1、食品中毒素的检测2011级生物技术第三组 美味的外表之下深藏着毒素一 常见的动物性天然毒素动物肝脏中的毒素河豚毒素岩蛤毒素螺类毒素组胺1 动物肝脏中的毒素 大家对动物肝脏的认识也许仅仅是美味和含维生素A可以治疗夜盲症。动物中主要的毒素有胆酸，牛磺胆酸和脱氧胆酸。他们都是中枢神经系统的抑制剂,其中牛磺胆酸的毒素最强。脱氧胆酸对结肠癌，直肠癌的发生有促进作用。所以食用过多或食用时处理不当，都会对身体造成伤害。2 河豚毒素 河豚鱼是一种味道鲜美却含剧毒的鱼类。它的肝脏，皮肤，血液等都有剧毒，其中卵和卵巢的毒性最大。河豚鱼中毒是世界上最严重的动物性食物中毒。3 岩蛤毒素 它的毒素源于一些属于膝勾藻科的
2、藻类，这种藻类大量繁殖可引起赤潮。摄食这种藻类，他所含的岩蛤毒素及膝勾藻毒素一无毒状态积累在肠腺中，当摄食蛤肉后，毒素被释放出来。4 螺类毒素 绝大多数食用安全性较高，但少数种类含有有毒物质。5 组胺 组胺属于生物碱，易溶于水，是由于鱼体内的游离组氨酸在鱼中存放过程经脱胺而形成的。组胺中毒大多由于食用不新鲜或腐败变质的鱼类引起的。它能在弱碱条件下，与偶氮反应生成橙色物，从而被定性和定量检测。二、常见的植物性天然毒素 1氰苷 氰苷进人体内水解后产生HC，从而具有较强的毒性。含有氰苷的食源性植物有木薯、豆类以及一些果树的种子如杏仁、桃仁、枇杷仁及亚麻仁等。氰化物在酸性条件下可产生HCN气体，HCN
3、可使苦味酸试纸显红色，据此可对含有氰苷的物质进行定性检测。2红细胞凝集素 这是一类对红细胞具有凝集作用的蛋白质，多为糖蛋白。含有红细胞凝集素的食源性植物有蓖麻、豆类及花生的种子。不同植物的红细胞凝集素其毒性是不同的，以蓖麻凝集素的毒性最强，红细胞凝集素比较耐热，80数小时不能使之失活，100需经过1 h可完全破坏其活性。3皂苷 也称皂素，很多豆科植物如黄豆、菜豆、蚕豆等不仅含有红细胞凝集素、氰苷，还含有有毒的皂苷。其中菜豆中毒是天然食物中毒中较常见的。菜豆中的毒皂苷对消化道粘膜有强烈的刺激作用。4龙葵碱 龙葵碱又名茄碱、马铃薯毒素、龙葵毒素，不溶于水，能溶于乙醇，与稀酸共热可发生分解。龙葵碱广
4、泛存在于马铃薯、番茄及茄子等中。马铃薯中龙葵碱的含量一般在0.13050.01，且随着贮存时间的增加而渐增，发芽的马铃薯其幼芽及芽眼部分的含量可高达0.30.5。人摄人0.20.4 g龙葵碱即可引起中毒。5秋水仙碱 秋水仙碱是鲜黄花菜(也称金针菜)中的一种生物碱，其本身无毒，但当它进人人体后会转化成一种剧毒物质：二秋水仙碱，后者对胃肠道、泌尿系统、神经系统等具有毒性。成人一次摄人0.10.2 mg秋水仙碱可引起中毒，摄入320mg可致死。食用鲜黄花菜时一定要用开水焯，浸泡后，再经充分烹饪，以防中毒。食用干黄花菜较安全。6棉酚 棉酚系萘的衍生物，在结构上有醛、烯醇及醌式三种同分异构体。溶于中等极
5、性的有机溶剂，不溶于水及己烷等。棉酚对心、肝、肾及神经系统、生殖系统均有毒性。棉酚在棉籽中的含量为0.150.28，冷榨棉籽油中可高达l1.3，因此不可食用冷榨棉籽油或毛棉籽油。7毒蘑菇 毒蘑菇所含有的有毒成分可分为生物碱类、肽类及其他化合物，根据中毒的症状可分为胃肠毒素、神经精神毒素、血液毒素、原浆毒素和其他毒素五类。磨菇毒素的检验常用纸层析法或薄层层析法。食品中毒素的检测 挥发性盐基氮的检测 水产品中组胺的测定 棉籽油中棉酚含量的检测 马铃薯毒素的检测 黄曲霉素B1的检测（一）挥发性（一）挥发性盐基氮的检测盐基氮的检测 挥发性盐基氮，是动物性食品在腐败过程中，由细菌酶的作用使蛋白质分解而形
6、成的物质，此类物质属带碱性的含氮物质，故也称碱性总氮（TVBN），主要包括氨及少量伯胺和叔胺等，均具有挥发性。TVBN与动物性食品腐败程度之间有明确的对应关系，常用于判定食品的新鲜程度和确定食品质量的好坏。TVBN的检测方法有半微量定氮法和微量扩散法。1、半微量定氮法 原理：样品浸提液在弱碱性（MgO）条件下，碱性含氮物质游离并被蒸馏出来，用标准酸溶液滴定计算含量。仪器与试剂 仪器：半微量凯氏定氮器 试剂：氧化镁混悬液（10%/L）：城区1.0g氧化镁，加100mL水，振摇成混悬液；硼酸吸收液（20g/L）0.010mol/LHCl标准液；混合指示剂（2g/L甲基红-乙醇指示液与1g/L次甲基
7、蓝指示剂，临用时等量混合）。实验步骤 试样处理：将试样除去脂肪、骨或鳞等非食用部分后，绞碎拌匀，称取约10.0g，置于锥形瓶中，加100mL水，不时振摇，浸渍30min后过滤备用。蒸馏滴定：装好半微量凯氏定氮器，将盛有10mL硼酸吸收液及56滴混合指示剂的锥形瓶置于冷凝管下端，并使端口处于液面以下。准确吸收5.0mL上述滤液于蒸馏器反应室内，加5mL氧化镁混悬液，迅速盖塞，并用水封口，通入蒸汽，蒸馏5min后停止。吸收液用盐酸标准溶液滴定至蓝紫色为终点，同时做试剂空白。注意事项 样品浸渍液可用多层纱布过滤除渣，如过滤液不马上使用，应放冰箱保存。按GB27331996鲜、冻动物性水产品卫生标准要
8、求，海水鱼类挥发性盐基氮含量应低于30mg/100g，淡水鱼类，鲜（冻）禽肉应低于20mg/100g（GB2710）。2、微量扩散法 原理：挥发性含氮物质可在37碱性溶液中释放出，挥发后被硼酸吸收液吸收，用标准酸溶液滴定，计算含量。仪器与试剂 仪器：微量扩散皿（标准型）。试剂：饱和碳酸钾溶液：称取50g碳酸钾，加50mL水，微加热助溶，使用上清液；水溶性胶：称取10g阿拉伯胶，加10mL水、5mL甘油、5g无水碳酸钾（或无水碳酸钠），研磨均匀。其与试剂同半微量定氮法。实验步骤 将水溶性胶涂于扩散皿的边缘，在皿中央内室加入1mL硼酸吸收液及1滴混和指示剂，在皿外室一侧加入1.00mL样品滤液，另
9、一侧加1mL饱和碳酸钾溶液，注意勿使两液接触，立即盖好。将密封后的扩散皿于桌面上轻轻转动，使样液与碱液混合，置37恒温箱内放置2h，揭开盖后用0.010mol/L盐酸标准溶液滴至终点，同时做空白试剂。式中符号意义同半微量测定法。（二）水产品中组胺的测定（二）水产品中组胺的测定1.原理鱼体中的组胺用正戊醇提取，遇偶氮试剂显橙色，与标准系列比较定量。2.试剂 正戊醇 碳酸钠溶液（50g/L）三氯乙酸溶液（100g/L）氢氧化钠溶液（250g/L）等试剂3.实验步骤（1）样品处理称取510g绞碎并混合均匀的试样，置于具塞锥形瓶中，加入15.020.0mL三氯乙酸溶液，浸泡23h，过滤。吸取2.0mL
10、滤液，置于分液漏斗中，加氢氧化钠溶液使呈碱性。每次加入3mL正戊醇，振摇5min，提取3次，合并正戊醇提取液于分液漏斗中，每次加3mL盐酸溶液（1+11）振摇提取3次，合并盐酸提取液并稀释至10.0mL，备用。（2）测定吸取2.0mL盐酸提取液于10mL比色管中。另吸取0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL组胺标准使用液（相当于0mg、4mg、8mg、12mg、16mg、20mg组胺），分别置于10mL比色管中，加水至1mL，再各加1mL溶液（1+11）。试样及标准试管各加3mL碳酸钠溶液、3mL偶氮试剂，加水至刻度，混匀，放置10min后用1cm比
11、色杯以零管调节零点，于480nm波长处测吸光度。绘制标准曲线比较，或与标准系列目测比较。（3）计算结果 100100102102v2mm21X式中X样品中组胺含量，mg/100gV加入三氯乙酸溶液的体积，mLm1由标准曲线查得样品溶液中组胺的含量，gm2 样品质量，g（三）棉籽油中棉酚含量的检测（三）棉籽油中棉酚含量的检测 我国种植的棉花属于陆地棉及草棉,棉籽中常含有0.15%2.8%游离棉酚.冷榨棉籽油时,大部分棉酚转入棉籽油中,可高达1%3%.食用冷榨棉籽油或毛棉籽油,极易引起中毒.棉籽油中含有0.02%游离棉酚对动物健康无影响,0.05%以上时对动物有危害,国标规定,棉籽油中游离棉酚=0
12、.02.紫外分光光度法原理:样品中游离棉酚经用丙酮提取后,在378nm有最大吸收，其吸收值与棉酚量在一定范围内成正比，与标准系列比较定量。试剂与仪器:仪器：紫外分光光度计试剂:a.丙酮70：将350mL丙酮加水至500mLb.配制棉酚标准使用液：吸取棉酚标准溶液5.0，置于100容量瓶中，加70丙酮稀释至刻度，此溶液每毫升相当于50.0g棉酚。主要分析步骤提取：称取1.00三级棉籽油置于100具塞锥形瓶中，加入20.070丙酮,并加入玻璃珠粒，在电动振荡器上振荡，然后在冰箱中放置过夜.上清液，过滤。标准系列制备：吸取 0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 棉酚标准使用液（相当
13、于5,10,15,20,25,30g棉酚）,分别置于具塞试管中，各加70丙酮至10，密塞混匀，静置10min。测定吸光值:取滤液及标准溶液于1cm玻璃比色杯中，以70丙酮溶液调节零点，于378nm波长处测吸光度,绘制标准曲线比较。结果计算X=式中 X-试样中游离酚棉的含量，g/100g m1-样品管中游离酚棉的质量,g m2-试样质量,g.苯胺法苯胺法1 仪器：分光光度计2 试剂：苯胺（A.R.）丙酮70%：同上；棉酚标准溶液：同上；乙醇（95%）实验步骤：称取1.0试样置于150具塞锥形瓶中，加入20mL丙酮,玻璃珠粒,剧烈震动1小时，在冰箱中过夜,过滤，滤液备用.在两支25mL具塞比色管中
14、，各加入2mL上述滤液，以甲管为试样管，乙管为对照管，另吸取、0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0棉酚标准使用液（相当于0.0、5.0、10.0、20.0、40.0、50.0g棉酚）各两份，分别置于甲乙两组25mL具塞比色管中，各管均加入丙酮至2mL，甲组标准管与试样管甲管各加入3mL苯胺，在80度水浴中加热15min,取出冷至室温，各加入乙醇至25mL，乙组标准管与试样管乙管各加入乙醇至25mL。两组溶液再加乙醇后均放15min，以甲组的零管为试剂空白，以一组的零管为溶剂空白，用1cm比色杯，在波长445nm处，测定两组的吸光度，以两组对应的吸光度之差，与相应标准浓度绘制标
15、准曲线，以试样甲管与乙管的吸光度之差从标准曲线从标准曲线查出棉酚含量。计算结果:X=式中 X-试样中游离酚棉的含量,g/100g m1-样品管中游离酚棉的质量,g m2-试样质量，g.实验要求:精密度要求在重复条件下获得的两次独立测定的结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%.（四）、马铃薯毒素的检测（四）、马铃薯毒素的检测龙葵碱对胃肠道粘膜有较强刺激性和腐蚀性，对中枢神经有麻痹作用，对红细胞有溶血作用。其中毒作用主要是通过抑制胆碱酯酶的活性而引起的。测定龙葵碱含量的方法主要是比色法1原理 龙葵碱不溶于水、乙醚、氯仿，但能溶于乙醇。龙葵碱在稀硫酸中与甲醛溶液作用生成橙红色化合物，与520nm波
16、长下比色测定。2仪器与试剂A 仪器：匀浆机、离心机、旋转蒸发器、721分光光度计B 试剂：龙葵碱标准溶液（精确称取0.1000g龙葵碱，以1%硫酸溶液溶解并定容至100ml，此溶液中龙葵碱浓度为1mg/mL）3实验步骤A 样品提取a 称取捣碎的马铃薯样品20g于匀浆器中，加100mL 95%乙醇，匀浆3min。b 将匀浆离心10min(4000 r/min)取上清液，残渣用20mL乙醇洗涤两次，合并上清液。将上清液浓缩至干。用5%硫酸溶液溶解残渣，过滤后将滤液用氨水调至中性，再加12滴浓氨水调PH至1010.4，在80C水浴中加热5min，冷却后至冰箱中过夜，目的是使龙葵碱沉淀完全。C 离心弃
17、去上清液，以1%氨水洗至无色透明，将残渣用1%硫酸溶液溶解并定容至10mL，此为龙胆碱提取液。B标准曲线制作 用龙葵碱储藏液配成100ug/mL浓度的标准使用液，分别吸取0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL龙葵碱标准使用液相当于0ug、10ug、20ug、30ug、40ug、50ug龙葵碱于10mL比色管中，用1%硫酸溶液补足至2mL，在冰浴中各滴加浓硫酸5mL，摇匀。静置3分钟，然后在冰浴中滴加1%甲醛溶液3mL。静置90分钟，于520nm波长下测吸光度，绘制标准曲线。C样品测定 吸取样品龙葵碱提取液2mL于10mL比色管中，按标准曲线制作方法，测定其吸光度。D
18、 结果计算 龙葵碱含量(mg/100g)=m1xv1x100 2x1000 vM1-由标准曲线查得的龙葵碱的量ug M-样品质量gV1-测定时吸取样品提取液的体积mLV-样品提取后定容总体积mL（五）五）黄曲霉素黄曲霉素B1的检测的检测黄曲霉毒素（AFT）是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。黄曲霉毒素是主要由黄曲霉（aspergillus flavus)）寄生曲霉（a.parasiticus)）产生的次生代谢产物，在湿热地区食品和饲料中出现黄曲霉毒素的机率最高。黄曲霉毒素主要有B1,B2,G1,G2 以及另外两种代谢产物M1,M2.其中M1 和M2是从牛奶中分离出来的.B1
19、,B2,G1,G2,M1 和 M2 在分子结构上十分接近.其中B1是最危险的致癌物，经常在玉米，花生，棉花种子，一些干果中常能检测到。它们在紫外线照射下能产生荧光，根据荧光颜色不同，将其分为B族和G族两大类及其衍生物。AFT目前已发现20余种。AFT主要污染粮油食品、动植物食品等；如花生、玉米，大米、小麦、豆类、坚果类、肉类、乳及乳制品、水产品等均有黄曲霉毒素污染。其中以花生和玉米污染最严重。家庭自制发酵食品也能检出黄曲霉毒素，尤其是高温高湿地区的粮油及制品种检出率更高。1.薄层层析的原理样品中AFT B1经有机溶剂提取、净化、浓缩并经薄层色谱分离后，在波长365nm紫外光下产生荧光，根据其在
20、薄层板上显示荧光的强度与标准品AFT B1最低检出量产生的荧光强度比较来测定样品中AFT B1的含量。2.仪器和试剂（1）仪器：玻璃板：520cm 涂布器 色谱展开槽（2564cm）紫外光灯：100-125W，带有波长365nm滤光片微量注射器：20uL,10uL各一支（2）试剂：三氯甲烷（AR）正己烷（AR 沸程30-60）或石油醚（沸程60-90）甲醇（AR）苯 （AR）乙腈（AR）无水乙醚（AR）丙酮 （AR）（以上试剂应重蒸，并应经检验对薄层色谱测定无干扰）苯-乙腈(98:2)混合溶液 甲醇-水（55:45）混合溶液 三氟乙酸（AR）氯化钠（AR）无水硫酸钠（AR）硅胶G（薄层色谱用）
21、5%次氯酸钠溶液3.黄曲霉素B1标准液（1）黄曲霉素B1标准储备液用百万分之一的微量分析天平精密称取1-1.2mgAFT B1标准品，先加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀释至100mL，避光置于4冰箱中保存。使用前用紫外分光光度计测定其浓度，再用苯-乙腈混合溶液调整其浓度为10ug/mL。（在350nm测定AFT B1的苯-乙腈溶液的吸光度，其摩尔消光系数为19800，可根据朗伯-比尔定律求出其浓度）（2）黄曲霉素B1标准使用液黄曲霉毒素B1标准应用液I（1ug/mL）：吸取1.0mL10ug/mL的黄曲霉毒素B1标准贮备液于10mL容量瓶中，加苯-乙腈混合溶液定容。黄曲霉毒素B1标准应用液II（
22、0.2ug/mL）：吸取1.0mL 1ug/mL的黄曲霉毒素B1标准应用液I于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合溶液定容。黄曲霉毒素B1标准应用液III(0.04ug/mL)：吸取1.0mL 0.2ug/mL的黄曲霉毒素B1标准应用液II于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液定容。（3）配制：取100g漂白粉，加入500ml水，搅拌均匀。另将80g工业用碳酸钠溶于500ml温水中。将两液合并、搅拌、澄清、过滤。此液含次氯酸25g/L。4.测定方法（1）单项展开法A.薄板制备:称取3g硅胶G，加2-3倍量的水，研磨1-2min呈糊状后倒入涂布器推成5，厚度约.的薄层板块，在空气中干燥，在摄氏度活化，取出
23、，放干燥器中保藏，55第一点：，标准使用液（.）。第二点：样液。第三点：样液.标准使用液。第四点：样液标准使用液。展开与观察展开槽内加无水乙醚，预展，取出挥干，再于另一端开槽内加丙酮三滤甲烷（），展开，取出，在紫外光下观察。点样：将薄板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板下端的基线上用微量注射器或血红素吸管滴加样液。确证试验为确认薄层样上样液荧光系由黄曲霉素产生的，加滴三氟乙酸，的衍生物，展开后此衍生物的比移值在.左右。与薄层板左边依次滴加两个点。第一点：，标准使用液（.）第二点：样液于以上两点各加一小滴三氟乙酸盖于其，反应后用吹分机吹热风，再于薄层板上滴加以下两点。第三点：标准使用液。第四点：样
24、液。按上法展开并观察，样液是否产生与标准点相同的衍生物。未加三氟乙酸的三，四两点，可依次作为标准与标准的衍生物空白对照。稀释定量：样液中的AFTB1荧光点的荧光强度，如与AFTB1 标准点最低检出量的荧光强度一致，则样品中含量即为滴加试样如下：第一点：，标准使用液（.）第二点：根据情况滴加样液。第三点：根据情况滴加样液。第四点：根据情况滴加样液。结果计算.样品中的含量，加入苯一乙腈混合物的体积，出现最低荧光时滴加样液的体积，样液的总稀释倍数，加入苯一乙腈混合物溶解时相当样品的质量，.的最低检出限量，G注意事项本法灵敏度较高，容易产生误差。AFTB1标准储备液应密封于具塞试管中，在4摄氏度避光保
25、存。如果在保存期间体积明显减少，应及时补充溶剂。3 .AFT是一种剧毒和强致癌性物质，因此，在使用时特别注意安全保护。如实验室应佩戴口罩，配标准液时应戴乳胶手套。（2）双向展开法A 原理：如用单向展开法后，薄层色谱由于杂质干扰掩盖了AFTB1的荧光强度，需采用双向展开法。薄层板先用无水乙醚做横向展开，将干扰的杂质展至样液点的一边，而AFTB1不动，然后再用丙酮-三氯甲烷（8+92）做纵向展开，样品在相应处的杂质底色大量减少，因而提高了方法的灵明度。B.操作步骤：a.点样:取薄层板三块,在距下端3cm基线上，在距左边缘0.81cm处，各滴加10lAFTB1(0.04)标准液，在距左边缘2.83c
26、m处各滴加20l样液；然后在第二板的样液点上加滴10l AFTB1(0.04)标准液；在第三板上的样液点上加滴10AFTB1(0.04)标准液。b.展开：横向展开：在展开槽内的长边置一玻璃支架，加10mL无水乙醇，将上述点好的薄层板靠标准点的长边置于展开槽内展开，展至板端后，取出挥干。纵向展开：挥干的薄层板以丙酮-三氯甲烷（8:92）展开至1012cm为止。丙酮与氯甲烷的比例，根据不同条件自行调节。C:观察与评定结果：a.在紫外光下观察第一，二块板，若第二块板在AFTB1标准点的相应处出现最低检出量，而第一板与第二板的相同位置上未出现荧光，则样品中AFTB1含量5ug/Kg.b.若第一块板与第二块板的相同位置上出现荧光点，则将第一块板与第三块板比较，这第三块板上第二点与第一块板上第二点的相同位置上的荧光点是否与AFTB1标准点重叠，若果重叠，在进行确证实验。D:确认实验E：稀释定量：若样品中AFTB1含量较高，可按单向展开法中稀释定量操作。若AFTB1含量较低，稀释倍数小，在定量的纵向展开板上仍有杂质干扰，影响判断结果，可将样液在做双向展开法测定，已确定含量。F：结果计算：同单向展开法G:注意事项：用过后受污染的玻璃器皿，应经次氯酸溶液（25g/L）浸泡消毒后再清洗。
