1、本章主要内容本章主要内容无菌培养基本技术原代培养（Primary culture）基本技术细胞原代培养的维持和首次传代原代细胞的纯化和克隆本章主要内容无菌培养基本技术1.细胞培养室管理规则细胞培养室管理规则（1）准入制度）准入制度 一、无菌培养基本技术一、无菌培养基本技术 在本室工作的实验人员应严格遵守本室工作守则，外来人员在进入净化室工作之前，必须接受培训；没有经过培训的人员不得单独进入细胞培养室工作；进入培养后要保持安静，不得大声喧哗。1.细胞培养室管理规则一、无菌培养基本技术 在本室工（2 2）安全制度）安全制度细胞必须注意安全用电；谨慎使用酒精灯，不能在有明火的情况下加、换酒 精；实验
2、人员自觉维护室内设备的安全使用，对室内的 仪器如CO2孵箱等要经常注意机器运转情况，发现 问题及时检修或报告请人检修；离开净化室必须断开必要的仪器电源；对不符合净化室安全规定的行为主动报告主管老师。（2）安全制度 安全！安全！（3）.卫生消毒制度卫生消毒制度一般情况下细胞间每日消毒一次（包括缓冲间），方法为紫外线消毒（每次30分钟至1小时）一次，另外每周用10乳酸在紧闭门窗下熏蒸30分钟；实验完毕应及时清理所用物品，注意台面整洁；及时清洗所用隔离衣，并高压灭菌后存放于指定位置；除实验必须的用品外，其它物品不得带入细胞室；细胞室内所用仪器及附属设备均应在指定范围内使用，不得随意转移地点，以便他人
3、顺利使用；细胞室实施值日生负责制，值班人员负责检查室内是否保持清洁整齐，督促违反规定者改正错误。（3）.卫生消毒制度细胞原代培养课时(共7 8 张)课件（4 4）出入制度）出入制度细胞培养室共有两个缓冲间，进入每个缓冲间必须更换指定消毒的拖鞋；穿戴好消毒的鞋、帽、口罩后不得逆行离开细胞室；人员流动：原则为进出细胞室应按次序开、关门，只有将前面打开的门关闭后才允许打开下一个门，出入线路绝对不能逆行，使缓冲间起到应有的作用。物品流动：所有进出细胞培养室的物品均应通过传递窗进行；物品进入细胞培养室时，应先打开传递窗外侧门，将物品放入传递窗，关闭传递窗外侧门，打开紫外灯照射15分钟；人员进入层流净化细
4、胞培养室后，关闭紫外灯，打开传递窗内侧门，取出物品；物品出室次序与以上进室次序相反，但不需紫外线照射。（4）出入制度无菌间细胞室缓冲间无菌间细胞室缓冲间2.细胞培养的基本操作技术细胞培养的基本操作技术 体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。因而,为在一切操作中最大可能地保证无菌，每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠。2.细胞培养的基本操作技术 体外培养细胞缺乏抗感染能力消毒(disinfection)和消毒剂(disinfectant)灭菌(sterilization)防腐(antis
5、epsis)和防腐剂抑菌(bacteriostasis)无菌(asepsis)无菌技术/无菌操作(antiseptic technique)消毒(d i s i n f e c t i o n)和消毒剂(d i s i n f e c t 在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。【培养前准备】【培养前准备】在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的 无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面一次(拖布专
6、用)，紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。【操作野消毒】【操作野消毒】无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面一次(细胞原代培养课时(共7 8 张)课件 原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可穿原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可穿着细胞培养室内紫外线照射着细胞培养室内紫外线照射30min的
7、清洁工作服。在利用超净台工的清洁工作服。在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用作前要用75酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。戴口罩、着消毒衣帽。【洗手和着装】【洗手和着装】原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可细胞原代培养课时(共7 8 张)课件 在无菌环境进行培养或做其它无菌工
8、作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如安装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。培养瓶 滴管、试管、吸管【火焰消毒】【火焰消毒】在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒 进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。【操作】【操作】进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气细胞原代培养课时(共7 8 张)课件二、原代培养二、原代培养 Primary culture 概 念从体内取出组织细胞开始培养到第一次进行传代之前的时期，一个特征性的必然的生长阶段。完成了从体内环境到
9、体外环境的过渡和适应过程，恢复了分裂增殖与生长发育的能力。1.细胞原代培养概论细胞原代培养概论二、原代培养 P r i m a r y c u l t u r e 含义含义:包含包含原代培养实质是初次培养，即培养物接种到培养器皿中就不再分割，任其生长繁殖；原代培养中的“代”并不是指细胞繁殖的“代”数；原代培养过程中不分割培养物不等于不更换培养液。含义:包含原代培养实质是初次培养，即培养物接种到培养器皿特点特点(1)性质 性状似体内，可表达某些形态、结构、功能,更能代表活体细胞最接近在体时的情况；细胞异质性细胞成分混杂，除目的细胞之外，其它各种细胞还存在；细胞活跃移动，分裂不旺盛；相互依赖性强，
10、独立生存能力差,不易单个培 养。特点特点特点(2)发展过程:调整组成 原代培养的产生-选择 结果:形成相对均一的细胞系 选择第一步:形成原代培养的基础 组织块:能迁移出的细胞 消化分散:操作中能生存、附着，能悬浮生 存。特点特点-发展过程选择第二步:时间：数小时后至铺满 (汇合confluence)变化：数小时后至进一步选择中 3种情况:能增殖 能存活 不能存活 细胞类型继续改变,至铺满特点-发展过程特点-发展过程选择第三步:时间：铺满后 (可用于生长区域已被利用)变化：通过密度抑制 密度依赖性敏感的细胞(如正常细胞)-密度依赖性敏感低的细胞(如永生性细胞)-特点-发展过程特点-发展过程需及时
11、传代传不传代及何时传代 根据：接种的细胞数量 培养瓶皿的大小 培养条件 在一定程度上具有可人为操作的特征 特点-发展过程2.2.原代细胞的取材原代细胞的取材 人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，直接影响细胞的体外培养。2.原代细胞的取材 人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的（1 1）取材的基本要求）取材的基本要求 取材要注意新鲜和保鲜，取材部位准确；应严格无菌，尽快培养；防止机械损伤；去除无用组织和避免干燥；应注意组织类型、分化程度、年龄等；作好记录。（1）取材的基本要求 细胞原代培养课时(共7 8 张)课件（2 2）各类组织的取材技术）各类组织的取材技术 皮肤和粘膜的取材内脏和
12、实体瘤的取材血液细胞的取材骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材动物组织取材人胚体组织取材鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材（2）各类组织的取材技术 皮肤和粘膜的取材皮肤和粘膜的取材 主要取自于手术过程中的皮片，方法似外科取断层皮片手术操作，但面积一般24平方厘米。内脏和实体瘤的取材内脏和实体瘤的取材内脏除消化道外基本是无菌的，但取材时要明确和熟悉所需组织的类型和部位，实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染，尽量去除混杂的结缔组织。皮肤和粘膜的取材 内脏和实体瘤的取材血液细胞的取材血液细胞的取材 血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中（如脾、扁桃体、胸腺、淋巴
13、结等）分离细胞，取材时应注意抗凝。骨髓、羊水、胸骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材腹水细胞取材 严格无菌，注意抗凝，还要尽快分离培养，离心后，用无钙、镁PBS洗两次，再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。血液细胞的取材 骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材 动物组织取材动物组织取材 鼠胚组织取材首先用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物，然后将其整个浸泡在含有75%酒精的烧杯中，5分钟后（注意时间不能太长，以避免酒精从口或其他通道进入体内，影响组织活力），取出动物，在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢，切开皮肤，用无菌操作法解剖取胚或用无菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环形剪开皮肤，
14、用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾，把动物反包，暴露躯干，然后再固定，更换无菌解剖器材，采用无菌操作法解剖取出胚胎。动物组织取材 鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材步骤 取孵化至适当胚龄（912天）的胚蛋，用照蛋灯在暗处灯检，若有丰富血管、胚体有运动的胚蛋，说明胚体发育良好，并用有色笔划出气室和胚体位置。将胚蛋置于蛋架上，先用温水清洗蛋壳，再用75%酒精棉球擦干；经碘酒、75%酒精消毒后，在无菌条件下采用无菌法用剪刀或中号镊子打开气室，沿气室边缘去除蛋壳；用眼科镊撕去壳膜，暴露出鸡胚；用弯头镊轻挑起胚头，取出胚胎，放入无菌平皿中，解剖取材。鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材步骤 细胞原代培养课时(共7 8 张)课件
15、3.3.原代细胞的分离和制作原代细胞的分离和制作 人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来。(1)悬浮细胞的分离方法悬浮细胞的分离方法 组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟。经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。3.原代细胞的分离和制作(1)悬浮细胞的分离方法(2)(2)实体组织材料的分离方法实体组织材料的分离方法 对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用
16、机械分散法（物理裂解）和消化分离法。A.A.机械分散法机械分散法方法:特点:简便、快速,但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差,适用于处理纤维成分少的软组织。(2)实体组织材料的分离方法 B.B.消化分离法消化分离法 组织消化法是把组织剪切成较小团块（或糊状），应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。B.消化分离法 酶消化分离法酶消化分离法 酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶胰蛋白酶分散
17、原理：胰蛋白酶是一种胰脏制品，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞分散开。酶消化分离法 影响胰蛋白酶作用的主要因素影响胰蛋白酶作用的主要因素 细胞类型酶的活力酶的浓度温度pH 无机盐离子消化时间影响胰蛋白酶作用的主要因素 胶原酶（胶原酶（Collagenase Collagenase）消化法消化法 胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用。胶原酶（C o l l a g e n a s e C o l l a g e n a s e）消化细胞原代培养课时(共7 8 张)课件细胞原代培养课时(共7 8
18、张)课件C.C.消化分离法的操作步骤消化分离法的操作步骤 剪切加液漂洗消化弃去消化液漂洗机械分散C.消化分离法的操作步骤 D.D.消化分离法的注意事项消化分离法的注意事项 组织块必须漂洗2-3次以除去组织中的钙、镁离子和血清对胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。胰蛋白浓度不宜过高，作用时间不能太长，以避免毒性作用。消化后组织不仅要尽量使消化液失活，以避免毒性产生，而且动作要轻，以避免膨松的细胞随漂洗而丢失。D.消化分离法的注意事项 4.4.原代细胞的培养方法原代细胞的培养方法 原代细胞的培养也叫初代培养，是从供体取得组织细胞在体外进行的首次培养，是建立细胞系的第一步，是一项基本技术。原代细胞最接近和
19、最能反映体内生长特性，适宜用于药物敏感性试验、细胞分化等实验研究。4.原代细胞的培养方法(1)(1)组织块培养法组织块培养法 组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法。其基本方法是将剪成的小组织团块接种于培养瓶（或皿）中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组织块粘着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长。(1)组织块培养法 4.4.过程：过程：4.过程：细胞原代培养课时(共7 8 张)课件（2）消化培养法）消化培养法（2）消化培养法（3 3）悬浮细胞培养法）悬浮细胞培养法 对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接
20、培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。（3）悬浮细胞培养法（4 4）器官培养）器官培养 器官培养是指从供体取得器官或组织块后，不进行组织分离而直接在体外的特定环境条件下培养；器官培养可保持器官组织的相对完整性，可用于重点观察细胞间的联系、排列情况和相互影响，以及局部环境的生物调节作用。（4）器官培养 三、三、细胞的原代培养和维持细胞的原代培养和维持1.原代细胞的培养与维持原代细胞的培养与维持(1)原代细胞培养：原代细胞培养：静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞的培养)培养 悬浮细胞的培养三、细胞的原代培养和维持细胞细胞悬浮悬浮液液1010代代细胞细胞5050代代细胞细胞无限传无限传代代原代培养原代培
21、养传代培养传代培养细胞株细胞株细胞系细胞系5.5.如何界定原代培养和传代培养；细胞株和细胞系？如何界定原代培养和传代培养；细胞株和细胞系？多数组织细胞固定在表面多数组织细胞固定在表面生长和分裂。生长和分裂。随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖遗传物质改变遗传物质改变细胞悬浮液1 0 代细胞5 0 代细胞无限传代原代培养传代培养细胞株A.静置贴壁细胞静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞的培养包括半贴壁细胞的培养)培养要求培养要求细胞要通过充分漂洗，以尽量除去消化液的毒性;细胞接种时浓度要稍大一些，至少为5108细胞/L;培养基可用Eagle(MEM)或DNEM培养;小牛血清浓
22、度为10%-80%;应在375%CO2的培养箱中培养。在起始的2天中尽量减少振荡，以防止刚贴壁的细胞发生脱落，漂浮;待细胞基本贴壁伸展并逐渐形成网状，应将原代细胞换液。A.静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞的培养)培养要求B.悬浮细胞的培养要求（以血液细胞培养为例）悬浮细胞的培养要求（以血液细胞培养为例）原代培养时要尽量去除红细胞；短期培养，可在含10%小牛血清的RPMI1640培养基中进行；细胞浓度可在5-8109/L范围内进行分瓶实验；长期培养时，淋巴细胞中要加入生长因子，白血病细胞中要加入少量的原患者血清，以利细胞生长；一般每隔3天需半量换液一次；细胞传代一般待细胞增殖加快、细胞密度较高时才能
23、进行。B.悬浮细胞的培养要求（以血液细胞培养为例）套环法：在倒置显微镜下观察克隆形成的情况，标记单个克隆周边，吸干培养基，用涂有少量无菌硅脂的无菌金属套环，套住标记的克隆，在套环内滴加少量0.离开净化室必须断开必要的仪器电源；四、原代细胞的纯化和克隆将一定量的细胞悬液（如105/mL或更低）稀释至1个细胞/mL；（2）酶消化法：利用上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，使两者分开，达到纯化的目的。半悬浮生长细胞传代（293细胞）如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。需及时传代传不传代及何时传代 根据：接种的细胞数量 培养瓶皿的大小 培养条件 在一定程度上具有
24、可人为操作的特征在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75酒精消毒手。在贴壁细胞转化时，在培养瓶的细胞层中会出现分散的转化灶，细胞密集、排列规则，有明显生长趋势，与周边未能转化的细胞有明显的区域界限，可用烙筛选法烫死未转化细胞而保留转化灶细胞。通常采用半量换液的方法。原代培养后由于悬浮细胞增殖，数量增加甚至达饱和密度；细胞培养的基本操作技术吹打已消化的细胞应减少机械损伤。选择第三步:时间：铺满后 (可用于生长区域已被利用)变化：通过密度抑制 密度依赖性敏感的细胞(如正常细胞)-密度依赖性敏感低的细胞(如永生性细胞)-套环法：在倒置显微镜下观察克隆形成
25、的情况，标记单个克隆周边，吸干培养基，用涂有少量无菌硅脂的无菌金属套环，套住标记的克隆，在套环内滴加少量0.(2)2)原代细胞的维持原代细胞的维持 贴壁细胞长成网状或基本单层时，未达到饱和密度，需采取换液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要。换入等量完全培养基或换成含2%小牛血清的维持液。悬浮细胞细胞培养基中不仅会发生转化而且会发生分裂繁殖，此时培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求，需进行换液。通常采用半量换液的方法。套环法：在倒置显微镜下观察克隆形成的情况，标记单个克隆周边2 2、原代细胞培养的首次传代、原代细胞培养的首次传代 原代培养后由于悬浮细胞增殖，数量增加甚至达饱和密
26、度；贴壁细胞的相互汇合，使整个瓶底逐渐被细胞覆盖，细胞难以继续生长繁殖，需要进行分瓶培养，这种使原代细胞经分散接种的过程称之为传代。2、原代细胞培养的首次传代 首次传代应注意以下几点：首次传代应注意以下几点：细胞生长密度不高时，不能急于传代。原代培养的贴壁细胞需控制消化时间。吹打已消化的细胞应减少机械损伤。首次传代时细胞接种数量要多一些。首次传代培养的pH应偏低些。小牛血清浓度可加大至15%20%左右。首次传代应注意以下几点：根据细胞生长的恃点，传代方法有3种：悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。半悬浮生长细胞传代（293细胞）此类细胞部分
27、呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有的胰蛋白酶液。3、传代培养的方法、传代培养的方法根据细胞生长的恃点，传代方法有3 种：3、传代培养的方法贴壁细胞的消化传代步骤贴壁细胞的消化传代步骤 倒掉培养瓶中的培养液；用D-Hanks液洗两遍；加2-3滴0.25%胰蛋白酶消化液，平放培养瓶，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，可见到细胞质回缩，细胞间隙增大时迅速翻转培养瓶，使细胞脱离消化液；加培养液中止消化；吸取适量细胞悬液，接种于新的培养瓶内。加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养内。将后者放入培养箱中培养。贴壁细
28、胞的消化传代步骤 倒掉培养瓶中的培养液；消化传代的步骤消化传代的步骤消化传代的步骤细胞消化过程镜下观察细细胞消化的最佳程度细胞消化的最佳程度细胞消化的最佳程度四、原代细胞的纯化和克隆四、原代细胞的纯化和克隆体外培养的细胞绝大多数都呈混合生长，为了保证实验结果的可靠性、一致性、稳定性和可重复性，要求采用单一种类细胞来进行实验，因而培养细胞的纯化就成为实验研究的重要一步。四、原代细胞的纯化和克隆1.1.细胞的纯化细胞的纯化 细胞的纯化分为自然纯化：长期传代过程中靠自然淘汰法，不断排挤其他生长慢的细胞，最后留下生长优势旺的细胞，达到细胞纯化的目的。如肿瘤突变细胞通过此方法建立细胞系。人工纯化：利用人
29、为手段造成某一细胞生长有利的环境条件，抑制其他细胞的生长从而达到纯化细胞的目的。主要有以下5种方法。Hela cell1.细胞的纯化 H e l a c e l l（1 1）细胞因子依赖纯化法：）细胞因子依赖纯化法：通过加入某些特殊的细胞因子而纯化出只依赖于这种细胞因子生长的细胞系。（2 2）酶消化法：）酶消化法：利用上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，使两者分开，达到纯化的目的。另外对贴壁细胞与半贴壁及粘附细胞间的分离纯化也是十分有效的。Epithelium cell fibroblast（1）细胞因子依赖纯化法：通过加入某些特殊的细胞因子而纯化出（3 3）机械刮除法）机械刮除法 原
30、代培养时,如果上皮细胞和成纤维细胞为分区成片混杂生长，每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁上。可采用机械的方法去除不需要的细胞区域而保留需要的细胞区域，（3）机械刮除法（4 4）反复贴壁法）反复贴壁法 成纤维细胞其贴壁过程快，能在短时间内完成附着过程，而上皮细胞在短时间内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即浮起，利用此差别可以纯化细胞。（4）反复贴壁法（5 5）电烙筛选法）电烙筛选法 在贴壁细胞转化时，在培养瓶的细胞层中会出现分散的转化灶，细胞密集、排列规则，有明显生长趋势，与周边未能转化的细胞有明显的区域界限，可用烙筛选法烫死未转化细胞而保留转化灶细胞。（5）电烙筛选法 2.2.细胞的克
31、隆化细胞的克隆化 细胞克隆技术又称单个细胞分离培养技术，即从细胞群体中分离出一个细胞，并使其在体外培养体系中能繁殖成新的细胞群体，这种由单个细胞所形成的细胞群（或集落）称为一个克隆，这种纯化后的细胞群体称为细胞株。2.细胞的克隆化 主要的克隆方法有主要的克隆方法有5 5种种 毛细管克隆法有限稀释克隆法平皿克隆分离法软琼脂克隆分离法单细胞显微克隆法主要的克隆方法有5 种（1）毛细管克隆法：）毛细管克隆法：将一定量的细胞悬液（如105/mL或更低）稀释至1个细胞/mL；取10mLmm，长为8mm的毛细玻璃管若干（3050只），在负压作用下，使悬液吸入各毛细管中；在倒置显微镜下检查出每管只进入一个细
32、胞的毛细管，然后放入适应性培养基或有饲养层细胞的培养瓶（或培养板）内；在CO2培养箱中培养，由一个细胞在毛细管繁殖后，并向管外扩展，并形成单个克隆的细胞群体。（1）毛细管克隆法：（2）有限稀释克隆法：）有限稀释克隆法：取对数生长期的细胞制成悬液(贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶消化后吹打分散制成)，经台盼蓝染色计数，测定活细胞数及浓度（细胞存活率及单个细胞百分率应高于90%以上）。消化法制备低密度细胞悬液（12个/ml），孔接种于培养板，612h后观察标记含单个细胞的孔。待孔内细胞增至500-600个时进行分离培养。培养期间，视pH值的变化决定是否换液或补加培养液，一周左右，孔中有明显克隆出现。待
33、克隆长至孔底面的1/31/2时，可用消化法将96孔中的单一克隆的细胞分别移至24孔板中进行扩大培养。（2）有限稀释克隆法：细胞原代培养课时(共7 8 张)课件有限稀释法有限稀释法计数103/ml102/ml10/ml孔有限稀释法计数1 0 3/m l 1 0 2/m l 1 0/m l 孔（3 3）平皿克隆分离法）平皿克隆分离法 ：将对数生长期细胞制备单个细胞悬液（悬浮细胞用吸管吹打分散，贴壁细胞先用0.25%胰蛋白酶消化后，再用培养基吹打分散）计数并用培养基调整细胞浓度，使5mL培养液内含有50200个细胞（细胞存活率及单个细胞百分率应大于90%以上）。将上述细胞悬液迅速移入60mm平皿中，
34、在375%CO2下培养1周或更长。若有明显的克隆形成时方可进行克隆分离，方法有两种：（3）平皿克隆分离法：套环法：在倒置显微镜下观察克隆形成的情况，标记单个克隆周边，吸干培养基，用涂有少量无菌硅脂的无菌金属套环，套住标记的克隆，在套环内滴加少量0.25%胰蛋白酶，待细胞脱离时，用注射器针头轻轻吹打分散后，转入小平皿或24孔板或6孔板中扩大培养。玻片法：在接种细胞悬液前，预先在60mm平皿中放入无菌小玻片，加入细胞悬液，培养一定时间后，在倒置显微镜下标记上含一个克隆的玻片，然后用无菌镊子取出标记玻片转入24孔培养板中继续培养。细胞原代培养课时(共7 8 张)课件（4）单细胞显微克隆法）单细胞显微克隆法饲养层细胞的制备：用0.25%胰蛋白酶消化单层贴壁生长的3T3细胞，调整细胞浓度为108细胞/L，mL细胞悬液于375%CO2中培养至单层。将已形成单层的细胞板，用60Co 线以40006000拉得辐射或在培养液中加入丝裂霉素（终浓度为10-6mol/L）作用16h。其目的是使细胞有丝分裂能力丧失，但仍可短期存活，有代谢功能，不仅可维持pH而且还可为克隆细胞提供必要的养分及刺激生长的因子。制备单个细胞悬液。（4）单细胞显微克隆法
