1、DNA体外合成与序列测定1.合成的原理合成的原理u核酸固相合成的基本原理是将所要合成的核酸链的末端核苷酸先固定在一种不溶性高分子固相载体上，然后再从此末端开始将其他核苷酸按顺序逐一接长。u每接长一个核苷酸残基则经历一轮相同的操作，由于接长的核酸链始终被固定在固相载体上，所以过量的未反应物或反应副产物可通过过滤或洗涤的方法除去。u合成至所需长度后的核酸链可从固相载体上切割下来并脱去各种保护基，再经纯化即可得到最终产物。A.DNA的化学合成的化学合成1.合成的原理合成的原理2.核 酸 固相磷酰亚胺法合成时，末端核苷酸的3-OH与固相载体成共价键，5-OH被4，4-二甲氧基三苯甲基(DMTr)保护，
2、下一个核苷酸的5-OH亦被DMTr保护，3-OH上的磷 酸 基 上 有 -N(C3H7)2和-OCH3两个基团。2022-10-532022-10-5南京农业大学 生命科学学院4每延伸一个核苷酸需四步化学反应：(1)脱三苯甲基：末端核苷酸的DMTr用三氯乙酸/二氯甲烷溶液脱去，游离出5-OH。(2)缩合：新生成的5-OH 在四唑催化下与下一个核苷3-磷酰亚胺单体缩合使链增长。(3)盖帽：有少量(小于0.5%)未缩合的5-OH 要在甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化下用乙酸苷乙酰化封闭，以防进一步缩合造成错误延伸。(4)氧化：新增核苷酸链中的磷为三价亚磷，需用碘氧化成五价磷。上述步骤循环一次，核苷酸链向
3、5方向延伸一个核苷酸。A.DNA的化学合成的化学合成2.合成后处理合成后处理u 合成后的寡核苷酸链仍结合在固相载体上，且各种活泼基团也被保护基封闭着，要经过以下合成后处理才能最后应用。n切割切割：合成的寡核苷酸链仍共价结合于固相载体上，用浓氨水可将其切割下来。切割后的寡核苷酸具有游离的3-OH。n脱保护脱保护：切割后的寡核苷酸磷酸基及碱基上仍有一些保护基，这些保护基也必须完全脱去。磷酸基的保护基-氰乙基在切割的同时即可脱掉，而碱基上的保护基苯甲酰基和异丁酰基则要在浓氨水中55放置15h左右方能脱掉。n纯化纯化：纯化的目的主要是去掉短的寡核苷酸片段，盐及各种保护基等杂质。通常采用的纯化方法有电泳
4、法、高效液相色谱法和高效薄层色谱法等。纯化这一步操作是可以选择的，对要求不高的应用如PCR等可不纯化。n近年来发展了一些修饰试剂，可在合成寡核苷酸时，对某些核苷酸进近年来发展了一些修饰试剂，可在合成寡核苷酸时，对某些核苷酸进行一定的修饰，为寡核苷酸探针的非放射性标记提供了新途径。行一定的修饰，为寡核苷酸探针的非放射性标记提供了新途径。2022-10-55第二节第二节 DNA的体外合成的体外合成B.聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）u 聚合酶链式反应是上世纪80年代发展起来的一种体外快速扩增特异DNA序列的技术。此技术于1985年由Mullis发明，1988年耐热TaqDNA聚合酶的发现令
5、该技术使用更加方便、有效。u PCR可以说是20世纪核酸分子生物学研究领域的最重大发明之一，这不仅表现在该方法本身的简单和巧妙，而且还表现在它的出现高速发展了大量在以前看来似乎不可能的生物学技术。u Mullis因其卓越的贡献而获1993年的诺贝尔化学奖。2022-10-56南京农业大学 生命科学学院B.聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）u PCR的原理：u 原理类似于DNA的天然复制过程。即在模板DNA、寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸（dNTP）底物和Mg2+存在的条件下，由耐热的TaqDNA聚合酶催化DNA的复制，合成靶DNA。PCR包括三个基本过程：n变性变性。加热模板使其解离成
6、单链。n退火退火。降低温度使人工合成的寡核苷酸引物与模板 DNA 中所要扩增的靶序列的两侧按碱基配对原则相结合。n延伸延伸。在适宜条件下，TaqDNA聚合酶利用dNTP使引物3端向前延伸，合成与模板碱基完全互补的DNA链。这样变性、退火和延伸构成一个循环，每一次循环的产物可作为下一次循环的模板，经过3035个循环后，界于两个引物之间的靶序列得到大量复制，拷贝数约增加106107倍。2022-10-572022-10-5南京农业大学 生命科学学院8核酸序列测定核酸序列测定uDNA测序是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是核苷酸排列方式。RNA测序则通常将RNA提取后，反转录为DNA后使用DNA
7、测序的方法进行测序。u在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。u目前应用最广泛的是：nSanger双脱氧链终止法。nMaxam-Gilbert DNA化学降解法。n新技术：杂交测序法，质谱法，单分子测序法，原子探针显微镜测序法，DNA 芯片法。2022-10-5南京农业大学 生命科学学院9Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法60年代末就已掌握了充分的理论知识，只是当时在某些技术能力上和研年代末就已掌握了充分的理论知识，只是当时在某些技术能力上和研究思路上，存在着弱点，阻碍了从理论转变为现实。第一，究思路上，存在着弱点，阻碍了从理论转变为现实。第一，如何分离寡如
8、何分离寡核苷酸片段核苷酸片段；另一方面，在；另一方面，在研究思路研究思路上都没有摆脱蛋白质序列分析的束上都没有摆脱蛋白质序列分析的束缚。缚。1965，Cornall大学以大学以SWHolle，为首的科学家小组，首次完成为首的科学家小组，首次完成75个核苷酸的酵母丙氨酸个核苷酸的酵母丙氨酸tRNA的全序列测定。即利用各种的全序列测定。即利用各种RNA酶把酶把tRNA降解成寡核苷酸，经分离纯化后，再分别测定短片段顺序。降解成寡核苷酸，经分离纯化后，再分别测定短片段顺序。返回返回DNA核酸序列分析历程核酸序列分析历程Sanger双脱氧链终止法原理双脱氧链终止法原理利用DNA聚合酶的两种酶催反应特性：
9、1、利用单链DNA模板，合成DNA互补链；2、利用2，3双脱氧核苷三磷酸作底物，参入到寡核酸链的末端，从而终止DNA链的生长。有时也称引物合成法，或酶催引物合成法。核酸序列测定核酸序列测定A.Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法u 基本原理基本原理：u 在模板指导下，DNA聚合酶不断将dNTP加到引物的3-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷酸核苷双脱氧三磷酸核苷(ddNTP)，由于双脱氧核糖的3位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5-引物端和以ddNMP残基为3端结尾的一系列长短不一片段的混合物。u 由于双脱氧核苷
10、酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸单链DNA，从而读取DNA核苷酸序列。2022-10-5南京农业大学 生命科学学院12q反应：反应：同时加入引物和引物和模板、模板、DNA聚合酶聚合酶1、一、一种种ddNTP、以及以及 四种四种dNTP（有一种带放射性标记）。q变性胶电泳变性胶电泳分离反应混合物。q放射自显影术放射自显影术，检测单链DNA片段的放射性带。q结果判读结果判读，从放射性X光 底 片 上，直 接 读 出DNA的核酸顺序。反应混合物中，标记什么最方便？反应混合物中，标记什么最方便？A.Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法u 基本原理基本原
11、理：u 测序所用的测序所用的ddNTPu ddNTPs 是反应终止剂，可以当作正常碱基参与复制，一旦链入DNA中，其后就不能再继续连接。反应体系中dNTPs的浓度远高于ddNTPs（一般1：34）。2022-10-5南京农业大学 生命科学学院14v 在自动测序中将荧光在自动测序中将荧光素连在素连在4种种ddNTP上上A.Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法u 基本步骤基本步骤：n测序模板的纯化与定量n测序反应PCR仪n测序反应产物纯化与变性n上样电泳测序仪n分析结果2022-10-5南京农业大学 生命科学学院152022-10-516南京农业大学 生命科学学院2022-10-517南京农业
12、大学 生命科学学院毛细管电泳毛细管电泳荧光检测荧光检测A.Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法u 测序结果：2022-10-5南京农业大学 生命科学学院18uDNA测序仪的多种应用：测序仪的多种应用：2022-10-5南京农业大学 生命科学学院19Sanger双脱氧双脱氧-M13体系体系 DNA序列分析法序列分析法引物合成引物合成DNA序列测定法的特点及缺陷序列测定法的特点及缺陷分析分析：这样处理后，能：这样处理后，能策得高分子量策得高分子量DNA吗？吗？为了将这些降解的为了将这些降解的DNA片段，按其原来的顺序片段，按其原来的顺序“拼排拼排”起来，至少还需要用一种或数种其它内切限制酶，对
13、起来，至少还需要用一种或数种其它内切限制酶，对同种同种DNA作酶切消化，并进行电泳纯化和序列分析。作酶切消化，并进行电泳纯化和序列分析。实际上可行吗？实际上可行吗？高分子量高分子量DNA分子消化降解成一组具一定长度的限制分子消化降解成一组具一定长度的限制片段，然后再用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作电泳片段，然后再用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作电泳分离纯化，从胶中抽取分离纯化，从胶中抽取DNA片段，供进一步分析。片段，供进一步分析。这些供作序列测定的这些供作序列测定的DNA片段绝大多数都仅片段绝大多数都仅为数百个核酸为数百个核酸。因此需要用物理方法分离大量的因此需要用物理方法分离大量的DNA片段。
14、片段。费时费钱费时费钱，因，因为商品提供的核酸内切限制酶的价格是十分昂贵。为了保为商品提供的核酸内切限制酶的价格是十分昂贵。为了保证能够获得所有的限制片段，就需要制备足多数量的证能够获得所有的限制片段，就需要制备足多数量的DNA，而其中有许多步骤都要用不同浓度的凝胶进行电泳再纯化。而其中有许多步骤都要用不同浓度的凝胶进行电泳再纯化。在这种纯化过程中，会加剧在这种纯化过程中，会加剧DNA的损伤和丢失。的损伤和丢失。克服缺点的一种途径克服缺点的一种途径DNA分子克隆分子克隆将不同限制酶消化切割的将不同限制酶消化切割的DNA限制片段，随机地克隆到载限制片段，随机地克隆到载体分子上。选用天然的单链体分
15、子上。选用天然的单链 DNA噬菌体，例如噬菌体，例如 M13作为作为载体，重组体噬菌体的载体，重组体噬菌体的DNA分子，可直接用作模板。分子，可直接用作模板。引物引物：合成的特定的寡核苷酸，或者是从亲本单链噬菌体合成的特定的寡核苷酸，或者是从亲本单链噬菌体DNA中分离出来的一种限制片段。其中分离出来的一种限制片段。其特点是能够特异性地同载体分特点是能够特异性地同载体分子上与克隆位点相连的单链子上与克隆位点相连的单链DNA区段杂交区段杂交。称做。称做“通用引物通用引物”。M13载体克隆载体克隆DNA片段片段将将DNA片段克隆在片段克隆在M13mp载体特定位点上，即位于载体特定位点上，即位于 La
16、c区段中含有多克隆位点的多聚衔接物（区段中含有多克隆位点的多聚衔接物（polylinker）内。内。重组体噬菌体，在含有重组体噬菌体，在含有IPTG和和Xgal的培养基平板上形成的培养基平板上形成白色白色的噬菌斑，而非重组体的噬菌体则形成的噬菌斑，而非重组体的噬菌体则形成蓝色蓝色的噬菌斑。的噬菌斑。从白色的噬菌班中分离重组体噬菌体，并制备出单链从白色的噬菌班中分离重组体噬菌体，并制备出单链DNA，就可以直接按双脱氧链终止法进行序列分析。就可以直接按双脱氧链终止法进行序列分析。当然这种随机的方法，也需要通过顺序的测定将派生的序列拼连起来，恢复成原来结构形式的总DNA序列。荧光标记物荧光标记物dd
17、GTPddATPddTTPddCTP聚合反应及产物聚合反应及产物OH 3P 55PHODNA聚合酶，聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTPddGTPddATPddTTPddCTP5PddATPddGTP5PddTTP5PddCTP5P单泳道电泳及信号收集正极正极负极负极核酸序列测定核酸序列测定B.Maxam-Gilbert DNA化学降解法化学降解法u 基本原理基本原理：n在一个末端标记的DNA片段在几组互相独立的的化学反应分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基。n因此生成一系列放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。n每组混合物中
18、均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。n鲜明特点是可以探测DNA构象中的蛋白质DNA相互作用。2022-10-5南京农业大学 生命科学学院28Maxam Gilbert化学修饰法的原理化学修饰法的原理化学试剂处理化学试剂处理末端标记末端标记DNA片段片段，碱基的特异性切割碱基的特异性切割产生的产生的DNA片段混合物片段混合物,电泳分离显影后显现谱带，直接读出待测电泳分离显影后显现谱带，直接读出待测DNA片段的核苷酸顺序。片段的核苷酸顺序。出发材料出发材料：局部消化的
19、DNA分子群体中纯化出特定的末端末端带有放射性标记的DNA片段(双链或单链）关键：关键：4种核苷酸碱基中，有12种发生特异性的化学切割仅应，包括碱基的修饰、修饰的碱基从其糖环上转移出去以及在失去碱基的部位发生DNA链的断裂三个主要的内容。由于化学切割反应特异性是由碱基的修饰作用决定的，显然，随后的切割反应必定是定量的，而且同副反应无关。B.Maxam-Gilbert DNA化学降解法化学降解法u 基本原理基本原理：2022-10-5南京农业大学 生命科学学院31MaxamGilbert化学修饰法优点化学修饰法优点不需要体外酶催合成反应不需要体外酶催合成反应单双链都可以单双链都可以需要末端标记需
20、要末端标记两端采用不同的标记，测序可从两端进行两端采用不同的标记，测序可从两端进行Maxam-Gilbert测序法的特异断裂32P32PATCGATCG32PATCGATATCGATSpecific Reaction to G 化學法無放射線片段不能顯像断裂处断裂处ATCGATCGATuG反应：反应：DMS使鸟嘌呤的使鸟嘌呤的7位氮原子甲基化，位氮原子甲基化，其后断开第其后断开第8位碳原子和第位碳原子和第9位氮原子间的化学位氮原子间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。uG+A反应：反应：甲酸使嘌呤环上的氮原子质子化，甲酸使嘌呤环上的氮原子质子化
21、，削弱了腺嘌呤脱氧核糖核苷酸和鸟嘌呤脱氧核糖削弱了腺嘌呤脱氧核糖核苷酸和鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸中的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。核苷酸中的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。uT+C反应：反应：肼断开了嘧啶环，产生的碱基片段肼断开了嘧啶环，产生的碱基片段能被哌啶所置换。能被哌啶所置换。uC反应：反应：在在NaCl存在时，只有存在时，只有C才能与肼发生才能与肼发生反应，随后被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。反应，随后被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。5PP 53HOOH 35HOOH 53HOOH 3532PP32 53HOOH 3532POH 3硫酸二甲酯甲酸肼肼NaClGG+AT+CC碱性磷酸碱性磷酸单酯酶单酯酶除去除
22、去 5磷酸基磷酸基 多核苷酸多核苷酸磷酸激酶磷酸激酶-32P-ATP分离单链分离单链DNA分别在分别在4个个试管中进行试管中进行特异断裂特异断裂GG+AT+CC5 32P -GTCATGTGCTAG5 32P GTCATGTGCTA5 32P GTCATGTGCT5 32P GTCATGTGC5 32P GTCATGTG5 32P GTCATGT5 32P GTCATG5 32P GTCAT5 32P GTCA5 32P GTC5 32P GT5 32P G断裂产物断裂产物分别在分别在4个个泳道电泳泳道电泳从下到上依次读出从下到上依次读出DNA片段的核苷酸序列片段的核苷酸序列u化学降解法与双脱
23、氧法的比较化学降解法与双脱氧法的比较u Maxam-Gilber化学降解法所能测定DNA序列的长度要比Sanger法短一些，通常说来，化学降解法对放射性标记末端250个核苷酸以内的DNA序列效果最佳。u 如今双脱氧核苷酸末端终止法远比Maxam-Gilbert化学降解法应用得更为广泛。但是，化学降解法具有一个Sanger 法所不具备的明显优点：n即所测核酸序列来自原DNA分子而不是酶促合成反应所产生的拷贝，因此，利用Maxam-Gilbert法可以对合成的寡核苷酸进行测序，分析诸如甲基化等DNA修饰的情况，也可以通过化学保护及修饰干扰实验来研究DNA二级结构及蛋白质与DNA的相互作用。u 然而
24、，由于Sanger法的简便快速，仍不失为现今DNA测序的最佳选择方案。2022-10-5南京农业大学 生命科学学院37核酸序列测定核酸序列测定C.基因组测序基因组测序u在大规模DNA测序中，目标DNA分子的长度可达上百万个bp。现在还不能直接测定整个分子的序列，然而，可以得到待测序列的一系列序列片段。u序列片段是DNA双螺旋中的一条链的子序列（或子串）。这些序列片段覆盖待测序列，并且序列片段之间也存在着相互覆盖或者重叠。在一般情况下，对于一个特定的片段，我们不知道它是属于正向链还是属于反向链，也不知道该片段相对于起点的位置。另外，这样的序列片段中还可能隐含错误的信息。序列片段的长度范围3001
25、000 bp，而目标序列的长度范围是3100万bp，总的片段数目可达上千个。uDNA序列片段组装（又称序列拼接）的任务就是根据这些序列片段，重建目标DNA序列。如果能够得到DNA一条链的序列，那么根据互补原则，另一条链的序列也就得到了。2022-10-5南京农业大学 生命科学学院38C.基因组测序基因组测序u基因组的测序过程一般包括三个步骤：n建立克隆的物理图谱：如酵母人工染色体YAC克隆、细菌人工染色体BAC克隆等；n利用鸟枪法测定每个克隆的序列；n序列拼装和注释：当得到一段DNA序列之后，可以利用序列分析工具，进行序列的拼接；继而通过与数据库序列的比较，得到与该序列相关的信息，进而对序列的
26、生物学特性进行注释。2022-10-5南京农业大学 生命科学学院39v 鸟枪测序法：大分子DNA被随机地“敲碎”成许多小片段，收集这些随机小片段并将它们全部连接到合适的测序载体；小片段测序完成后，根据重叠区计算机将小片段整合出大分子DNA序列。这就是所谓的鸟枪测序法。C.基因组测序基因组测序u 鸟枪法测序的缺点n随着所测基因组总量增大，所需测序的片段大量增加，造成重复测定，也易丢失某些序列，且数据处理分析工作量大。n高等真核生物（如人类）基因组中有大量重复序列，导致判断失误。u 引物步移策略n将待测DNA片断克隆在质粒载体上，利用引物步移延伸，从DNA片断的一端开始逐步进行序列测定，直至另一端
27、为止。n克服了鸟枪法的盲目性，并省去亚克隆制备步骤，也减轻了数据分析工作量。n但由于测定下一段序列前要预先知道上游序列的碱基顺序，才能合成适当的引物进行测序。2022-10-5南京农业大学 生命科学学院40序列分析的自动化序列分析的自动化DNA杂交测序杂交测序原理原理杂交的检测杂交的检测杂交测序的应用杂交测序的应用q检测单碱基的变化检测单碱基的变化q序列比较分析序列比较分析q基因的表达状况基因的表达状况q验证其他测序验证其他测序nDNA芯片测序 基本原理基本原理 将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上,每个点播的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定每个点播的寡核苷酸
28、在排列的方阵中都有指定的位置的位置.待检测的待检测的DNA分子与芯片温浴分子与芯片温浴,凡是能凡是能杂交的寡核苷酸都会在确定位置发出信号杂交的寡核苷酸都会在确定位置发出信号,然后然后根据获取的信息将寡核苷酸的顺序进行对比组根据获取的信息将寡核苷酸的顺序进行对比组装装,拼接成完全的拼接成完全的DNA顺序顺序.1 ATACGTTA2 GTTAGATC3 ACGTTAGA4 CGTTAGAT5 GTTAGATCDNA 样品 TATGCAATCTAG与基因芯片上 65,000 种可能的八聚体进行杂交从而形成特定的结合图形计算机分析杂交图象并由探针的重叠情况推导样品的核酸序列1 ATACGTTA3 TA
29、CGTTAG4 ACGTTAGA2 CGTTAGAT5 GTTAGATC3 TACGTTAG4 ACGTTAGA2 CGTTAGAT互补序列为：ATACGTTAGATC样品序列为：TATGCAATCTAG利用基因芯片进行杂交测序的原理序列的组装序列的组装随机测序与序列组装随机测序与序列组装 随机测序也称随机测序也称”鸟枪法鸟枪法”.序列组装原理序列组装原理:直接从已测序的小片段中寻找彼此重叠的测直接从已测序的小片段中寻找彼此重叠的测序克隆序克隆,然后依次向两侧邻接的序列延伸然后依次向两侧邻接的序列延伸.优点优点:不需预先了解任何基因组的情况不需预先了解任何基因组的情况.ABCABCABCABC
30、小片段测序小片段测序计算机拼装计算机拼装 未来的测序技术主要包括：u质谱法质谱法(mass spectrometry)；u杂交测序法杂交测序法(seguencing by hybridization,SBH)；u单分子测序法单分子测序法(single-molecule seguencing)；u扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜(atomic probe microscopy）；u超薄水平凝胶电泳技术超薄水平凝胶电泳技术(Horizontal Ultrathin Gel Electropho resis,HUGE)；u毛细管电泳法毛细管电泳法(capillary gel electrophoresis,CE)；u芯片技术等。芯片技术等。“测序测序”思考回答问题思考回答问题1、Sanger双脱氧链终止法原理是什么双脱氧链终止法原理是什么2、使用、使用M13mp载体系列的优点有哪些载体系列的优点有哪些3、Maxam Gilbert化学修饰法的原理是什么化学修饰法的原理是什么4、DNA杂交测序原理是什么杂交测序原理是什么5、什么是寡核苷酸矩阵芯片、什么是寡核苷酸矩阵芯片6、杂交测序有什么应用、杂交测序有什么应用返回第二章Your Company Slogan
