1、第三章第三章 核酸分析与合成核酸分析与合成第一节第一节 核酸序列分析核酸序列分析1975年,Sanger加减法Maxam-Gilbert化学法1978年,Sanger末端终止法,1958 胰岛素顺序+1980 测序一、加减法1、原理*0-系统:不等长度片段*加法:T4 DNA Polymerase+1dNTP(35外切 5 3聚合)*减法:DNA PolymeraseI+3dNTP2、应用举例0-系统的产生加法系统与减法系统0系统的产生系统的产生 0系统系统 +A +G +C +T ATGCTG ATGCTG ATGCTG ATGCTG ATGCTG-TACGAC -TACGAC -TACGA
2、C -TACGAC -TACGAC-TACGA -TACGA -TACGA -TACGA -TACGA-TACG -TACG -TACG -TACG -TACG-TAC -TAC -TAC -TAC -TAC-TA -TA -TA -TA -TA-T -T -T -T -T 2种片段种片段 1种片段种片段 2种片段种片段 1种片段种片段 下划线为切去的碱基加法系统加法系统 0系统系统 -A -G -C -T ATGCTG ATGCTG ATGCTG ATGCTG ATGCTG-TACGAC -TACGAC -TACGAC-TACGAC -TACGAC-TACGA -TACGAC -TACGAC
3、-TACGA -TACGAC-TACG -TACG -TACGAC -TACGA -TACGAC-TAC -TACG -TAC -TACGA -TACGAC-TA -TACG -TAC -TA -TACGAC-T -T -TAC -TA -TACGAC 3种片段种片段 2种片段种片段 3种片段种片段 1种片段种片段下划线为加上的碱基下划线为加上的碱基减法系统减法系统5标记后电泳、放射自显影:标记后电泳、放射自显影:读序与模板的关系、加减系统存在的必要、读序与模板的关系、加减系统存在的必要、0系统存在的必要系统存在的必要 ATGCTG -A G C -T +A +G +C +T 0 减法减法 加
4、法加法 5-TACGAC C 3 -TACGA A -TACG G -TAC C -TA A -T T 5二、特异化学试剂裂解法二、特异化学试剂裂解法1、原理、原理:化学修饰碱基化学修饰碱基-糖苷键和磷酸酯键不稳定糖苷键和磷酸酯键不稳定而水解而水解2、特异化学试剂裂解、特异化学试剂裂解嘌呤嘌呤-硫酸二甲酯硫酸二甲酯 嘧啶嘧啶-肼和呱啶肼和呱啶*裂解裂解G和和A的反应(的反应(GA)*强化强化A的裂解(的裂解(AG)*裂解裂解C和和T的反应的反应*裂解裂解C的反应的反应举例举例 5*pGTACGA AG C+T C5*pG 5*pG 5*pGT ll5*pGTA 5*pGTA 5*pGTAC 5
5、*pGTAC GA AG C+T C C A T G 5 三、末端终止法三、末端终止法DNA聚合酶聚合酶I及及 2,3-双脱氧核苷酸(双脱氧核苷酸(ddNTP)1、原理原理(genetic-rec-seq)2、单链的产生:单链的产生:M133、停止与压缩反应停止与压缩反应停止停止-M13的二级结构,阻止延伸的二级结构,阻止延伸-提高温度提高温度压缩压缩-由于产物的二级结构,多条条带走到一由于产物的二级结构,多条条带走到一起起-改变变性胶条件改变变性胶条件4、测序自动化、测序自动化 3 GTAGCAACT 5 d(ACG)TP+dTTP+ddTTP d(ACT)TP+dGTP+ddGTP d(A
6、GT)TP+dCTP+ddCTP d(GCT)TP+dATP+ddATP T组组 G组组 C组组 A组组3 GTAGCAACT 3 GTAGCAACT 3 GTAGCAACT 3 GTAGCAACT5 CAddT*5 CATCddG*5 CATddC*5 CddA*CATCGddT*CATCGTTddG*ddC*CATCGTTGddA*CATCGTddT*AGTTGCTAC电电泳泳方方向向 DNA测序中作链终止剂的核苷类似物测序中作链终止剂的核苷类似物 n2,3-双脱氧核糖核苷5-三磷酸 复习提纲1、加减法DNA测序的原理及其实例。2、特异化学试剂裂解法进行DNA测序的原理和实例。3、末端终止
7、法进行DNA测序的原理和实例。4、什么是停止与压缩反应?第二节第二节 基因的化学合成及诱基因的化学合成及诱变变1955 Todd 二核苷一磷酸二核苷一磷酸磷酸二酯磷酸二酯-磷酸三酯磷酸三酯-亚磷酸三酯亚磷酸三酯液相液相-固相固相-自动化自动化1981 有活性有活性tRNAAla-上海生化所上海生化所-世界上第一世界上第一个具有全部生物活性的人工核酸分子个具有全部生物活性的人工核酸分子 一、化学合成法一、化学合成法1、保护基及其去除、保护基及其去除 核糖核糖-OH、P、碱基的碱基的NH2 对对保护基保护基的要求:无付反应、稳定、易脱、脱的要求:无付反应、稳定、易脱、脱保时链完整保时链完整2、缩合
8、剂、缩合剂磷酸酯键的形成(脱水反应、有机溶剂进行)磷酸酯键的形成(脱水反应、有机溶剂进行)双环己基碳二亚胺双环己基碳二亚胺 DCC三甲基苯磺酰氯三甲基苯磺酰氯 MS3、合成方法合成方法(1)磷酸二酯法)磷酸二酯法付产物多、产率低、操作复杂付产物多、产率低、操作复杂保护的基团保护基的分子式缩写符号保护基的去除方法末端磷酸基-CH2-CH2-CN-氰乙基-CE碱解、氨解核苷间磷酸基Cl-?对氯苯基PCP碱解、氨解2-OH-COCH3乙酰基Ac同上G-NH2-COCH(CH3)2iB浓氨水(2)磷酸三酯法磷酸三酯法:核苷间的磷酸基以三酯存在核苷间的磷酸基以三酯存在付产物少、磷酸基被保护可用硅胶柱分离
9、、产付产物少、磷酸基被保护可用硅胶柱分离、产率高、反应时间短速度快率高、反应时间短速度快(3)亚磷酸三酯法亚磷酸三酯法反应速度快、可反应速度快、可固相合成固相合成原理:原理:*末端核苷(末端核苷(3的第一个碱基)固定在的第一个碱基)固定在高分子化合物上(聚苯乙烯纤维、硅胶、微高分子化合物上(聚苯乙烯纤维、硅胶、微孔玻璃珠)孔玻璃珠)*循环反应循环反应*洗涤除去未反应物和付产物、简化分纯、加洗涤除去未反应物和付产物、简化分纯、加快速度快速度4、合成寡核苷酸纯化方法、合成寡核苷酸纯化方法*脱盐:(乙醇沉淀、分子筛、反相柱脱盐:(乙醇沉淀、分子筛、反相柱C18)纯度低纯度低*OPC柱纯化:(柱纯化:
10、(DMT)有短链、不适合基因合成和有短链、不适合基因合成和DNA序列分析、不宜纯化多于序列分析、不宜纯化多于40mer的的oligo*HPLC纯化:吸附于反相柱的差异、用于纯化:吸附于反相柱的差异、用于PCR反应;反应;基因合成和基因合成和DNA序列分析序列分析(较纯,(较纯,40mer、Grich不适用、设备要求高)不适用、设备要求高)*PAGE纯化:可用于任何反应(最纯、无限制、但纯化:可用于任何反应(最纯、无限制、但费事、有毒)费事、有毒)二、寡核苷酸化学合成的实际用途二、寡核苷酸化学合成的实际用途(1)基因合成的元件)基因合成的元件(2)核苷酸序列分析的引物)核苷酸序列分析的引物(3)
11、核酸分子杂交的探针)核酸分子杂交的探针(4)突变研究)突变研究三、基因突变三、基因突变1、寡核苷酸诱发基因定点突变、寡核苷酸诱发基因定点突变(1)原理)原理突变的寡核苷酸为引物合成突变的寡核苷酸为引物合成DNA-复制复制-突变突变(2)寡核苷酸诱发定点突变)寡核苷酸诱发定点突变过程过程M13正链正链DNA与突变引物结合与突变引物结合-延伸制备异源双链延伸制备异源双链DNA分子分子-异源双链异源双链DNA分子的富集(分子的富集(S1核酸酶、碱核酸酶、碱性蔗糖密度梯度离心)性蔗糖密度梯度离心)-转化转化-筛选(序列分析、筛选(序列分析、限制酶切、杂交、生物学)限制酶切、杂交、生物学)突变位点保护:
12、错配碱基外有一个以上碱基突变位点保护:错配碱基外有一个以上碱基2、缺失突变、缺失突变(1)特定位点)特定位点*酶切(只产生一个酶切位点)酶切(只产生一个酶切位点)*缺失突变探针缺失突变探针(2)随机位点)随机位点*DNaseI-在双链产生单链缺口在双链产生单链缺口-缺口扩大缺口扩大-S1平端化平端化-重新环化重新环化=一组缺失突变体一组缺失突变体3、插入突变、插入突变(1)位点特异性插入位点特异性插入(利用限制酶位点)(利用限制酶位点)(2)随机插入随机插入(利用化学合成的接头)(利用化学合成的接头)/-AAGCTT-GAATTC-/EcoRI /-AAGCTT-G AATTC-/Pol/-T
13、TCGAA-CTTAAG-/-TTCGAA-CTTAA G-/-AAGCTT-GAATTAATTC-/-TTCGAA-CTTAATTAAG-/4、盒式突变、盒式突变(cassette mutagenesis)原理:通过一次寡核苷酸的合成,在一段原理:通过一次寡核苷酸的合成,在一段DNA区域内(区域内(20-80nt)产生众多的突变产生众多的突变在预定位点,除正常核苷酸外,以在预定位点,除正常核苷酸外,以10%添添加另三种核苷酸加另三种核苷酸一组兼并寡核苷酸一组兼并寡核苷酸复习提纲5、化学法合成核酸时,哪些基团需要保护?对保护基的要求是什么?6、核酸的化学合成都有哪些方法?现在常用的是哪种?其原理和过程是什么?7、合成寡核苷酸纯化方法有哪些?各有怎样的应用范围和局限?8、寡核苷酸化学合成的实际用途?9、寡核苷酸诱发基因定点突变的原理和过程。10、如何诱发缺失突变?如何诱发插入突变?11、什么是盒式突变?其原理是什么?