1、细胞工程的研究范畴细胞工程的研究范畴细胞与组织培养 细胞融合 细胞核移植 染色体工程 胚胎工程 干细胞与组织工程 转基因生物与生物反应器.第二章第二章 细胞培养细胞培养及培养细胞的生物学特点及培养细胞的生物学特点.第一节第一节 组织培养组织培养(tissue culture)组织培养（组织培养（tissue culturetissue culture）习惯上泛指所有的体外培养，即器官培养、组织培养和细胞培养的总称。其本意是指从活的机体中取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外建立无菌、适温和一定营养条件等，使之生长和生存，并维持其结构和功能的技术称为组织培养。组织培养这一名词实际上是一个通用
2、名词，其实际内容根据培养物的不同可概括为三个不同概念：一、组织培养的基本概念、组织培养的基本概念.组织培养：组织培养：将活体的一小片组织放在盛有培养液的玻璃或塑料培养器皿中，待组织块粘着后，沿底面平面移动生长的过程称为组织培养。从组织块中生长出来的仍然是细胞，细胞在生长的同时也发生移动，至使组织中的培养难以长时间维持其原有结构，结果也就成了细胞培养。细胞培养：细胞培养：将组织块用机械方法或酶解法分离成单个细胞，做成细胞悬液，再培养于固体基质上，成单层细胞生长，或在培养液中呈悬浮状态培养的技术称为细胞培养。器官培养：器官培养：所谓器官培养，是指采取某些措施使器官的原基、器官的一部分或整个器官在体
3、外存活、生长，并保持其原有结构和功能的培养技术称为器官培养。.体外培养的种类体外培养的种类.二、细胞培养的优点二、细胞培养的优点.1.1.研究的对象是活细胞研究的对象是活细胞 在实验过程中，根据要求可始终保持细胞活在实验过程中，根据要求可始终保持细胞活力，并可长时间监控、检测甚至定量评估一部分力，并可长时间监控、检测甚至定量评估一部分活细胞的情况，包括活细胞的形态、结构、生命活细胞的情况，包括活细胞的形态、结构、生命活动等。活动等。.2.2.研究条件可以人为控制研究条件可以人为控制 可以根据需要，控制包括可以根据需要，控制包括pHpH、温度、氧气、温度、氧气、二氧化碳、张力等物理化学的条件，同
4、时，可以二氧化碳、张力等物理化学的条件，同时，可以施加化学、物理、生物等因素作为条件而进行实施加化学、物理、生物等因素作为条件而进行实验观察，这些因素同样可以处于严格控制之下。验观察，这些因素同样可以处于严格控制之下。.3.研究的样本可以达到比较均一性研究的样本可以达到比较均一性 通过细胞培养一定代数后，所得到的细胞系通过细胞培养一定代数后，所得到的细胞系则可以达到均一性而属于同一类型的细胞，需要则可以达到均一性而属于同一类型的细胞，需要时，可采用克隆化等方法使细胞达到纯化。时，可采用克隆化等方法使细胞达到纯化。.4.4.研究内容便于观察、检测和记录研究内容便于观察、检测和记录 采用各种研究技
5、术、记录方法：采用各种研究技术、记录方法：研究研究:倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显 微镜、流式细胞术、激光共焦显微镜、免疫微镜、流式细胞术、激光共焦显微镜、免疫 组织化学、原位杂交、同位素标记组织化学、原位杂交、同位素标记 记录记录:摄影照片、缩时电影、电视摄影照片、缩时电影、电视.5.5.研究的范围比较广泛研究的范围比较广泛 学科多：病毒学、免疫学、肿瘤学、遗传学、临床学科多：病毒学、免疫学、肿瘤学、遗传学、临床 医学等医学等 对象广：对象广：各种动物：低等动物、高等动物、人类各种动物：低等动物、高等动物、人类 一种动物：不同年龄、不同组织、正常或一种动
6、物：不同年龄、不同组织、正常或 异常（肿瘤）异常（肿瘤）.6.6.研究的费用相对较经济研究的费用相对较经济 可提供大量、同一时期、重复性好的、生可提供大量、同一时期、重复性好的、生物学性状相似的实验对象。物学性状相似的实验对象。.三、细胞培养的缺点三、细胞培养的缺点.v1、体外培养的细胞，尤其是反复传代、长期培养者，有可能发生染色体非二倍体改变等情况。v2、细胞培养对人员、设备等条件都要求较高。这些都影响细胞培养技术的更广泛应用。v3、动物细胞的培养对营养的要求较高。v4、动物细胞培养的另一个突出特点，是对环境条件要求严格。.正确认识：正确认识：现在人工模拟体内环境的技术已经很高现在人工模拟体
7、内环境的技术已经很高,但但,人工所模拟的条件人工所模拟的条件与与体内体内实际情况仍实际情况仍不完全相同，不完全相同，当细胞被置于当细胞被置于体外培养体外培养后后,生活在缺乏动态平衡的环境生活在缺乏动态平衡的环境中中,久了，必然久了，必然发生变化发生变化。因此，对于体外培养的细胞，应该把他们视作一种因此，对于体外培养的细胞，应该把他们视作一种既能保持动物体内原细胞一定的性状、结构和功能又既能保持动物体内原细胞一定的性状、结构和功能又具有某些改变的特定的细胞群体具有某些改变的特定的细胞群体，而不能将之与体内，而不能将之与体内的细胞完全等同。的细胞完全等同。.第二节第二节 细胞培养的细胞生物学细胞培
8、养的细胞生物学.一、体内外细胞的差异及分化一、体内外细胞的差异及分化.（一）体内外细胞的差异（一）体内外细胞的差异 培养细胞最多见的表现是：失去原有组织结构和细胞培养细胞最多见的表现是：失去原有组织结构和细胞形态，分化减弱或不显，出现类似形态，分化减弱或不显，出现类似“反祖反祖”现象；表现现象；表现为细胞趋单一化，或获得不死性，或变成具有恶性性状的为细胞趋单一化，或获得不死性，或变成具有恶性性状的细胞群。细胞群。.1.与体内主要不同与体内主要不同 相对孤立、相对单一，缺乏体内的系统作相对孤立、相对单一，缺乏体内的系统作用，失去神经体液的调节和细胞相互间的影响。用，失去神经体液的调节和细胞相互间
9、的影响。.2.2.主要表现主要表现 失去原有组织结构和细胞形态失去原有组织结构和细胞形态 分化减弱或不显分化减弱或不显 细胞趋向单一化；细胞趋向单一化；3.3.提示提示要正确认识体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体。要正确认识体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体。.（二）培养细胞的分化（二）培养细胞的分化1不适应(Deadaption)：表现为，细胞在原体内时所拥有的分化特性减弱或不显，如肝细胞产生酪氨酸转移酶(Tyrosine Aminotranserase)特性的丧失.2脱分化或去分化(Dedifferentiation)细胞也可能出现脱分化或去分化，即细胞失掉发生分化的能力。
10、.二、培养细胞形态分类二、培养细胞形态分类.体外细胞培养物的生长类型体外细胞培养物的生长类型 按生长方式分为两种类型按生长方式分为两种类型 贴附型贴附型细胞细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。悬浮型悬浮型细胞细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下 即可生长的细胞。即可生长的细胞。绝大多数有机体细胞属粘附型细胞，只有少数细胞类绝大多数有机体细胞属粘附型细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。.贴附贴附(粘附粘附)型细胞型细胞 粘附粘
11、附:是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式在方式结果结果：基于粘附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织，：基于粘附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织，有机体的绝大多数细胞必须粘附于一固相表面才能生存和有机体的绝大多数细胞必须粘附于一固相表面才能生存和生长。生长。培养时：培养时：这些细胞被放到体外环境中以后这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要粘附于同样需要粘附于某一固相表面才能生存和生长，因而属于粘附型细胞。某一固相表面才能生存和生长，因而属于粘附型细胞。粘附粘附(锚定或锚着锚定或锚着)依赖型依赖型(性性)细胞：细胞：唯有粘附于
12、固相表面才唯有粘附于固相表面才能生存的细胞。能生存的细胞。.细胞在体内、外的粘附方式：存在差异细胞在体内、外的粘附方式：存在差异 体内：粘附是全方位体内：粘附是全方位 外形具有复杂的立体特征外形具有复杂的立体特征 体外：多数情况，细胞只有一个附着平面体外：多数情况，细胞只有一个附着平面 外形一般与体内时明显不同外形一般与体内时明显不同 按照培养细胞粘附生长时的主要形态，可分按照培养细胞粘附生长时的主要形态，可分为为4 4大类型大类型.分类分类 根据形态大致的不同，主要根据形态大致的不同，主要4 4类：类：上皮细胞型上皮细胞型 成纤维细胞型成纤维细胞型 游走细胞性游走细胞性 多形型细胞多形型细胞
13、.上皮细胞型上皮细胞型 名称：仅形态上似体内，实际上不完全等于名称：仅形态上似体内，实际上不完全等于。来源：来源于来源：来源于外胚层外胚层，内胚层细胞，内胚层细胞 如：皮肤及其衍生物如：皮肤及其衍生物 消化道，乳腺，肺泡消化道，乳腺，肺泡 上皮性肿瘤上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞形态：类似体内的上皮细胞 扁平，不规则多角形，中有圆形核扁平，不规则多角形，中有圆形核.生长特点生长特点 易相连成片，易相连成片，相靠紧密相连，相靠紧密相连，成薄层铺石状。成薄层铺石状。生长时呈膜状生长时呈膜状移动，很少脱离移动，很少脱离细胞群而单个活动细胞群而单个活动 体外培养细胞类型（体外培养细胞类型（1）上皮
14、细胞型上皮细胞型.成纤维细胞型成纤维细胞型 名称：名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的凡在培养中形态与成纤维细胞类似的来源：来源：由中胚层间充质组织起源的组织由中胚层间充质组织起源的组织 如：真正的成纤维细胞、心肌、平滑肌、如：真正的成纤维细胞、心肌、平滑肌、成骨细胞，血管内皮。成骨细胞，血管内皮。形态：形态：似体内成纤维细胞的形态似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形胞体梭形或不规则三角形 胞质向外伸出胞质向外伸出23个长短不等的突起个长短不等的突起 中有卵圆形核中有卵圆形核.生长特点生长特点 排列成放射状，排列成放射状，漩涡状，并不紧漩涡状，并不紧靠连成片，细靠连成片，细胞胞细胞
15、接触易细胞接触易断开而单独行动。断开而单独行动。游离的单独的成游离的单独的成纤维样细胞，常纤维样细胞，常有几个伸长的细有几个伸长的细胞突起。胞突起。体外培养细胞类型（体外培养细胞类型（2 2）成纤维细胞型成纤维细胞型.v游走细胞型游走细胞型v 细胞质常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，贴附于支持物上散在生长，一般不连接成片。该类细胞形状很不稳定，有时与上皮样细胞 或成纤维细胞难以区别。单核细胞、巨噬细胞及某些肿瘤细胞在体外培养时常呈现此种形态。.v多形型细胞多形型细胞v 生长时像神经细胞那样呈多角形，并伸出较长的神经纤维，很难确定它们的形状，因而我们将此类细胞称为多形型细胞。体外培养时常
16、见的多形型细胞是神经元和神经胶质细胞。.贴附生长型的培养特点贴附生长型的培养特点1.与体内同名的细胞不完全相同与体内同名的细胞不完全相同 如：如：形态相似形态相似的成纤维细胞，的成纤维细胞，可不同来源可不同来源。自同一动物不同组织的成纤维样细胞相自同一动物不同组织的成纤维样细胞相 似但似但发展趋向不同发展趋向不同2.2.培养细胞的形态不稳定培养细胞的形态不稳定 条件改变条件改变，细胞形态，细胞形态可能有变化可能有变化 .培养细胞形态不稳定培养细胞形态不稳定血清 Hela 高血清 低血清 成纤维细胞样 上皮样细胞 pH Hela 太酸或太碱 标准pH 成纤维细胞样 上皮样细胞 细胞密度 3T3
17、低密度 高密度 成纤维细胞样 上皮样细胞 生长状态改变 悬浮或贴附 悬浮 贴附 圆形 成纤维或上皮样 转化与否 未转化 转化后 成纤维样 可成上皮样.悬浮生长型悬浮生长型概念概念 培养时培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机或以机械方法使保持悬浮状态下生长械方法使保持悬浮状态下生长来源来源 自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞。癌、肿细自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞。癌、肿细胞也可能胞也可能特点特点 在在悬浮中生长良好悬浮中生长良好，细胞，细胞圆形圆形，单个或小细胞，单个或小细胞团团.优点优点 生存空间大，提供数量大生存空间大，提供数量大 传代方便传代方便(不需消化不需
18、消化)易于收获易于收获 可获得稳定状态可获得稳定状态缺点缺点 观察不方便观察不方便 很多细胞不能悬浮生长很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞尤以正常细胞).三、培养细胞的生长特点三、培养细胞的生长特点.（一）贴附（二）接触抑制（三）密度抑制.四、培养细胞的生长和增殖过程四、培养细胞的生长和增殖过程.（一）单个细胞的生长过程（一）单个细胞的生长过程.（二）培养细胞生命期二）培养细胞生命期 (Life Span of Culture Cells)所谓培养细胞生命期培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。包括原代培养期、传代培养期及衰退期。.正常培养的细胞周期.原代培养原代培养(Prim
19、ary Culture)(Primary Culture)期期 也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1-4周。特点特点：细胞呈活跃移动，可见细胞分裂，但不旺盛。与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。.特点特点：在全生命期中此期的持续时间最长，细胞增殖旺 盛，并能维持二倍体核型。传代期：传代期：传代传代：体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代。初代培养的细胞一经传代后便改称做细胞系。.衰退期：衰退期
20、：特点特点：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。.（三）体外培养细胞一代生存期（三）体外培养细胞一代生存期潜伏期指数增生期停止期所谓细胞的所谓细胞的“一代一代”是指从细胞接种到分离再培养的一段时间。是指从细胞接种到分离再培养的一段时间。.v潜伏期：包括悬浮期及潜伏期。当细胞接种入新的培养器皿，不论是何种细胞类型、其原来的形态如何，此时细胞的胞质回缩，胞体均呈圆球形。先悬浮于培养液中，短时间后，那些尚可能存活的细胞，即开始附着于底物，并逐渐伸展，恢复其原来的形态。再经过一潜伏期，此时细胞已存活，具有代谢及运动但尚无增殖发生。以后出现细胞分裂并逐渐增多而进入指数生长期。.v指数增生
21、期：又称对数期。此期细胞增殖旺盛，成倍增长，活力最佳，适用于进行实验研究。细胞生长增殖状况可以细胞倍增情况（细胞群体倍增时间）及细胞分裂指数等来判断。在此阶段，若细胞处于理想的培养条件，将不断生长繁殖，细胞数量日渐增加。细胞将接触而连成一片，渐次长满培养器皿底面，提供细胞生长的区域逐渐减少甚至消失。因接触抑制而细胞运动停止、密度抑制而细胞终止分裂。.v 停止期：停止期：又称平台期，此期可供细胞生长的底物面积已被生长的细胞所占满，细胞虽尚有活力但已不再分裂增殖。此时细胞虽已停止生长，但仍存在代谢活动并可继续存活一定的进间。若及时分离培养、进行传代，将细胞分开接种到新的培养器皿并补充以新鲜培养液，
22、细胞将于新的培养器皿中成为下代的细胞而再次繁殖。否则，若传代不及时，细胞将因中毒而发生改变，甚至脱落、死亡。v 每次传代接种后，细胞的这些生长繁殖过程，若进行检测计数，可以绘制成曲线，是为生长曲线生长曲线。各细胞的生长曲线各具特点，是该细胞生物学特性的指标之一。.五、体外培养细胞的遗传学特征五、体外培养细胞的遗传学特征（一）染色质和染色体：（一）染色质和染色体：人体体细胞具有二倍体核型，染色体数目为46（2N）。原代培养细胞多呈二倍体，经传代成细胞系后，细胞可保持二倍体状态。但经长期传代可能发生偏离二倍体现象，即染色体数多于或少于46。当细胞发生转化或肿瘤细胞，大多失去二倍体核型，成为多倍体或
23、异倍体。在各类培养细胞中，有时会见到异常的染色体，如双着丝点、环形染色体，长臂或短臂.v（二）细胞性别（二）细胞性别v 在23对染色体中有一对性染色体，女性的两个X染色体中有一个在间期呈明显的异固缩状态，呈半月形或三角形小体，称Barr小体，紧贴在核膜内面。男性Y染色体在间期形成颗粒状Y小体，位于胞核近中央位。培养细胞的细胞核超微结构与体内细胞无大差别，仍保持性别特征，尤其原代培养细胞易于显示，用特殊染色法均可观察到Barr小体和Y小体。.六、体外培养细胞的生存环境六、体外培养细胞的生存环境v（一）无污染环境（一）无污染环境v 无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。在
24、体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡。因此，在体外培养细胞时，必须保持细胞生存环境无菌无毒，及时清除细胞代谢产物。.v（二）温度（二）温度v 维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。v（三）气体环境和氢离子浓度（三）气体环境和氢离子浓度v 气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。.七、体外培养细胞生存所需基本物质七、体外培养细胞生存所需基本物质v 碳水化合物：碳水化合物：碳水化合物是细胞生长主要能量来源，其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋
25、酸等。v 氨基酸：氨基酸：氨基酸是组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。.v 维生素：维生素：在细胞培养中，尽管血清是维生素重要来源，但是许多培养基中添加了各种维生素以适合更多的细胞系生长。v 缓冲系统缓冲系统：大多数细胞所需pH 在 7.2-7.4。但是，细胞培养最适pH 值随培养的细胞种类不同而不同。成纤维细胞喜欢较高pH(7.4-7.7),而传代转化细胞系则需要偏酸pH(7.0-7.4)。v 其他因素：其他因素：在一些较为复杂的培养液中还包括其它一些成分。如在杂交瘤技术中常用的DMEM 培养液，使用时还需要补加丙酮酸钠和2-巯基乙醇（2-Mercaptoethanol，2-Me）。2-Me 对细胞生长有很重要的作用。.
