1、2022-11-25张星元：发酵原理（讲座）21 代谢代谢设计育种的策划设计育种的策划2 育种方案的实施育种方案的实施代谢设计育种代谢设计育种2022-11-25张星元：发酵原理（讲座）31.代谢设计育种的策划代谢设计育种的策划1.1 目的产物代谢途径的组合目的产物代谢途径的组合 （五段式）（五段式）1.2 中心代谢流上节点的分析中心代谢流上节点的分析1.3 理想载流途径的推定理想载流途径的推定 1.4 五字策略的应用五字策略的应用2022-11-25张星元：发酵原理（讲座）41.1 目的产物代谢途径的组合目的产物代谢途径的组合（五段式）（五段式）目的产物合成代谢的目的产物合成代谢的“五段式五
2、段式”2022-11-25张星元：发酵原理（讲座）5 1.2 中心代谢流上节点的分析中心代谢流上节点的分析 代谢网络上的交叉点（代谢中代谢网络上的交叉点（代谢中间化合物）叫做代谢网络的节点。间化合物）叫做代谢网络的节点。节点有刚性和挠性之分。挠性节点节点有刚性和挠性之分。挠性节点处的流量分配容易发生改变，任何处的流量分配容易发生改变，任何分支可以得到分支可以得到 100%的流量。刚性的流量。刚性或弱刚性节点的流量分配比例不容或弱刚性节点的流量分配比例不容易发生改变。易发生改变。2022-11-25张星元：发酵原理（讲座）6SSP1P1P2P2P1 I P1 IP2 IP2 I P1 A P2
3、A强刚性节点强刚性节点弱刚性节点弱刚性节点优优2022-11-25张星元：发酵原理（讲座）7 尽管代谢网络包含了大量的节点，尽管代谢网络包含了大量的节点，但通常只有几个节点直接影响产物的转但通常只有几个节点直接影响产物的转化率，称为主要节点。对赖氨酸生产来化率，称为主要节点。对赖氨酸生产来说，有五个分支点处流量的分配率受到说，有五个分支点处流量的分配率受到培养条件较大的影响，它们是培养条件较大的影响，它们是 G-6-P、F-6-P、PEP、PYR 及及OAA。在这些分在这些分支点中，只有支点中，只有G-6-P 和和 PEP/PYR，被被认为是有用的主要节点。通过认为是有用的主要节点。通过扰动节
4、点扰动节点处代谢流量的方法可以做出判断。处代谢流量的方法可以做出判断。2022-11-25张星元：发酵原理（讲座）8PEPPYROAAG6P挠性节点挠性节点刚性节点刚性节点 赖氨酸生物合成的网络结构推测试验赖氨酸生物合成的网络结构推测试验LysAcCoAPYREXTF6PGlcGA6P2022-11-25张星元：发酵原理（讲座）9 网络刚性是自然选择的结果，是网络刚性是自然选择的结果，是细胞经济体系的保障作用的体现。刚细胞经济体系的保障作用的体现。刚性节点是由反馈调节和交叉激活等代性节点是由反馈调节和交叉激活等代谢自动调节机制来支持的，谢自动调节机制来支持的，解除调节解除调节可望改变节点的性质
5、。可望改变节点的性质。然而，代谢自然而，代谢自动调节机制不但包括反馈调节和交叉动调节机制不但包括反馈调节和交叉激活。激活。刚性节点的支持背景刚性节点的支持背景尚未弄清尚未弄清的时候，只好绕过该刚性节点，先解的时候，只好绕过该刚性节点，先解决其它节点的问题。决其它节点的问题。2022-11-25张星元：发酵原理（讲座）10 根据文献和实验推测。实验包根据文献和实验推测。实验包括离线推定和在线推定。括离线推定和在线推定。1.3 理想载流途径的推定理想载流途径的推定 2022-11-25张星元：发酵原理（讲座）11NPP进进出出通通节节堵堵1.4 五字策略的应用五字策略的应用2022-11-25张星
6、元：发酵原理（讲座）12 节点的刚性取决于微生物代节点的刚性取决于微生物代谢的自动调节机制。因此在应用谢的自动调节机制。因此在应用“五字策略五字策略”制订育种方案时制订育种方案时必须认真分析代谢网络和节点的必须认真分析代谢网络和节点的刚性及其形成的机理，尽量采用刚性及其形成的机理，尽量采用协调（如：调节突变株）而不是协调（如：调节突变株）而不是一刀切（如：营养缺陷型突变株）一刀切（如：营养缺陷型突变株）的手段。的手段。2022-11-25张星元：发酵原理（讲座）132 育种方案的实施育种方案的实施2.1 出发菌种的选定出发菌种的选定2.2 遗传操作方案的制定遗传操作方案的制定2.3 遗传操作方
7、案的实施遗传操作方案的实施2.4 变异株培养条件的优化变异株培养条件的优化2022-11-25张星元：发酵原理（讲座）14 调节机制简单：文献调节机制简单：文献 遗传标记可靠：文献，实验遗传标记可靠：文献，实验 生长情况良好：实验，观察生长情况良好：实验，观察 有目的产物的生产潜力：哲学思辨有目的产物的生产潜力：哲学思辨 可以获得可以获得 经费方面可行经费方面可行2.1 出发菌种的选定出发菌种的选定2022-11-25张星元：发酵原理（讲座）15 物理诱变物理诱变 化学诱变化学诱变 复合诱变复合诱变 定向诱变定向诱变 插入基因拷贝插入基因拷贝 插入途径基因组插入途径基因组2.2 遗传操作方案的
8、制定遗传操作方案的制定2022-11-25张星元：发酵原理（讲座）16 缺陷型突变株的获得缺陷型突变株的获得 结构类似物抗性突变株的获得结构类似物抗性突变株的获得 结构类似物超敏性突变株的获得结构类似物超敏性突变株的获得 分子生物学方法（略）分子生物学方法（略）2.3 遗传操作方案的实施遗传操作方案的实施2022-11-25张星元：发酵原理（讲座）17 营养因子、酶和功能性蛋白质营养因子、酶和功能性蛋白质 营养缺陷与渗漏营养缺陷突变株营养缺陷与渗漏营养缺陷突变株 酶缺损突变株酶缺损突变株 输送体系缺损突变株输送体系缺损突变株 条件突变株条件突变株 突变株的获得突变株的获得2022-11-25张
9、星元：发酵原理（讲座）18（1）营养因子：氨基酸、维生素、嘌）营养因子：氨基酸、维生素、嘌呤和嘧啶（经离心途径合成）。呤和嘧啶（经离心途径合成）。（2）酶：）酶：中心代谢途径的酶中心代谢途径的酶（特别特别是与生长密切相关的酶是与生长密切相关的酶）、）、向心途径向心途径的酶、离心途径的酶。的酶、离心途径的酶。（3）功能性蛋白：调节酶、专一性的）功能性蛋白：调节酶、专一性的输送蛋白、调节蛋白、输送蛋白、调节蛋白、以及以及 电子传递电子传递链的多肽成员、链的多肽成员、ATP 酶等。酶等。营养因子、酶和功能性蛋白质营养因子、酶和功能性蛋白质2022-11-25张星元：发酵原理（讲座）19（1）营养缺陷
10、突变株）营养缺陷突变株（2）渗漏营养缺陷突变株）渗漏营养缺陷突变株MM MM+FCM营养缺陷与渗漏营养缺陷突变株检出营养缺陷与渗漏营养缺陷突变株检出无营养缺陷无营养缺陷其他营其他营养缺陷养缺陷F营养缺陷营养缺陷2022-11-25张星元：发酵原理（讲座）20结构类似物（代谢撷颃物）的选择：结构类似物（代谢撷颃物）的选择：一、空间结构类似，一、空间结构类似，二、对微生物有致死性或毒性（抑二、对微生物有致死性或毒性（抑制生长）；绝大多数情况下，结构类似制生长）；绝大多数情况下，结构类似物可被其物可被其“真身真身”解毒。解毒。三、有些抗生素、药物（包括中三、有些抗生素、药物（包括中药）、诱变剂本身就
11、是结构类似物（代药）、诱变剂本身就是结构类似物（代谢撷颃物），但需确证。谢撷颃物），但需确证。2022-11-25张星元：发酵原理（讲座）21 结构类似物的确定结构类似物的确定 生长抑制试验和敏感性试验生长抑制试验和敏感性试验 “筛子筛子”的设计的设计 剂量的确定剂量的确定 筛选的具体方法的确定筛选的具体方法的确定 高产株的检出高产株的检出结构类似物抗性突变株的获得结构类似物抗性突变株的获得2022-11-25张星元：发酵原理（讲座）22结构类似物的确定及其抗性突变株的检出结构类似物的确定及其抗性突变株的检出AAA对照对照实验（纸片法）实验（纸片法）2022-11-25张星元：发酵原理（讲座）
12、23生长抑制试验和敏感性试验生长抑制试验和敏感性试验2022-11-25张星元：发酵原理（讲座）24（1）根据反馈调节机制设计）根据反馈调节机制设计（2）同时要考虑协同调节机制等）同时要考虑协同调节机制等（3）要考虑实验的成本问题）要考虑实验的成本问题（4）根据问题的轻重缓急设计）根据问题的轻重缓急设计“筛子筛子”的设计的设计2022-11-25张星元：发酵原理（讲座）25（1）浓度梯度平板筛选法）浓度梯度平板筛选法（2）纸片法）纸片法（3）液体培养浓缩后涂布的方法）液体培养浓缩后涂布的方法（4）其他方法）其他方法筛选的具体方法的确定筛选的具体方法的确定2022-11-25张星元：发酵原理（讲
13、座）26（1）反馈调节的调节突变株：抗性）反馈调节的调节突变株：抗性（2）输送体系突变株：抗性）输送体系突变株：抗性（3）影响与底物的亲和能力的突）影响与底物的亲和能力的突 变株：超敏性变株：超敏性（4）对入围的突变株进行产量形状）对入围的突变株进行产量形状 的筛选的筛选高产株的检出高产株的检出2022-11-25张星元：发酵原理（讲座）27 尽量从生物学的角度安排试验尽量从生物学的角度安排试验 尽量排除培养基消毒、摇瓶培养条尽量排除培养基消毒、摇瓶培养条 件不一致带来的系统误差件不一致带来的系统误差 每批摇瓶（生物）试验都要做对照每批摇瓶（生物）试验都要做对照 注重产量与菌体量之间的的微妙注
14、重产量与菌体量之间的的微妙 关系（生物机器的特殊性）关系（生物机器的特殊性）2.4 变异株培养条件的优化变异株培养条件的优化2022-11-25张星元：发酵原理（讲座）28 对于发源于农产加工和农业化学的对于发源于农产加工和农业化学的手工作坊式的发酵生产来说，要摆脱繁手工作坊式的发酵生产来说，要摆脱繁重的体力劳动，就必须走工业化的道路。重的体力劳动，就必须走工业化的道路。于是，发酵生产首先向化学工业靠拢，于是，发酵生产首先向化学工业靠拢，通过向化学工程学习，用泵和管道输送通过向化学工程学习，用泵和管道输送替代了肩挑手提的人力搬运，以机器生替代了肩挑手提的人力搬运，以机器生产代替了手工操作，早已
15、把作坊式的发产代替了手工操作，早已把作坊式的发酵生产成功地推上了工业生产的水平。酵生产成功地推上了工业生产的水平。发酵生产与化学工程的结合促成了发酵发酵生产与化学工程的结合促成了发酵生产的第一次飞跃生产的第一次飞跃。2022-11-25张星元：发酵原理（讲座）29 生产实践已经证明工业发酵过程是生产实践已经证明工业发酵过程是一个随着时间变化的（时变的）、非线一个随着时间变化的（时变的）、非线性的、多变量输入和输出的动态过程，性的、多变量输入和输出的动态过程，按照化学工程的模式处理工业发酵的问按照化学工程的模式处理工业发酵的问题，微生物细胞屈居于催化剂的地位，题，微生物细胞屈居于催化剂的地位，难
16、以发挥其生产潜力。难以发挥其生产潜力。十多年来，我们十多年来，我们从研究微生物的生命活动规律入手，从研究微生物的生命活动规律入手，把把现代生物学关于能量转换的电子流动、现代生物学关于能量转换的电子流动、物质流动和信息流动这三个基本观点引物质流动和信息流动这三个基本观点引入了工业发酵入了工业发酵，重新审视发酵工程。，重新审视发酵工程。2022-11-25张星元：发酵原理（讲座）30 用生物学的眼光重新审视发用生物学的眼光重新审视发酵工程，确认了发酵工程的生物酵工程，确认了发酵工程的生物学属性。从生物科学的高度在发学属性。从生物科学的高度在发酵工程领域首先提出了酵工程领域首先提出了微生物细微生物细
17、胞机器胞机器的新概念和新思路。的新概念和新思路。2022-11-25张星元：发酵原理（讲座）31（1）现代发酵工程依靠微生物来完成）现代发酵工程依靠微生物来完成发酵工厂生产线上的不可缺少的加工发酵工厂生产线上的不可缺少的加工（或转化）步骤，在这个意义上，微生（或转化）步骤，在这个意义上，微生物细胞就是工业发酵生产线上不可缺少物细胞就是工业发酵生产线上不可缺少的特殊机器的特殊机器微生物微生物“细胞机器细胞机器”。因而，没有微生物就没有发酵工程，没因而，没有微生物就没有发酵工程，没有微生物细胞机器就没有现代发酵工厂。有微生物细胞机器就没有现代发酵工厂。微生物是发酵工程的灵魂。微生物是发酵工程的灵魂
18、。我们认为：我们认为：2022-11-25张星元：发酵原理（讲座）32（2）微生物细胞机器与普通意）微生物细胞机器与普通意义上的机器不同，必须在生产线义上的机器不同，必须在生产线上完成细胞机器的上完成细胞机器的“在线制造在线制造”和和“生产运行生产运行”的双重任务，因的双重任务，因而，必须兼顾细胞机器的量和细而，必须兼顾细胞机器的量和细胞机器的工作效率。胞机器的工作效率。我们认为：我们认为：2022-11-25张星元：发酵原理（讲座）33（3）微生物细胞机器按其自身）微生物细胞机器按其自身固有的规律运行，因而，必须深固有的规律运行，因而，必须深入研究微生物细胞机器的工作原入研究微生物细胞机器的
19、工作原理，应顺自然规律，引导微生物理，应顺自然规律，引导微生物为我们服务。为我们服务。我们认为：我们认为：2022-11-25张星元：发酵原理（讲座）34（4）发酵工程具有的生物学属性，）发酵工程具有的生物学属性，现代发酵工程必须向生物学靠拢。发现代发酵工程必须向生物学靠拢。发酵生产与生物学的结合酝酿着发酵工酵生产与生物学的结合酝酿着发酵工程的又一次革命性的飞跃。发酵工程程的又一次革命性的飞跃。发酵工程将在生物学和化学的支撑下，进入新将在生物学和化学的支撑下，进入新的发展阶段，成为生物工程的一个重的发展阶段，成为生物工程的一个重要的组成部分。要的组成部分。我们认为：我们认为：2022-11-25张星元：发酵原理（讲座）35我们认为：我们认为：必须全面地、历史地研究微必须全面地、历史地研究微生物的代谢。必须让微生物生理生物的代谢。必须让微生物生理学家、发酵工程专家和自动控制学家、发酵工程专家和自动控制专家三种头脑合而为一，互动地专家三种头脑合而为一，互动地开展研究，才能做出新型发酵的开展研究，才能做出新型发酵的开创新的工作。开创新的工作。2022-11-25张星元：发酵原理（讲座）36尊重自然规律，活用自然规律，尊重自然规律，活用自然规律，为人类造福，为世界消灾。为人类造福，为世界消灾。
