1、实验四实验四（一）免疫标记技术（一）免疫标记技术 1、酶联免疫吸附试验、酶联免疫吸附试验(双抗体夹心法双抗体夹心法)2、斑点免疫层析试验、斑点免疫层析试验（二）免疫细胞功能测定（二）免疫细胞功能测定 1、E玫瑰花环试验（示教）玫瑰花环试验（示教）2、淋巴细胞转化试验（示教）、淋巴细胞转化试验（示教）（三）豚鼠过敏试验（录像）（三）豚鼠过敏试验（录像）（一）1、酶联免疫吸附试验（ELISA）待检标本待检标本 阴性对照阴性对照 空白对照空白对照 （样品稀释液（样品稀释液100ul）“ELISA双抗体夹心法”，第5步，最后5孔，加待检标本2孔、阴性对照1孔、空白对照（样品稀释液）2孔，每孔100ul
2、，37，30分钟：8 9 10 11 12（一）1、酶联免疫吸附试验（ELISA）“ELISA双抗体夹心法”，第5步，1-7孔加不同稀释度（浓度）TNF-标准品，每孔100ul，37，30分钟：TNF-100ul 100 稀释液 100 100 100 100 100 100弃去弃去100 100ul 100 100 100 100 TNF-1000 500 250 125 62.5 31.25 15.625 浓度(pg/ml)1 2 3 4 5 6 7 (倍比稀释)“ELISA双抗体夹心法”，第5步，1-7孔加不同浓度TNF-标准品；后5孔加待检标本2孔、阴性对照1孔、空白对照（样品稀释液）
3、2孔；每孔100ul，37，30分钟：1.TNF 100l 100 2 稀释液稀释液 100 100 100 100 100 100弃去100 100ul 100 100 100 100 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 121000 500 250 125 62.5 31.25 15.625 TNF-(pg/ml)待检标本待检标本 阴性对照阴性对照 空白对照空白对照（一）1、酶联免疫吸附试验（ELISA）（一）免疫标记技术（一）免疫标记技术【概念或原理概念或原理】：利用荧光素、酶、胶体金、发光物质以及放射性核素等易显示物（标记物）连接于已知抗体或抗原，再去检测待测标本中的相应抗
4、原或抗体的量或其存在与否。优点：高度的敏感性和优点：高度的敏感性和特异性，简便、快速，可作定性、定量或定位测定。特异性，简便、快速，可作定性、定量或定位测定。【分类分类】荧光免疫技术 酶免疫技术ELISA（双抗体夹心法双抗体夹心法）放射免疫技术 金免疫技术斑点免疫层析试验斑点免疫层析试验 化学发光免疫技术等 Ag Ab 荧光素荧光素AgAb荧光素荧光素 Ab 荧光素荧光素（？）（？）Ab荧光素荧光素（洗涤）免疫标记技术举例：（细胞表面可见荧光）7 cells with fluorescencetubercle bacillus with fluorescence10 酶免疫组化技术：组织（或细
5、胞）中抗原定位 酶免疫测定(如ELISA)：测液体标本中抗原或抗体ELISA(酶联免疫吸附试验，enzyme-linked immunosorbent assay)sandwich ELISA to detect Ag indirect ELISA to detect Ab competitive ELISA to detect Ag or Ab （一）免疫标记技术免疫标记技术 1、酶联免疫吸附试验(ELISA)酶免疫技术 1 1）已知抗体包被）已知抗体包被 2 2）洗板）洗板 3 3）加待检抗原标本）加待检抗原标本 4 4）洗板）洗板 5 5）加酶标记抗体）加酶标记抗体 6 6）洗板）洗板
6、7 7）加底物显色，测定）加底物显色，测定 (measure color)（显色）（显色）（不显色）（不显色）（定量）（定量）(no Ag)(Ag)polystyreneSandwich ELISA(to detect Ag,双抗体夹心法，原理)（封闭的意义）（封闭的意义）（一）免疫标记技术免疫标记技术 1、酶联免疫吸附试验(ELISA)-双抗体夹心法 请按照实验指导讲义方法进行操作，第5-11步；第5、7步孵育时间由60min改为30min 第5步按下页PPT的图加样，加12个孔，37，30分钟，（实验课开始时已做，接着做第6步，洗板）结果，作标准曲线，计算待检标本TNF-浓度“ELISA双
7、抗体夹心法”，第5步，1-7孔加不同浓度TNF-标准品；后5孔加待检标本2孔、阴性对照1孔、空白对照（样品稀释液）2孔；每孔100ul，37，30分钟：1.TNF 100l 100 2 稀释液稀释液 100 100 100 100 100 100弃去100 100ul 100 100 100 100 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 121000 500 250 125 62.5 31.25 15.625 TNF-(pg/ml)待检标本待检标本 阴性对照阴性对照 空白对照空白对照（一）1、酶联免疫吸附试验（ELISA）5.加待检标本：1-7孔加不同浓度TNF-标准品；后5孔加待检
8、标本2孔、阴性对照1孔、空白对照（样品稀释液）2孔；每孔100ul，37，30分钟。6.弃去酶标板内液体，按步骤2洗板三次。7.每孔加100l酶标记抗TNF单克隆抗体，置37湿盒30min。8.弃去酶标板内液体，按步骤2洗板三次。9.每孔加底物溶液100l，37避光孵育15min。10.每孔加终止液一滴（约50l），终止反应。11.观察显色反应，酶标仪在490nm处测定每孔OD值。12.作标准曲线，计算待检标本TNF-浓度。【线性关系式：log(concentration)=a*log(OD)+b】EXCEL2007绘制标准曲线步骤：输入相应数据；选中相应数据；在上方工具栏里选插入散点图，并选
9、中第一个类型的散点图；（得到下图：）选中插入的散点图，在工具栏里的图表布局里选中第三行最后一个；选中后可得到如下图表：线性关系式：log(concentration)=1.607*log(OD)+2.602，根据两样品孔平均OD值计算待检标本TNF-浓度。作浓度和OD值的关系图：线性关系式：concentration=699*OD-208.9，根据两复孔平均OD值计算待检标本TNF-浓度。22A 96-well microtiter plate.This plate could be used for ELISA 23(Indirect ELISA to detect Ab)24（一）（一）2
10、、斑点免疫层析试验、斑点免疫层析试验(dot gold immunochromatographic assay，DICA)the rapid tests that you might use to detect pregnancy,or diagnose an infection quickly in a doctors office.B C T R A(Nitrocellulose membrane)金标抗体（免疫金复合物）（小鼠金标抗体（免疫金复合物）（小鼠IgG）（抗）（抗HCG）特异性抗原（特异性抗原（HCG，绒毛膜促性腺激素），绒毛膜促性腺激素）固相特异性抗体（抗固相特异性抗体（抗H
11、CG）固相抗小鼠固相抗小鼠IgG抗体抗体 阳性：阳性：T区、区、R（或（或C）区均出现）区均出现红色线条（两条红线）；红色线条（两条红线）；阴性：阴性：T区不出现红色线条，仅区不出现红色线条，仅R（或（或C）区出现红色线条（一条红）区出现红色线条（一条红线）。线）。positive negative invalid（一）（一）2、斑点免疫层析试验、斑点免疫层析试验 请按照实验指导讲义方法进行操请按照实验指导讲义方法进行操作，并判断结果，作，并判断结果，（二）免疫细胞功能测定 1 1、E E花环试验花环试验 原理：T细胞表面有绵羊红细胞受体（E受体）(CD2)，若T细胞与绵羊红细胞共同孵育，T细
12、胞周围吸附绵羊红细胞，为花环形成细胞，可用来鉴定和计数T细胞 T细胞 SRBC 花环形成细胞 B细胞 SRBC（6080）CD2 E 花环形成率=形成E花环细胞数形成E花环细胞 +未形成花环淋巴细胞100%(6080%)E 花环形成率=形成E花环细胞数形成E花环细胞数 +未形成花环细胞数100%总E花形成率：6080%活性E花形成率：2540%rosette forming cellT cellrosette forming cellrosette forming cellsrosette forming cell(electron microscope)显微镜下观察花环形成细胞，310室，不
13、要求计算E花环形成率。（二）2、淋巴细胞转化试验 PHAT淋巴细胞（小细胞）淋巴母细胞 T cell lymphoblast(small cell)(large cell)B cell resting B cell(small cell)(Untransformed lymphocytes)(transformed lymphocytes)(转化的淋巴细胞)(未转化的淋巴细胞)PHAPHA 转化率=转化的淋巴细胞数转化的淋巴细胞数 +未转化的淋巴细胞数100%T cells T cells +B cells100%（6080%）过渡型细胞核分裂相细胞 转化的淋巴细胞转化的淋巴细胞包括以下三种细
14、胞：（1）淋巴母细胞淋巴母细胞：体积明显增大，为成熟淋巴细胞的34倍。核膜清晰，核染色质疏松，呈细网状。核内见明显核仁14。胞浆丰富，嗜碱性，有伪足样突出。胞浆内有时可见小空泡。（2）过渡型淋巴细胞过渡型淋巴细胞：具有上述淋巴母细胞的某些特征。核质疏松，可见核仁，胞浆增多，嗜碱性强。体积比小淋巴细胞大。（3）核分裂相细胞核分裂相细胞：核呈有丝分裂，可见许多对成堆或散在的染色体。Lymphoblast(morphological features):Lymphoblasts are 12-20 m in diameter with a round to oval nucleus,sometime
15、s eccentric in location.The nucleus to cytoplasm ratio is about 4:1 and the periphery of both the nucleus and the cell may be irregular in outline.The fine,highly dispersed nuclear chromatin stains a light reddish-purple,and one or two pale blue or colorless large nucleoli are visible.The cytoplasm
16、is usually agranular and deeply to moderately basophilic,with marginal(peripheral)intensity a common characteristic.(Small resting lymphocytes are 6-8 m in diameter)47 Small lymphocytes transformed lymphocytes (lymphoblasts,large cells)mitosis metaphase(Ag or mitogen)stimulation untransformed lympho
17、cyte,small transitional cell typical lymphoblast untransformed lymphocyteLymphoblast,(transformed lymphocyte)Acute lymphocytic leukemiaLymphoblast,原始淋巴细胞Lymphoblast,原始淋巴细胞核仁核仁图1 狗外周血中的淋巴母细胞图2（大图）、狗急性淋巴细胞性白血病血片，可见大量淋巴母细胞。图3（小图）、外周血涂片，成熟小淋巴细胞mature lymphocytes,small celllymphocyte 显微镜下观察典型淋巴母细胞，不要求计算淋
18、巴细胞转化率。（三）豚鼠过敏试验（录像）（三）豚鼠过敏试验（录像）（三）豚鼠过敏试验（三）豚鼠过敏试验 （属（属型超敏反应）型超敏反应）（也称速发型超敏反应（也称速发型超敏反应）type hypersensitivity or immediate hypersensitivity 免疫应答体液免疫细胞免疫（TH、Tc）IgE IgG、IgM、IgA细胞Ag 可溶性Ag 型 (细胞毒型)(细胞溶解型)型 (IC型）(血管炎型)型(速发型)型(迟发型)各种变应原变应原初次机体（过敏体质）IgEIgE吸附于肥大细胞或嗜碱粒表面(FcR)（致敏阶段）变应原再次变应原与细胞表面IgE结合桥联反应细胞脱颗粒，释放生物活性介质和新合成介质（组胺，LT，PGD2等）毛细血管通透性增加，平滑肌收缩，腺体分泌增加全身（过敏性休克）（青霉素、血清）呼吸道（哮喘、变应性鼻炎）消化道（过敏性胃肠炎）皮肤（荨麻疹）发 敏 阶 段效应阶段免疫应答degranulation IgEFceRIallergeninflammationresting mast cell5min after activation60 min after activation返回
