1、Contents第一节第一节 细菌学检验基础细菌学检验基础1第二节第二节 免疫学检验基础免疫学检验基础2第三节第三节 分子生物学基础分子生物学基础3第一节节 细细菌学检验学检验基础础一、无菌技术术（一）什么么是无菌技术术（二）无菌环环境1、无菌室2、超净净工作台（三）无菌器材（四）无菌操作2、进入无菌室前的准备3、检验检验操作过过程的无菌操作要求无菌操作菌操作 取菌技巧取菌技巧 11.1.接种环前端铂接种环前端铂丝部分以酒精灯丝部分以酒精灯烧红灭菌，后端烧红灭菌，后端铁棒部分过火铁棒部分过火2.试管前端过火3.打开试管盖（塞）无菌操作菌操作 取菌技巧取菌技巧 14.试管倾斜，放入接种环无菌操作
2、无菌操作 取菌技巧取菌技巧 15.试管前端过火，盖上试管盖6.接种环烧红灭菌无菌操作菌操作 取菌技巧取菌技巧 12.自自 Plate 上取单一菌上取单一菌落落(方法一：盖子微开方法一：盖子微开遮住培养基，避免空遮住培养基，避免空气中菌体掉入气中菌体掉入)(方法二：plate 反面拿起)无菌操作 取菌技巧 21.挤出吸球挤出吸球内空气，插内空气，插上灭过菌的上灭过菌的玻璃吸管玻璃吸管2.向上為吸，向下為放无菌操作菌操作 取菌技巧取菌技巧 31.调整微量加样器 刻度(吸取范围 200 1000l)2.插上灭过菌的插上灭过菌的 Tip(用力插紧用力插紧)无菌操作 取菌技巧 43.按钮压至第一段（按钮
3、压至第一段（不可压至最底）不可压至最底）4.深入液面下深入液面下 2 4 mm无菌操作菌操作 取菌技巧取菌技巧 45.慢慢释放按钮，即可慢慢释放按钮，即可 吸取液体吸取液体无菌操作菌操作 取菌技巧取菌技巧 41.试管前端过火2.打开试管盖无菌操作菌操作 接菌技巧接菌技巧方法一：以接接种环种环沾菌，放入新的培养基中接菌方法三：以方法三：以Pipetman 吸取吸取菌液，按钮压至菌液，按钮压至最底排出菌液最底排出菌液方法二：以方法二：以安安全吸球全吸球吸取菌吸取菌液，放入新的培液，放入新的培养基中，向下排养基中，向下排出菌液出菌液无菌操作菌操作 接菌技巧接菌技巧无菌操作斜面接种时的无菌操作斜面接种
4、时的无菌操作(1)接种灭菌接种灭菌(2)开启棉塞开启棉塞(3)管口灭菌管口灭菌(4)挑起菌苔挑起菌苔(5)接种接种(6)塞好棉塞塞好棉塞操作时离酒精灯外操作时离酒精灯外焰区太远焰区太远试管直放，空气中菌体容易掉入无菌操作无菌操作 错误示范错误示范无菌操作 错误示范吸球倒放，菌液容易流入吸球內安全吸球随意放置桌面，菌安全吸球随意放置桌面，菌液容易流出至桌上液容易流出至桌上无菌操作 错误示范微量加样器微量加样器 倒放，菌液倒放，菌液容易流入微量加样器容易流入微量加样器 內內注意事項 生物性废弃物生物性廢棄物生物性廢棄物放至正确位置以便灭菌二、微生物的接种与分离技术二、微生物的接种与分离技术（一）接
5、种种、接种种工具和方法接种和分离工具接种和分离工具2.常用的接种方法有以下几种：常用的接种方法有以下几种：(二二)分离纯化分离纯化.倾注平板法倾注平板法.涂布平板法涂布平板法倾注平板法（倾注平板法（a）涂布平板法（）涂布平板法（b）图解）图解1.菌悬液菌悬液 2.熔化的培养基熔化的培养基 3.培养物培养物 4.无菌水无菌水.平板划线法平板划线分离法平板划线分离法1.斜线法斜线法 2.曲线法曲线法 3.方格法方格法 4.放射法放射法 5.四格法四格法 平板划线法：平板划线法：1、倒平板，标记培养基名称，编号和实验日期。、倒平板，标记培养基名称，编号和实验日期。2、划线方法、划线方法 三、细菌培养
6、方法三、细菌培养方法由于细菌的种类不同，对培养条件的要求也就由于细菌的种类不同，对培养条件的要求也就不同，细菌对培养条件的要求包括不同，细菌对培养条件的要求包括温度和气体温度和气体。由于大多数细菌所需的温度均是由于大多数细菌所需的温度均是3537，所，所以细菌的培养方法仅以细菌对以细菌的培养方法仅以细菌对气体气体需求不同进需求不同进行分类。据此可将细菌培养分为三种，即行分类。据此可将细菌培养分为三种，即需氧需氧培养法、培养法、CO2培养法、厌氧培养法培养法、厌氧培养法。(一一)需氧培养法需氧培养法 此法为一般培养法，适合于此法为一般培养法，适合于需氧菌及兼性厌氧菌需氧菌及兼性厌氧菌的培养。将已
7、接种好的平板的培养。将已接种好的平板(一般需倒置一般需倒置)、斜面或液、斜面或液体培养基置体培养基置35孵箱中培养孵箱中培养1824h，一般的细菌均，一般的细菌均能在培养基内生长。但对于难于生长或生长缓慢的能在培养基内生长。但对于难于生长或生长缓慢的细菌细菌(如结核杆菌如结核杆菌)则需培养则需培养37d甚至一个月才能生甚至一个月才能生长。长。二氧化碳培养箱二氧化碳培养法 (三三)厌氧培养法厌氧培养法 厌氧菌由于对氧敏感，在其分离、鉴定以及研究等厌氧菌由于对氧敏感，在其分离、鉴定以及研究等的过程中，必须为之营造一个低氧化还原电势的厌氧的过程中，必须为之营造一个低氧化还原电势的厌氧环境，否则厌氧菌
8、就不能生长甚至死亡，因此厌氧环环境，否则厌氧菌就不能生长甚至死亡，因此厌氧环境对于厌氧菌的生长繁殖至关重要。境对于厌氧菌的生长繁殖至关重要。如在液体培养基如在液体培养基的表面加盖凡士林或蜡，或在液体培养基中加入碎肉的表面加盖凡士林或蜡，或在液体培养基中加入碎肉块制成疱肉培养基等块制成疱肉培养基等。此外，。此外，也可以利用物理或化学也可以利用物理或化学方法除去培养环境中的氧，以保证厌氧环境方法除去培养环境中的氧，以保证厌氧环境。厌氧培养箱厌氧培养箱由恒温培养室、真空取样室、厌氧操作室、气路、电路控制系由恒温培养室、真空取样室、厌氧操作室、气路、电路控制系统等部分组成统等部分组成 ，填充气体一般为
9、氮气。，填充气体一般为氮气。菌落形态学菌落形态学Bacterial Colony Morphology有荚膜的细菌菌落较大并且表面光滑，而没有荚膜的细菌菌落较大并且表面光滑，而没有荚膜的则表面较粗糙；有荚膜的则表面较粗糙；具有芽孢的细菌菌落表面常有褶皱并且不透具有芽孢的细菌菌落表面常有褶皱并且不透明。明。没有鞭毛不运动的细菌，特别是球菌，常形没有鞭毛不运动的细菌，特别是球菌，常形成较小、较厚、边缘较整齐的菌落；有鞭毛成较小、较厚、边缘较整齐的菌落；有鞭毛的细菌则较大而扁平，边缘波状、锯齿状等的细菌则较大而扁平，边缘波状、锯齿状等；光滑型光滑型菌落菌落粗糙型粗糙型菌落菌落粘液型粘液型菌落菌落单增
10、李斯特氏菌在普通计数琼脂平板上的菌落单增李斯特氏菌在普通计数琼脂平板上的菌落(2)(2)卵黄琼脂中的反应卵黄琼脂中的反应：此培养基用于检查细菌是否产生卵磷脂酶和脂酶，此培养基用于检查细菌是否产生卵磷脂酶和脂酶，前者是在菌落周围出现一沉淀环，后者则是出现前者是在菌落周围出现一沉淀环，后者则是出现“珍珠包膜珍珠包膜”，即在菌落周围出现，即在菌落周围出现“珍珠层珍珠层”，通，通过反射光可见菌落周围有一层闪光膜。过反射光可见菌落周围有一层闪光膜。菌落白色混浊环，菌落周围无混浊白环菌落周围有混浊白环乳糖卵黄琼脂平板,借以确定该菌可否产生卵磷脂酶。卵磷脂酶具抗原性，其活性可被相应抗血清所抑制，（5）气味：
11、有些细菌在生长过程中可产生气味，有）气味：有些细菌在生长过程中可产生气味，有助于细菌的鉴定。助于细菌的鉴定。能产生特殊气味的细菌有：能产生特殊气味的细菌有：假单胞菌属假单胞菌属细菌可产生细菌可产生葡萄汁气味葡萄汁气味；变形杆菌变形杆菌产生巧克力烧焦的臭味；产生巧克力烧焦的臭味；链链球菌球菌产生产生地窖里的霉臭地窖里的霉臭；梭菌梭菌可产生可产生粪臭、腐败味粪臭、腐败味；产黑色素类杆菌产黑色素类杆菌属细菌产生属细菌产生辛辣味等辛辣味等。(二二)细菌在细菌在液体培养基液体培养基中的生长现象中的生长现象细菌在液体培养基中一般以培养细菌在液体培养基中一般以培养1824h，观察生长，观察生长特性为好。细菌
12、在液体中生长特性包括：特性为好。细菌在液体中生长特性包括：1发育程度发育程度 以有无生长，微弱、中等、旺盛来表示。以有无生长，微弱、中等、旺盛来表示。2浑浊度浑浊度 有无浑浊以及浑浊的程度有无浑浊以及浑浊的程度(一般以混、中等、一般以混、中等、微浑、透明表示微浑、透明表示)；均匀浑浊、有颗粒；絮状生长。；均匀浑浊、有颗粒；絮状生长。3沉淀沉淀 细菌由于重力而下沉，如链球菌的链与链相细菌由于重力而下沉，如链球菌的链与链相互缠绕而下沉，出现肉眼可见的沉淀，而上层的液体互缠绕而下沉，出现肉眼可见的沉淀，而上层的液体仍清澈透明，或者由于发酵分解糖产生酸，而使基质仍清澈透明，或者由于发酵分解糖产生酸，而
13、使基质中的蛋白质发生沉淀。中的蛋白质发生沉淀。4液体表面性状液体表面性状 有无表面生长以及生长的性状，如有无表面生长以及生长的性状，如膜状膜状(厚薄厚薄)、环状、皱状、是否光滑或呈颗粒状。、环状、皱状、是否光滑或呈颗粒状。5其他其他 有无色素，有无气味，有无产酸情况，有无有无色素，有无气味，有无产酸情况，有无气体产生。气体产生。液体培养物的观察液体培养物的观察 未接种未接种 形成薄膜形成薄膜 形成沉淀形成沉淀 混浊生长混浊生长 絮状生长絮状生长(三三)细菌在细菌在半固体培养基半固体培养基中的生长现象中的生长现象半固体培养基主要用于半固体培养基主要用于细菌动力细菌动力的观察。的观察。有动力的细菌
14、在穿刺线处有生长线外，在穿刺线有动力的细菌在穿刺线处有生长线外，在穿刺线的周围均可见浑浊和细菌生长的小菌落；的周围均可见浑浊和细菌生长的小菌落；无动力的细菌仅在穿刺线上有生长，周围的培养无动力的细菌仅在穿刺线上有生长，周围的培养基透明清晰。基透明清晰。斜面培养物的观察斜面培养物的观察 丝状丝状 树状树状 念珠状念珠状 扩展状扩展状 假根状假根状 刺毛状刺毛状1.在培养物中加入某种在培养物中加入某种底物与指示剂底物与指示剂，经接种、培，经接种、培养后，养后，观察培养基的观察培养基的PH值变化值变化。2.在培养物中在培养物中加入试剂加入试剂，观察它们，观察它们同细菌代谢产物同细菌代谢产物所生成的颜
15、色反应所生成的颜色反应。3.根据根据酶作用的反应特性酶作用的反应特性，测定，测定酶的存在酶的存在。4.根据细菌对根据细菌对理化条件和药品的敏感性理化条件和药品的敏感性，观察细菌，观察细菌的的生长情况生长情况。生化试验的注意事项生化试验的注意事项1、待检菌应是、待检菌应是新鲜培养物新鲜培养物。培养。培养18-24h。2、待检菌应是、待检菌应是纯种培养物纯种培养物。3、遵守观察反应的时间遵守观察反应的时间。观察结果的时间，多为。观察结果的时间，多为24或或48小时。小时。4、应做、应做必要的对照试验必要的对照试验。5、提高阳性检出率，、提高阳性检出率，至少挑取至少挑取2-3个待检的疑似菌个待检的疑
16、似菌落落分别进行试验。分别进行试验。生化试验分类生化试验分类常用的糖、醇气泡导管气泡气泡阳性阳性阴性培养基变为黄色培养基未变色、无气泡产生糖酵解试验糖酵解试验 不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。示剂及发酵管检验。2.甲基红甲基红(MR)试验试验原理原理 某些细菌某些细菌分解葡萄糖分解葡萄糖的过程中产生的过程中产生丙酮酸丙酮酸，丙酮酸进一，丙酮酸进一步被代谢成为步被代谢成为乳酸，乙酸，甲酸乳酸，乙酸，甲酸等。使培养基的等。使培养基
17、的pH下降至下降至4.5以下，加入以下，加入甲基红指示剂甲基红指示剂出现出现红色红色为为阳性阳性；有些细菌分解葡；有些细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质，最终的萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质，最终的酸类较少，培养基酸类较少，培养基pH较高，加入较高，加入甲基红指示剂甲基红指示剂呈呈黄色黄色为为阴性阴性反应反应。因此该试验是因此该试验是检查细菌发酵葡萄糖产生并保持稳定的酸性终检查细菌发酵葡萄糖产生并保持稳定的酸性终末产物和克服体系缓冲作用的能力末产物和克服体系缓冲作用的能力，某些细菌比其他细菌能，某些细菌比其他细菌能够产生更多的酸。够产生更多的酸。方法方法(1)
18、培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基：葡萄糖蛋白胨水(MR/VP培养基培养基)。(2)试剂：甲基红指示剂。试剂：甲基红指示剂。(3)操作：待检菌操作：待检菌1824h纯培养物接种于葡萄纯培养物接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中；糖蛋白胨水培养基中；37培养培养23d，每，每2ml培养液加培养液加2滴滴甲基红指示剂甲基红指示剂，立即观察立即观察。3.伏普试验伏普试验(V-P试验试验)某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为
19、二乙酰，空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物合物，称，称V-P（+）反应。）反应。方法方法(Barritt法法)(1)试剂试剂：甲液为：甲液为60g/L萘酚酒精溶液；乙液为萘酚酒精溶液；乙液为400g/L KOH溶液溶液.(2)操作操作：首先将被检菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，：首先将被检菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，经经37培养培养4d。再按每。再按每2ml培养液中加入甲液培养液中加入甲液lml、乙液乙液0.4ml，充分摇动试管，观察结果。，充分摇动试管，观察结果。结果结果 如立即或于数分钟内出现红色反应者为阳性；如立即或于数分钟内出现红色反应者
20、为阳性；若为阴性应将试管置若为阴性应将试管置37中中4h后再进行观察。后再进行观察。1.靛基质（靛基质（Imdole）试验）试验某些细菌能某些细菌能分解分解蛋白胨中的蛋白胨中的色氨酸色氨酸，生成吲哚生成吲哚。吲。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基与对二甲基氨基苯醛结合氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为，形成玫瑰吲哚，为红色红色化合物。化合物。靛基质试验照片 靛基质+制好的培养基对照管斜面红色，底面黄色培养基全黄色斜面、底部黄色，并产生H2S斜面红色，底部黄色，产生H2S底面黄色，并产生CO2尿素酶试验图 阳性阳性1、未接种、未接种2、尿素酶阳性、尿素酶
21、阳性3、尿素酶阴性、尿素酶阴性4.明胶液化试验明胶液化试验原理原理 某些细菌产生某些细菌产生明胶酶明胶酶可使明胶分解，失去凝固可使明胶分解，失去凝固力，使其由半固体转化为液体状态。天然存在的蛋力，使其由半固体转化为液体状态。天然存在的蛋白质分子太大不能进入菌体细胞，因此，细菌为了白质分子太大不能进入菌体细胞，因此，细菌为了利用这些蛋白质，首先必须将其分解为较小的组分。利用这些蛋白质，首先必须将其分解为较小的组分。某些细菌某些细菌分泌细胞外类蛋白水解酶分泌细胞外类蛋白水解酶(明胶酶明胶酶)来分解来分解蛋白质，这种能力有助于细菌的鉴定。蛋白质，这种能力有助于细菌的鉴定。方法方法(1)培养基：明胶培
22、养基培养基：明胶培养基(2)操作：将待检菌操作：将待检菌穿刺接种于明胶培养基穿刺接种于明胶培养基，同时设，同时设置对照管置对照管(未接种细菌未接种细菌)，20培养培养57d，观察。在，观察。在孵育期间，每孵育期间，每24h取出试管取出试管(包括含细菌的试验管相对包括含细菌的试验管相对照管照管)放冰箱放冰箱(或冰浴或冰浴)内约内约2h，检查明胶是否已被消化检查明胶是否已被消化(液化液化)，每天一次，直到，每天一次，直到7d，除非发生液化。有许多，除非发生液化。有许多菌种要证实明胶液化需要延长孵育时间。菌种要证实明胶液化需要延长孵育时间。结果结果 半固体培养基不再凝固为阳性。半固体培养基不再凝固为
23、阳性。注意事项注意事项:明胶在明胶在20时为固体，时为固体，35时则为液体时则为液体。从凝胶。从凝胶(固态固态)转变为液体大约在转变为液体大约在28。所以，明胶管在。所以，明胶管在35下孵育时，下孵育时，在决定是否液化以前，必须先放在在决定是否液化以前，必须先放在冰箱或冰浴中冷却一段时间。冰箱或冰浴中冷却一段时间。因细菌在培养基的表因细菌在培养基的表面生长引起液化，当明胶管还温热时面生长引起液化，当明胶管还温热时不要摇动不要摇动，否，否则液化的明胶与培养基液体混合，由此忽略阳性结则液化的明胶与培养基液体混合，由此忽略阳性结果，造成假阴性果，造成假阴性。5.苯丙氨酸脱氨酶试验苯丙氨酸脱氨酶试验原
24、理原理 某些细菌产生某些细菌产生苯丙氨酸脱氨酶苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙，使苯丙氨酸脱去氨基，氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸和游离氨形成苯丙酮酸和游离氨，加，加入入FeCl3试剂与试剂与苯丙酮酸螯合后出现绿色产物，苯丙酮酸螯合后出现绿色产物，随后绿色可褪去。随后绿色可褪去。延长时间后，所生成的绿延长时间后，所生成的绿色会较快褪色。苯丙酮酸如与柠檬酸铁相遇色会较快褪色。苯丙酮酸如与柠檬酸铁相遇则产生棕黑色。则产生棕黑色。方法方法(1)培养基：苯丙氨酸培养基。培养基：苯丙氨酸培养基。(2)试剂：试剂：100g/L FeCl3溶液。溶液。(3)操作：被检菌浓厚接种于苯丙氨酸琼脂斜面上，操作：被检菌浓厚接种于
25、苯丙氨酸琼脂斜面上，37培养培养1824h，滴加，滴加100g/L FeCl3试剂数滴于斜试剂数滴于斜面上，自上流下观察。面上，自上流下观察。结果结果 须在须在5min内作出判断，出现绿色为阳性。内作出判断，出现绿色为阳性。加氯化铁试剂出现绿色+方法方法(1)培养基：氨基酸脱羧酶培养基。培养基：氨基酸脱羧酶培养基。(2)操作：待检菌接种于氨基酸培养基及对照培养基，操作：待检菌接种于氨基酸培养基及对照培养基，35培养培养14d。延长时间则常有假阳性出现，。延长时间则常有假阳性出现，假阳假阳性系由蛋白胨中其他种氨基酸分解而造成，故必须性系由蛋白胨中其他种氨基酸分解而造成，故必须同时接种对照管。同时
26、接种对照管。结果结果 检测培养基由检测培养基由黄色变紫色为阳性黄色变紫色为阳性，黄色为阴性，黄色为阴性，对照对照(无氨基酸无氨基酸)为黄色。为黄色。试试验验管管对照管阳性+阴性-对照管变黄试试验验管管变变黄黄阳性反应试验管颜色变化过程阳性反应试验管颜色变化过程阳性反应试验管颜色变化过阳性反应试验管颜色变化过程：程：紫色紫色黄色黄色紫色紫色方法方法(1)培养基：含精氨酸的氨基酸脱羧酶试验培培养基：含精氨酸的氨基酸脱羧酶试验培养基及对照培养基。养基及对照培养基。(2)操作：自斜面培养物接种，作操作：自斜面培养物接种，作肠杆菌科肠杆菌科的的鉴定时鉴定时可覆盖灭菌的液状石蜡可覆盖灭菌的液状石蜡，作假单
27、胞菌作假单胞菌属的鉴定时则不能覆盖液状石蜡属的鉴定时则不能覆盖液状石蜡。于。于37培培养。养。结果结果 指示剂颜色转为指示剂颜色转为碱性时为阳性碱性时为阳性。即。即溴甲酚紫转为紫色，酚红转为红色。但由溴甲酚紫转为紫色，酚红转为红色。但由培养基培养基pH的改变不能证明是由精氨酸脱的改变不能证明是由精氨酸脱羧酶或由精氨酸双水解酶，欲鉴别应作气羧酶或由精氨酸双水解酶，欲鉴别应作气相色谱分析。相色谱分析。8.8.肉渣消化试验肉渣消化试验原理原理 肉渣消化试验是肉渣消化试验是测定细菌对蛋白质的测定细菌对蛋白质的另一种分解能力。另一种分解能力。某些梭菌在生长过程中可某些梭菌在生长过程中可将肉渣消化。例如将
28、肉渣消化。例如肉毒梭菌肉毒梭菌有很强的消化能有很强的消化能力，疱肉培养基可被消化而呈黑色，有助于力，疱肉培养基可被消化而呈黑色，有助于和其他梭菌的鉴别。和其他梭菌的鉴别。方法方法(1)培养基：疱肉培养基。培养基：疱肉培养基。(2)操作：试验菌按常规法接种于疱肉培养基，操作：试验菌按常规法接种于疱肉培养基，用蜡笔于培养基的肉渣上缘画一横线作为标记。用蜡笔于培养基的肉渣上缘画一横线作为标记。于于37培养数日。培养数日。结果结果 观察管内肉渣的高度有无变化，即可判观察管内肉渣的高度有无变化，即可判定肉渣是否已被部分消化。定肉渣是否已被部分消化。9.凝固血清消化试验凝固血清消化试验原理原理 某些细菌液
29、化凝固血清，系由于这些细菌产生一种某些细菌液化凝固血清，系由于这些细菌产生一种胞胞外蛋白酶外蛋白酶的作用所致的作用所致方法方法(1)培养基：吕氏血清培养基。培养基：吕氏血清培养基。(2)操作：取试验细菌，以无菌方法接种于吕氏血清斜面上，操作：取试验细菌，以无菌方法接种于吕氏血清斜面上，经经37培养数日，观察结果。培养数日，观察结果。结果结果 凝固之凝固之血清发生液化为阳性血清发生液化为阳性。方法方法(1)培养基：柠檬酸盐培养基。培养基：柠檬酸盐培养基。(2)操作：被检菌接种于柠檬酸盐斜面培养基上，操作：被检菌接种于柠檬酸盐斜面培养基上，35培养培养l4d，观察。，观察。结果结果 培养基由淡绿色
30、变为培养基由淡绿色变为深蓝色为阳性深蓝色为阳性，不，不变色为阴性。变色为阴性。2.马尿酸钠水解试验马尿酸钠水解试验三氯化铁法三氯化铁法原理：原理：B群链球菌具有群链球菌具有马尿酸水解酶马尿酸水解酶，可使，可使马尿酸水解为马尿酸水解为苯甲酸苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸与和甘氨酸，苯甲酸与三三氯化铁氯化铁试剂结合，形成苯甲酸铁沉淀试剂结合，形成苯甲酸铁沉淀.方法方法培养基培养基:马尿酸钠培养基。马尿酸钠培养基。试剂：三氯化铁溶液。试剂：三氯化铁溶液。操作：待检菌接种马尿酸钠培养基，操作：待检菌接种马尿酸钠培养基，35培养培养48h，离心沉淀，取上清液离心沉淀，取上清液0.8mL加入三氯化铁溶液加入三氯化
31、铁溶液0.2mL，立即混合均匀，经立即混合均匀，经1015min观察结果。观察结果。结果：出现稳定的沉淀物为阳性，轻摇后沉淀物溶解结果：出现稳定的沉淀物为阳性，轻摇后沉淀物溶解为阴性。为阴性。茚三酮法茚三酮法原理：马尿酸被细菌分解后，形成苯甲酸及甘氨酸。原理：马尿酸被细菌分解后，形成苯甲酸及甘氨酸。甘氨酸在茚三酮的作用下，经氧化脱氨基反应，生甘氨酸在茚三酮的作用下，经氧化脱氨基反应，生成氨，成氨，CO2和相应的醛，而茚三酮则生成了和相应的醛，而茚三酮则生成了还原型茚还原型茚三酮三酮。其中形成的。其中形成的氨和还原型茚三酮，与残留的茚氨和还原型茚三酮，与残留的茚三酮起反应，形成紫色化合物三酮起反
32、应，形成紫色化合物。方法：方法：试剂：试剂：l马尿酸钠水溶液；马尿酸钠水溶液；3.5g茚三酮溶于茚三酮溶于100mL的的1：1的丙酮，丁酮混合溶液。的丙酮，丁酮混合溶液。操作：操作：0.4ml待检菌与等量的待检菌与等量的1马尿酸钠水溶马尿酸钠水溶液混合后，液混合后，35培养培养2h，加入，加入0.2ml茚三酮试茚三酮试剂，振摇后观察。剂，振摇后观察。结果：结果：出现紫色为阳性出现紫色为阳性。3.丙二酸盐利用试验丙二酸盐利用试验原理原理 某些细菌利用丙二酸盐作为唯一碳源时，某些细菌利用丙二酸盐作为唯一碳源时，丙二酸钠可被分解生成碳酸钠，使培养基变碱丙二酸钠可被分解生成碳酸钠，使培养基变碱性。性。
33、溴麝香草酚蓝：溴麝香草酚蓝是一种酸碱指示溴麝香草酚蓝：溴麝香草酚蓝是一种酸碱指示剂，变色范围剂，变色范围pH6.0(黄黄)7.6(蓝蓝)。普通水是。普通水是中性，中性，pH也就是也就是7左右，差不多呈淡蓝，溶有左右，差不多呈淡蓝，溶有二氧化碳后，由于会形成碳酸，碳酸是弱酸，二氧化碳后，由于会形成碳酸，碳酸是弱酸，因此因此pH不会降太多，变黄。当中过渡颜色是不会降太多，变黄。当中过渡颜色是绿色。绿色。方法方法(1)培养基：丙二酸钠培养基。培养基：丙二酸钠培养基。(2)操作：被检菌接种于丙二酸盐培养基，于操作：被检菌接种于丙二酸盐培养基，于35培养培养2448h后观察结果。后观察结果。结果：培养基
34、由绿色变为结果：培养基由绿色变为蓝色为阳性蓝色为阳性，颜色，颜色无变化为阴性。无变化为阴性。阳性+(四四)酶类试验酶类试验1.氧化酶试验氧化酶试验(Kovacs试验试验)原理原理 氧化酶氧化酶(又称细胞色素氧又称细胞色素氧化酶化酶)是细胞色素呼吸酶系统是细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，能使的终末呼吸酶，能使还原型还原型的细胞色素的细胞色素C氧化成氧化成氧化型的氧化型的细胞色素细胞色素C，氧化型细胞色素，氧化型细胞色素C又使对苯二胺氧化，生成红又使对苯二胺氧化，生成红色的醌类化合物。色的醌类化合物。方法方法(1)试剂：试剂：10g/L盐酸四甲基对苯二胺水溶液，盐酸四甲基对苯二胺水溶液，或或10g
35、/L盐酸二甲基对苯二胺水溶液。盐酸二甲基对苯二胺水溶液。(2)操作：取滤纸片蘸取待测菌落少许，加试剂操作：取滤纸片蘸取待测菌落少许，加试剂一滴，观察颜色变化。也可用滴管吸取试剂，一滴，观察颜色变化。也可用滴管吸取试剂，直接将一滴滴在待测菌菌落上，观察颜色变化。直接将一滴滴在待测菌菌落上，观察颜色变化。结果：结果：阳性者立即呈现粉红色或红色，颜色逐阳性者立即呈现粉红色或红色，颜色逐渐变深至深紫色。渐变深至深紫色。成蓝色为成蓝色为+不变色或为红色为不变色或为红色为-2.过氧化氢酶试验过氧化氢酶试验(触酶试验触酶试验)原理原理 过氧化氢酶又称过氧化氢酶又称触酶触酶，可使细菌代谢过，可使细菌代谢过程中
36、的程中的过氧化氢分解为水和氧过氧化氢分解为水和氧。方法方法(1)试剂：新鲜配制的试剂：新鲜配制的3过氧化氢水溶液。过氧化氢水溶液。(2)操作：挑取操作：挑取1环固体培养基上的待测菌菌落，放于环固体培养基上的待测菌菌落，放于洁净玻片上或试管内，滴加洁净玻片上或试管内，滴加3过氧化氢数滴，观察过氧化氢数滴，观察结果。实验时必须用结果。实验时必须用1824h新鲜培养物新鲜培养物。陈旧培养。陈旧培养物可能使触酶失活，出现假阴性结果。此外，不宜挑物可能使触酶失活，出现假阴性结果。此外，不宜挑取血琼脂上的菌落，因红细胞内含有触酶，会导致假取血琼脂上的菌落，因红细胞内含有触酶，会导致假阳性结果。阳性结果。结
37、果结果 30s内有大量气泡产生者为阳性，无气泡产生者内有大量气泡产生者为阳性，无气泡产生者为阴性为阴性。菌落平板1滴3的过氧化氢。阳性。过氧化氢酶：过氧化氢酶：3.硝酸盐还原试验硝酸盐还原试验原理原理 某些革兰氏阴性杆菌在代谢过程中，能某些革兰氏阴性杆菌在代谢过程中，能将培养基中的硝酸盐还原为亚硝酸盐，亚硝酸将培养基中的硝酸盐还原为亚硝酸盐，亚硝酸盐与醋酸作用，生成盐与醋酸作用，生成亚硝酸亚硝酸，亚硝酸与试剂中，亚硝酸与试剂中的的对氨基苯磺酸反应生成重氮苯磺酸对氨基苯磺酸反应生成重氮苯磺酸，再与，再与-萘胺萘胺结合，生成结合，生成红色红色的的N-萘胺偶氮苯磺酸。萘胺偶氮苯磺酸。方法方法(1)培
38、养基：硝酸盐培养基。培养基：硝酸盐培养基。(2)试剂：甲液：对氨基苯磺酸试剂：甲液：对氨基苯磺酸0.8g，5mol/L醋酸醋酸100ml；乙液：；乙液：-萘胺萘胺0.5g，5mol/L醋酸醋酸100ml。操作：待测菌株接种到硝酸盐培养操作：待测菌株接种到硝酸盐培养基中，基中，351824h培养后，加入培养后，加入0.1ml甲、乙液等量混合液于试管内，甲、乙液等量混合液于试管内，观察结果。观察结果。结果结果 出现出现红色为阳性红色为阳性，无颜色变，无颜色变化为阴性。化为阴性。4.4.过氧化物酶试验过氧化物酶试验（1 1）原理）原理:过氧化物酶的作用是将过氧化氢过氧化物酶的作用是将过氧化氢中的氧转
39、移给可被氧化的物质。中的氧转移给可被氧化的物质。（2 2）其反应如下：试验时，若以）其反应如下：试验时，若以联苯胺联苯胺(4,4-(4,4-二氨基联苯二氨基联苯 )作为被氧化的物质，试验作为被氧化的物质，试验细菌如有过氧化物酶存在时，加入过氧化氢细菌如有过氧化物酶存在时，加入过氧化氢可使苯胺氧化成为蓝色的可使苯胺氧化成为蓝色的联苯胺蓝联苯胺蓝。（3 3）方法）方法l 试剂：盐酸联苯胺溶液；试剂：盐酸联苯胺溶液；3 3过氧化氢溶液。过氧化氢溶液。l 操作：将盐酸联苯胺溶液与过氧化氢溶液等操作：将盐酸联苯胺溶液与过氧化氢溶液等量混合后，滴加于菌落上，立即观察结果。量混合后，滴加于菌落上，立即观察结
40、果。（4 4）结果）结果l 阳性者于阳性者于2min2min内呈现内呈现蓝色。蓝色。5.5.脱氢酶试验脱氢酶试验（1 1）原理）原理l 细菌的脱氢酶可使相应的作用物脱去氢，但此作用需要一个细菌的脱氢酶可使相应的作用物脱去氢，但此作用需要一个可还原的化合物作为受氢体。可还原的化合物作为受氢体。l 若用若用美蓝（亚甲蓝，美蓝（亚甲蓝，Methylene blueMethylene blue）作为受氢体的话，细作为受氢体的话，细菌如有脱氢酶存在，可使美蓝菌如有脱氢酶存在，可使美蓝还原还原成成美白美白(无色无色)。但是，美白。但是，美白易被空气中氧气所氧化，故此试验应在隔绝空气下进行。易被空气中氧气所
41、氧化，故此试验应在隔绝空气下进行。l 染料、医药、鉴识血迹染料、医药、鉴识血迹l 如果用无色如果用无色TTCTTC（2,3,5-2,3,5-氯化三苯基四氮唑氯化三苯基四氮唑 ）作为）作为受氢体，在有脱氢酶存在的情况下，受氢体，在有脱氢酶存在的情况下，TTCTTC可以接受氢可以接受氢而成为而成为红色的红色的FormazanFormazan（甲臜（甲臜z)。后者不再被氧。后者不再被氧气所氧化，所以试验不必在密闭的条件下进行。气所氧化，所以试验不必在密闭的条件下进行。2,3,5-2,3,5-氯化三苯基四氮唑氯化三苯基四氮唑（2 2）方法）方法l 试剂：试剂：1 13000030000美蓝水溶液；美蓝
42、水溶液；pH7.4pH7.4磷酸盐缓冲液；磷酸盐缓冲液；0.1mol0.1molL L的作用物水溶液。的作用物水溶液。l 操作：取试验菌肉汤培养物操作：取试验菌肉汤培养物10ml10ml，离心后以缓冲液洗，离心后以缓冲液洗2 2次，次，再加缓冲液再加缓冲液5ml5ml，制成菌液。取试管，制成菌液。取试管3 3支，每管加美蓝水溶液支，每管加美蓝水溶液0.5ml0.5ml，于第，于第1 1管和第管和第3 3管各加菌液管各加菌液1ml1ml，第，第2 2管加缓冲液管加缓冲液1ml1ml，置，置3737水浴中水浴中15min15min。第。第1 1管和第管和第2 2管各加作用物管各加作用物2ml2ml
43、，第，第3 3管加管加缓冲液缓冲液2ml2ml。各管加无菌液状石蜡。各管加无菌液状石蜡0.5ml0.5ml，使覆盖于液面上。，使覆盖于液面上。置置3737水浴中，每水浴中，每5min5min观察一次，记录美蓝变白时间，共观观察一次，记录美蓝变白时间，共观察察2h2h。(3)(3)结果结果l 若第若第1 1管管变白变白即为相应作用物的脱氢酶即为相应作用物的脱氢酶阳阳性性，不变色为阴性不变色为阴性。第。第2 2管与第管与第3 3管为对照管为对照管，应不变色。管，应不变色。6.6.氧化三苯基四氮唑试验氧化三苯基四氮唑试验(TTC(TTC试验试验)(1)(1)原理原理l 部分细菌可还原部分细菌可还原无
44、色无色可溶性的氯化三苯基四可溶性的氯化三苯基四氮唑，成为氮唑，成为红色红色的三苯甲臜的三苯甲臜(Formazan)(Formazan)。(2)(2)方法方法(i)(i)试剂试剂l 贮存液：用无菌蒸馏水配制贮存液：用无菌蒸馏水配制NaNa2 2HPOHPO4 4饱和液，取氯化饱和液，取氯化三苯基四氮唑三苯基四氮唑(TTC)775mg(TTC)775mg，溶于，溶于100mlNa100mlNa2 2HPOHPO4 4饱和液饱和液中混匀后，放置于暗处，可保存中混匀后，放置于暗处，可保存2 23 3个月。个月。l 应用液：取贮存液应用液：取贮存液4ml4ml，加，加NaNa2 2HPOHPO4 4饱和
45、液至饱和液至100ml100ml，混匀后，置暗处，可用混匀后，置暗处，可用2 24 4周。周。(ii)(ii)操作：以无菌吸管吸取清洁中段尿操作：以无菌吸管吸取清洁中段尿2ml2ml置于无置于无菌试管中。加菌试管中。加TTCTTC试剂应用液试剂应用液0.5ml0.5ml。混匀后，。混匀后，置置37,8h37,8h培养后观察结果。培养后观察结果。(3)(3)结果结果出现出现红色者为阳性红色者为阳性，淡红色者为弱阳性，不变色者淡红色者为弱阳性，不变色者为阴性为阴性。7.7.脂酶试验脂酶试验(1)(1)原理原理l 某些细菌产生某些细菌产生卵磷脂酶，即卵磷脂酶，即-毒素毒素，在有钙离子，在有钙离子存在
46、时，能迅速分解卵磷脂，生成存在时，能迅速分解卵磷脂，生成混浊沉淀状的甘油混浊沉淀状的甘油酯和水溶性的磷酰胆碱。酯和水溶性的磷酰胆碱。(2)(2)方法方法l 培养基：卵黄琼脂培养基。培养基：卵黄琼脂培养基。l 操作：将待检菌划线接种于卵黄琼脂平皿上，于操作：将待检菌划线接种于卵黄琼脂平皿上，于3535培养培养3 36h6h。(3)(3)结果结果l 产生卵磷脂酶的细菌，培养产生卵磷脂酶的细菌，培养3h3h后，在菌落周围形成后，在菌落周围形成乳白色混浊环，乳白色混浊环，6h6h后扩散至后扩散至5 56mm6mm。8.8.磷酸酶试验磷酸酶试验(1)(1)原理原理l 磷酸酶是一种单膦酸酯的水解酶，可使单
47、磷磷酸酶是一种单膦酸酯的水解酶，可使单磷酸酯水解，其反应可根据反应基质的不同而酸酯水解，其反应可根据反应基质的不同而异，如用异，如用磷酸酚酞磷酸酚酞为基质，经磷酸酶水解后为基质，经磷酸酶水解后可释放出酚酞，在可释放出酚酞，在碱性环境中可呈红色碱性环境中可呈红色。(2)(2)方法方法l 培养基：于培养基：于1000ml1000ml溶化的适宜琼脂培养基并冷至溶化的适宜琼脂培养基并冷至4545时，加入过滤除菌的时，加入过滤除菌的1 1磷酸酚酞溶液磷酸酚酞溶液lmllml，摇匀，摇匀后倾注平板。后倾注平板。l 操作：取被检菌的纯培养物接种上述平板，于操作：取被检菌的纯培养物接种上述平板，于3535培养
48、培养181824h24h，于平板盖内加，于平板盖内加l l滴浓氨水，熏蒸片刻。滴浓氨水，熏蒸片刻。(3)(3)结果结果如有酚酞释出，如有酚酞释出，菌落即变为粉红色菌落即变为粉红色9.DNA9.DNA酶试验酶试验(1)(1)原理原理l DNA DNA酶可将脱氧核糖核酸酶可将脱氧核糖核酸(DNA)(DNA)长链水解成由几个长链水解成由几个单核苷酸组成的寡核苷酸链。单核苷酸组成的寡核苷酸链。l 长链长链DNADNA可被酸沉淀，水解后产生的寡核苷酸则可可被酸沉淀，水解后产生的寡核苷酸则可溶于酸，在溶于酸，在DNADNA琼脂平皿上加入盐酸后，在菌落周围琼脂平皿上加入盐酸后，在菌落周围形成透明环形成透明环
49、。(2)(2)方法方法l 培养基：培养基：DNADNA酶试验培养基。酶试验培养基。l 操作：点状接种待检菌于操作：点状接种待检菌于DNADNA琼脂平皿上，琼脂平皿上，3535培养培养181824h24h，用，用l mol/Ll mol/L盐酸倾注平皿，观察结果。盐酸倾注平皿，观察结果。(3)(3)结果结果l 菌落周围菌落周围产生透明环为阳性，无透明环为阴性。产生透明环为阳性，无透明环为阴性。10.10.血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验(1)(1)原理原理l 金黄色葡萄球菌可金黄色葡萄球菌可产生凝固酶产生凝固酶，使血浆中的纤维蛋，使血浆中的纤维蛋白原转变为纤维蛋白，附着于细菌的表面，产生凝固。白原转
50、变为纤维蛋白，附着于细菌的表面，产生凝固。l 凝固酶可分为两种，一种是凝固酶可分为两种，一种是与细胞壁结合与细胞壁结合的凝固酶，的凝固酶，可用玻片法测定；另一种是菌体生成后可用玻片法测定；另一种是菌体生成后释放于培养基释放于培养基中的中的游离凝固酶，可用试管法测出。游离凝固酶，可用试管法测出。(2)(2)方法方法(i)(i)玻片法：在玻片上分别滴加新鲜人或兔血玻片法：在玻片上分别滴加新鲜人或兔血浆及生理盐水各一滴，挑取待检菌的菌落，浆及生理盐水各一滴，挑取待检菌的菌落，分别与血浆和生理盐水混合，立即观察结果，分别与血浆和生理盐水混合，立即观察结果，如如血浆中有明显颗粒出现，而生理盐水中无血浆中
