛋白质成为可能。产生融合蛋白质成为可能。这种技术在实验室中也常这种技术在实验室中也常被用于目的蛋白的亲和层被用于目的蛋白的亲和层析纯化（例如：与析纯化（例如：与GSTGS
16、T、HisHis标签、标签、GFPGFP等蛋白融等蛋白融合）。合）。ORFORF基因融合基因融合基因基因A A基因基因B BORFORF转录转录mRNAmRNA翻译翻译融合蛋白融合蛋白amproriGST目的蛋白目的蛋白SDpT7pT7T7T7终止子终止子placT7 RNAT7 RNA聚合酶聚合酶IPTGIPTG宿主宿主E.coli BL21(DE3)E.coli BL21(DE3)染色体染色体表达载体表达载体T7 RNAT7 RNA聚合酶聚合酶 以融合蛋白形式进行表达的以融合蛋白形式进行表达的额外的好处是可以对目标蛋额外的好处是可以对目标蛋白进行亲和层析纯化，能大白进行亲和层析纯化，能大大
17、简化蛋白的纯化过程。大简化蛋白的纯化过程。融合蛋白的亲和层析法纯融合蛋白的亲和层析法纯化化树脂颗粒树脂颗粒GST谷胱甘肽，谷胱甘肽，GSHGSH谷胱甘肽硫转移酶谷胱甘肽硫转移酶GST目标蛋白目标蛋白GSTGST结合结合GST洗脱洗脱蛋白酶蛋白酶GST蛋白质工程蛋白质工程 随着科学家对蛋白质的结构与功能之间关系的认识随着科学家对蛋白质的结构与功能之间关系的认识更加深刻，到更加深刻，到19801980年前后科学家们已经可以根据不年前后科学家们已经可以根据不同的目的来设计和创造突变蛋白质分子。同的目的来设计和创造突变蛋白质分子。这种能够改变蛋白质的功能，或者设计和创造具有这种能够改变蛋白质的功能，或
18、者设计和创造具有某种功能的新蛋白的技术被称为某种功能的新蛋白的技术被称为蛋白质工程蛋白质工程。蛋白质工程的终极目标：蛋白质工程的终极目标：根据氨基酸序列正确预测蛋白质的结构与功能根据氨基酸序列正确预测蛋白质的结构与功能;使用天然或非天然氨基酸甚至化学合成的分子自由地使用天然或非天然氨基酸甚至化学合成的分子自由地创造具有期望结构和功能蛋白质。创造具有期望结构和功能蛋白质。蛋白质工程蛋白质工程 从实际应用来看，酶、抗体、受体、运输蛋白、信从实际应用来看，酶、抗体、受体、运输蛋白、信号转导蛋白、转录因子等均可以成为蛋白质工程的号转导蛋白、转录因子等均可以成为蛋白质工程的改造对象。改造对象。在目前，从
19、头设计具有全新的结构和生物功能的蛋在目前，从头设计具有全新的结构和生物功能的蛋白质分子相当困难，更多的工作是对现有蛋白质的白质分子相当困难，更多的工作是对现有蛋白质的改造。蛋白质改造的技术主要有：改造。蛋白质改造的技术主要有：随机突变法随机突变法定点突变法定点突变法DNA shufflingDNA shuffling非天然氨基酸导入非天然氨基酸导入基因融合基因融合蛋白质改造技术蛋白质改造技术 随机突变法随机突变法是创造在基因水平上的多样性的重要技是创造在基因水平上的多样性的重要技术，包括：术，包括：采用羟胺等化学试剂处理或采用羟胺等化学试剂处理或UVUV照射细胞进行人工诱变，照射细胞进行人工诱
20、变，然后选择表现型；然后选择表现型；利用利用DNADNA修复酶缺陷株；修复酶缺陷株；利用利用DNADNA聚合酶反应的底物特异性下降现象；聚合酶反应的底物特异性下降现象；全基因水平的人工合成将突变导入目的基因。全基因水平的人工合成将突变导入目的基因。易错易错PCRPCR（Error-prone PCRError-prone PCR）：）：PCRPCR中使用的中使用的Taq Taq DNADNA聚合酶本来就是一种错误率较高的聚合酶，聚合酶本来就是一种错误率较高的聚合酶，如果在体系中存在如果在体系中存在MnMn2+2+或或MgMg2+2+浓度异常，以及浓度异常，以及A A、G G、C C、T T中有
21、一种的浓度仅为通常的中有一种的浓度仅为通常的1/101/10，反应就，反应就更容易出错。更容易出错。蛋白质改造技术蛋白质改造技术 定点突变法定点突变法：针对编码某个蛋白质的基因，在特定：针对编码某个蛋白质的基因，在特定位点引入突变的方法。操作过程如下：位点引入突变的方法。操作过程如下：1.1.人工合成带有需引入的突变序列的寡核苷酸（突变引人工合成带有需引入的突变序列的寡核苷酸（突变引物，如：物，如：ValArgValArg）2.2.制备目标基因的单链制备目标基因的单链DNADNA模板模板3.3.使突变引物与使突变引物与DNADNA模板退火模板退火4.4.使用使用DNADNA聚合酶、连接酶一起合
22、成全长基因，引入聚合酶、连接酶一起合成全长基因，引入突变突变5.5.转化至转化至E.coliE.coli中，通过中，通过DNADNA测序确认突变是否成功。测序确认突变是否成功。定点突变法定点突变法 site-directed mutagenesissite-directed mutagenesis制作制作ssDNAssDNA质粒质粒人工合成突变引物人工合成突变引物DNADNA聚合酶聚合酶合成互补链合成互补链转化转化E.coliE.coli，挑选克隆，挑选克隆提取质粒提取质粒DNADNA，测序，测序PCRPCR定点突变法定点突变法第一轮第一轮PCRPCR混合两个混合两个PCRPCR产物，产物，变
23、性，退火变性，退火聚合酶合成聚合酶合成连接到克隆载体中，转化连接到克隆载体中，转化E.coliE.coli，挑选克隆，提取质粒，测序，挑选克隆，提取质粒，测序第一轮第一轮PCRPCRPCRPCR进一步扩增进一步扩增蛋白质改造技术蛋白质改造技术 DNA shufflingDNA shuffling：由：由StemmerStemmer等人所建立，作为一种等人所建立，作为一种基因重排的方法，主要步骤：基因重排的方法，主要步骤：针对某个蛋白质构建数个经过功能改良的突变基因针对某个蛋白质构建数个经过功能改良的突变基因 用用DNase IDNase I将这些将这些DNADNA随机切断，获得长度在随机切断，
24、获得长度在2050bp2050bp的片段的片段 将这些片段混合，进行无引物将这些片段混合，进行无引物PCRPCR 加入加入DNADNA连接酶，使连接酶，使DNADNA小片段重新连接，可能获得小片段重新连接，可能获得有价值的新组合有价值的新组合 通过合适的表型筛选系统进行选择通过合适的表型筛选系统进行选择 这种方法甚至能够改变酶分子的底物特异性，还可这种方法甚至能够改变酶分子的底物特异性，还可以实现酶的稳定性及催化活性的改良。以实现酶的稳定性及催化活性的改良。DNase I DNase I 随机切割随机切割混合这些片段，热变性，混合这些片段，热变性，退火（退火（shuffleshuffle）嵌合
25、体文库嵌合体文库DNADNA聚合酶，连接酶聚合酶，连接酶表型筛选表型筛选一组相关的基因一组相关的基因ReshuffleReshuffleDNA shufflingDNA shuffling蛋白质改造技术蛋白质改造技术 非天然氨基酸导入非天然氨基酸导入：将：将2020种氨基酸之外的氨基酸种氨基酸之外的氨基酸（如硝基苯丙氨酸）导入蛋白质分子中，可以赋予（如硝基苯丙氨酸）导入蛋白质分子中，可以赋予蛋白质全新的功能。蛋白质全新的功能。首先必须使一些遗传密码子对应于非天然氨基酸，首先必须使一些遗传密码子对应于非天然氨基酸，通常需要对常规的三联体密码子进行扩展，产生通常需要对常规的三联体密码子进行扩展，产
26、生四联体密码子四联体密码子，如，如CGGGCGGG。先将该序列导入目标先将该序列导入目标基因基因中想要导入该氨基酸的位中想要导入该氨基酸的位置，同时用置，同时用化学酰胺化化学酰胺化的方法得到该氨基酸的的方法得到该氨基酸的氨酰氨酰tRNAtRNA，使携带识别，使携带识别CGGGCGGG的反密码子的的反密码子的tRNAtRNA与非天然氨基酸结合。与非天然氨基酸结合。UCGUCGAGC AGC ACC AGC AGC ACC SerSermRNAmRNAtRNAtRNAAGC CGGG ACC AGC CGGG ACC mRNAmRNAGCCCGCCC硝基苯丙氨酸硝基苯丙氨酸(化学酰胺化法）化学酰胺
27、化法）在体外无细胞翻译体在体外无细胞翻译体系中进行蛋白质合成系中进行蛋白质合成蛋白质改造技术蛋白质改造技术 将上述氨酰将上述氨酰tRNAtRNA与目标基因的与目标基因的mRNAmRNA分子共同添分子共同添加到无细胞翻译体系中，就可以获得想要的蛋白质。加到无细胞翻译体系中，就可以获得想要的蛋白质。使用多种四联体密码子，可将使用多种四联体密码子，可将2 2种以上的非天然氨种以上的非天然氨基酸分别导入蛋白质分子中特定的位点。基酸分别导入蛋白质分子中特定的位点。这种技术存在的问题主要有：这种技术存在的问题主要有：因为使用无细胞翻译系统，所以蛋白产量低因为使用无细胞翻译系统，所以蛋白产量低 氨酰基氨酰基
28、tRNAtRNA的制备过程复杂的制备过程复杂 导入非天然氨基酸后的蛋白质发生变性、失活等导入非天然氨基酸后的蛋白质发生变性、失活等洗涤剂用酶洗涤剂用酶 洗涤剂用酶是洗涤剂中不可或缺洗涤剂用酶是洗涤剂中不可或缺的成分，常添加的酶包括蛋白酶、的成分，常添加的酶包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。其市场需求淀粉酶、脂肪酶等。其市场需求量在不断增加。量在不断增加。在各种酶制剂联合使用以提高洗在各种酶制剂联合使用以提高洗涤效果的同时，科研人员也致力涤效果的同时，科研人员也致力于通过蛋白质工程手段改善每种于通过蛋白质工程手段改善每种酶的功能。酶的功能。蛋白酶蛋白酶：蛋白酶是洗涤剂中最重：蛋白酶是洗涤剂中最重要、
29、使用量最大的酶制剂。要、使用量最大的酶制剂。洗涤剂用酶洗涤剂用酶 在长期保存的过程中，洗涤剂中的漂白成分会引起在长期保存的过程中，洗涤剂中的漂白成分会引起酶的失活，可能是由于位于活性中心附近的酶的失活，可能是由于位于活性中心附近的MetMet被被氧化所引起。氧化所引起。如果把该如果把该MetMet替换为其他氨基酸，可以提高酶分子替换为其他氨基酸，可以提高酶分子的抗氧化性能。的抗氧化性能。例如：来源于芽孢杆菌的一种碱性蛋白酶，将其例如：来源于芽孢杆菌的一种碱性蛋白酶，将其Met222Met222替换为替换为AlaAla后，经后，经100mM H100mM H2 2O O2 2处理处理15min1
30、5min后残后残余活力由野生型的余活力由野生型的30%30%提高到提高到70%70%。（诺维信。（诺维信NovozymesNovozymes的产品的产品EsperaseEsperase。）。）洗涤剂用酶洗涤剂用酶 低温蛋白酶低温蛋白酶的开发：对的开发：对B.clausii B.clausii 来源的蛋白酶来源的蛋白酶savinasesavinase的基因进行定点或随机突变，构建在芽孢杆的基因进行定点或随机突变，构建在芽孢杆菌中的基因表达文库。菌中的基因表达文库。筛选：将菌体溶液移入筛选：将菌体溶液移入9696孔板，进行低温条件下的孔板，进行低温条件下的酶促反应。获得的突变型酶在酶促反应。获得的
31、突变型酶在1515时的洗涤效果有时的洗涤效果有显著提高（显著提高（KannaseKannase，NovozymesNovozymes，19971997）。）。淀粉酶淀粉酶：大量用于餐具的自动化清洗。来源于：大量用于餐具的自动化清洗。来源于B.B.licheniformis licheniformis 的的-淀粉酶性能优良，但是不抗氧化剂。淀粉酶性能优良，但是不抗氧化剂。突变突变Met197AlaMet197Ala使其抗氧化性能显著增强，在加漂使其抗氧化性能显著增强，在加漂白剂的洗涤剂中五星期后仍保持白剂的洗涤剂中五星期后仍保持90%90%以上的活力。以上的活力。（PurastarPurasta
32、r，Genencor IncGenencor Inc）NovozymeNovozyme诺维信公司诺维信公司 诺维信是一家丹麦的生物技术公司，主要进行酶制诺维信是一家丹麦的生物技术公司，主要进行酶制剂、微生物制剂和生物医药成分的研发与生产。剂、微生物制剂和生物医药成分的研发与生产。20132013年占据全球酶制剂市场的年占据全球酶制剂市场的48%48%，是最大的工业，是最大的工业用酶制剂的生产商。目前有用酶制剂的生产商。目前有700700多种产品，遍及全多种产品，遍及全球球130130个国家。个国家。诺维信诺维信19921992年开始进入中国，目前投资总额超过年开始进入中国，目前投资总额超过5
33、5亿美元。机构包括亿美元。机构包括4 4 家工厂，家工厂，2 2 家分公司，家分公司，1 1 家创新家创新与发展中心，员工总数超过与发展中心，员工总数超过10001000名。名。工业生产用酶工业生产用酶 核酸类化合物核酸类化合物5 5-IMP-IMP和和5 5-GMP-GMP是制作是制作鲜味调味品的原料，工业规模化生产鲜味调味品的原料，工业规模化生产这些核苷酸的方法之一就是用酶法对这些核苷酸的方法之一就是用酶法对发酵产生的核苷进行磷酸化。发酵产生的核苷进行磷酸化。许多微生物可以利用无机磷酸对核苷许多微生物可以利用无机磷酸对核苷进行磷酸化，化学反应如下：进行磷酸化，化学反应如下：具有调味作用的只
34、有具有调味作用的只有5 5-核苷酸，所以核苷酸，所以先筛选能以焦磷酸为磷酸供体，特异先筛选能以焦磷酸为磷酸供体，特异性地对核苷的性地对核苷的5 5 OHOH进行磷酸化的菌株，进行磷酸化的菌株，成功找到了数个属于肠细菌科的菌株。成功找到了数个属于肠细菌科的菌株。核苷核苷 +PPi 5+PPi 5-核苷酸核苷酸+Pi+Pi工业生产用酶工业生产用酶 然后选择然后选择5 5-核苷酸产量最高的菌株核苷酸产量最高的菌株Morganella Morganella morgniimorgnii，克隆了其核苷磷酸化酶基因，并进行了酶，克隆了其核苷磷酸化酶基因，并进行了酶学研究，发现其有两种活性：学研究，发现其有
35、两种活性：核苷磷酸化酶活性：核苷磷酸化酶活性：磷酸酶活性：磷酸酶活性：要想使其适于核苷酸的工业生产，必须提高其磷酸要想使其适于核苷酸的工业生产，必须提高其磷酸化酶活性，同时抑制其磷酸酶活性。化酶活性，同时抑制其磷酸酶活性。改造步骤：改造步骤：PCRPCR法引入随机突变，从表达突变酶的重组菌中筛选法引入随机突变，从表达突变酶的重组菌中筛选5 5-核苷酸合成能力高的菌株核苷酸合成能力高的菌株次黄苷次黄苷 +PPi 5+PPi 5-IMP+Pi-IMP+Pi5 5-IMP+H-IMP+H2 2O O 次黄苷次黄苷 +Pi+Pi工业生产用酶工业生产用酶 在两轮随机突变后科研人员获得了生产性能有大幅提高
36、在两轮随机突变后科研人员获得了生产性能有大幅提高的菌株，其中的酶发生了的菌株，其中的酶发生了Gly92AspGly92Asp和和Ile171ThrIle171Thr的突变；的突变；突变型酶与野生型相比，与次黄嘌呤核苷的亲和性明显突变型酶与野生型相比，与次黄嘌呤核苷的亲和性明显加强，加强，5 5-IMP-IMP的生产性能大幅提高，而且的生产性能大幅提高，而且IMPIMP的水解也的水解也受到抑制。受到抑制。生成的核苷酸只有生成的核苷酸只有5 5-核苷酸，没有核苷酸，没有2 2-、3 3-核苷酸副产物。核苷酸副产物。此外，该酶的底物特异性广泛，适用于各种此外，该酶的底物特异性广泛，适用于各种5 5-
37、核苷酸的核苷酸的生产。生产。工业生产用酶工业生产用酶 进一步，研究人员对进一步，研究人员对Escherichia Escherichia blattae blattae 来源的这种酶进行了结晶和来源的这种酶进行了结晶和结构解析。结构解析。根据结构信息，对一些位点进行根据结构信息，对一些位点进行了定点突变，如了定点突变，如Ser90PheSer90Phe的突变，的突变，使酶对次黄苷的使酶对次黄苷的KmKm下降下降60%60%，大，大幅提高了酶的反应能力。幅提高了酶的反应能力。经过一系列的研究之后，最终确经过一系列的研究之后，最终确立了新型的酶法核酸鲜味调味品立了新型的酶法核酸鲜味调味品的工业生产
38、技术，并于的工业生产技术，并于20032003年开年开始投入生产（味之素株式会社）。始投入生产（味之素株式会社）。1D2T1D2T味之素味之素 日本日本味之素公司是拥有百年历史的全球十大食品企味之素公司是拥有百年历史的全球十大食品企业之一，业之一，是世界上最大的氨基酸供应商之一是世界上最大的氨基酸供应商之一。产品产品涉及食品、药品等多个领域涉及食品、药品等多个领域。味之素不但生产赖氨酸，而且苏氨酸、色氨酸的生味之素不但生产赖氨酸，而且苏氨酸、色氨酸的生产量在世界上都是最大的。在氨基酸领域处于领导产量在世界上都是最大的。在氨基酸领域处于领导者地位的味之素集团，运用最先进的独创技术，广者地位的味之
39、素集团，运用最先进的独创技术，广泛地开发了氨基酸的用途。泛地开发了氨基酸的用途。味之素已在中国建立味之素已在中国建立1818家公司，业务涉及调味品、家公司，业务涉及调味品、加工食品、医药加工食品、医药/工业用工业用/饲料氨基酸等。当前味之饲料氨基酸等。当前味之素在中国的核心业务围绕调味品及加工食品展开。素在中国的核心业务围绕调味品及加工食品展开。临床诊断用酶临床诊断用酶 在现代医学中，医生要作出准确的诊断，往往需要在现代医学中，医生要作出准确的诊断，往往需要检测病人的各种代谢物在体液中的水平（血液、尿检测病人的各种代谢物在体液中的水平（血液、尿液）。液）。酶是一种十分理想的诊断试剂，利用酶试剂
40、构建的酶是一种十分理想的诊断试剂，利用酶试剂构建的检测系统能充分发挥酶促反应特异性强、反应时间检测系统能充分发挥酶促反应特异性强、反应时间短的优势，简便、快速、准确。短的优势，简便、快速、准确。现在的诊断试剂从便捷角度出发多以液体试剂盒为现在的诊断试剂从便捷角度出发多以液体试剂盒为主，这对酶的性能要求甚为严格。酶的高纯度精制主，这对酶的性能要求甚为严格。酶的高纯度精制是必须的，并且在液体试剂中长期保存的稳定性也是必须的，并且在液体试剂中长期保存的稳定性也十分重要。十分重要。临床诊断用酶临床诊断用酶 胆固醇氧化酶胆固醇氧化酶ChoAChoA：链霉菌：链霉菌StreptomycesStreptom
41、yces来源的来源的ChoAChoA的底物亲和性优异（的底物亲和性优异（Km=13Km=13 MM），非常适合），非常适合于胆固醇的检测。于胆固醇的检测。但是该酶的稳定性不高，且在弱碱环境下活性较低。但是该酶的稳定性不高，且在弱碱环境下活性较低。科学家通过对其立体结构的模拟，有目的地构建了科学家通过对其立体结构的模拟，有目的地构建了其突变体文库，并筛选热稳定性提高的突变体。其突变体文库，并筛选热稳定性提高的突变体。最终选定了一种双突变体：最终选定了一种双突变体：V145EV145E，S103TS103T，其热，其热稳定性和在弱碱性环境中的活性都有明显改善。其稳定性和在弱碱性环境中的活性都有明显
42、改善。其工业生产已经获得成功，被广泛用于各种胆固醇诊工业生产已经获得成功，被广泛用于各种胆固醇诊断试剂。断试剂。踏实，奋斗，坚持，专业，努力成就未来。22.11.2322.11.23Wednesday,November 23,2022弄虚作假要不得，踏实肯干第一名。14:25:4514:25:4514:2511/23/2022 2:25:45 PM安全象只弓，不拉它就松，要想保安全，常把弓弦绷。22.11.2314:25:4514:25Nov-2223-Nov-22重于泰山，轻于鸿毛。14:25:4514:25:4514:25Wednesday,November 23,2022不可麻痹大意，要
43、防微杜渐。22.11.2322.11.2314:25:4514:25:45November 23,2022加强自身建设，增强个人的休养。2022年11月23日下午2时25分22.11.2322.11.23追求卓越，让自己更好，向上而生。2022年11月23日星期三下午2时25分45秒14:25:4522.11.23严格把控质量关，让生产更加有保障。2022年11月下午2时25分22.11.2314:25November 23,2022重规矩，严要求，少危险。2022年11月23日星期三14时25分45秒14:25:4523 November 2022好的事情马上就会到来，一切都是最好的安排。下午2时25分45秒下午2时25分14:25:4522.11.23每天都是美好的一天，新的一天开启。22.11.2322.11.2314:2514:25:4514:25:45Nov-22务实，奋斗，成就，成功。2022年11月23日星期三14时25分45秒Wednesday,November 23,2022抓住每一次机会不能轻易流失，这样我们才能真正强大。22.11.232022年11月23日星期三14时25分45秒22.11.23谢谢大家！谢谢大家！
