1、第十章第十章 有机高分子基质的高效液有机高分子基质的高效液相色谱分离柱填料相色谱分离柱填料首先回顾几个问题首先回顾几个问题 HPLCHPLC方法的主要特点有那些？方法的主要特点有那些？HPLCHPLC的主要设备分哪几部分？的主要设备分哪几部分？HPLCHPLC方法的主要特点方法的主要特点u分离效率高，选择性好，适于各种多元组分离效率高，选择性好，适于各种多元组分复杂化合物的分离分复杂化合物的分离;u应用范围广：无机物应用范围广：无机物有机物，天然物质有机物，天然物质合成产物，小分子合成产物，小分子-大分子，一般化合大分子，一般化合物到生物活性物质物到生物活性物质;u分离机理各异，色谱柱、淋洗体
2、系和操作分离机理各异，色谱柱、淋洗体系和操作参数选择广泛参数选择广泛;u分离纯化分离纯化+分析检测分析检测;u样品量从痕量到大规模制备，实现在线监样品量从痕量到大规模制备，实现在线监测和自动化操作。测和自动化操作。HPLCHPLC的关键设备的关键设备 专用的高压输液系统专用的高压输液系统;高灵敏检测系统高灵敏检测系统;高效分离柱高效分离柱其中分离柱是色谱的中心其中分离柱是色谱的中心,是最为关键的部分是最为关键的部分与经典色谱的比较与经典色谱的比较HPLCHPLC分离填料：分离填料：有机基质有机基质多糖型凝胶多糖型凝胶高聚物树脂高聚物树脂无机基质无机基质硅胶硅胶氧化锆氧化锆氧化铝氧化铝多孔玻璃多
3、孔玻璃羟基磷灰石羟基磷灰石石墨化碳黑石墨化碳黑基质微球基质微球天然多天然多糖或合成单体或交联剂糖或合成单体或交联剂负载样品的能力强，负载样品的能力强，色谱容量高色谱容量高耐酸碱、具化学稳定耐酸碱、具化学稳定性，柱寿命长，易再生性，柱寿命长，易再生不易产生非特异性吸不易产生非特异性吸附作用附作用一、HPLCHPLC色谱柱的关键在于填料色谱柱的关键在于填料 物理结构物理结构色谱动力学色谱动力学（粒度与粒度分布、孔径与孔径分布、颗（粒度与粒度分布、孔径与孔径分布、颗粒强度和表观形态粒强度和表观形态柱效率、穿透性）柱效率、穿透性）化学结构化学结构色谱热力学色谱热力学（连接在基质上的官能团或链段（连接在
4、基质上的官能团或链段样品保样品保留值、选择性）留值、选择性）1、HPLCHPLC色谱柱填料在物理结构上的要求色谱柱填料在物理结构上的要求:颗粒大小合适，粒度分布较窄颗粒大小合适，粒度分布较窄;颗粒强度适应高速高压操作颗粒强度适应高速高压操作;多孔型的填料孔径大小和孔径分布适宜多孔型的填料孔径大小和孔径分布适宜,避避免复杂的微孔结构免复杂的微孔结构;一定的溶胀及收缩水平。一定的溶胀及收缩水平。常见的液相色谱填料类型常见的液相色谱填料类型多孔型多孔型非多孔型非多孔型薄壳型薄壳型分：小孔（分：小孔（10nm30nm30nm）和超大孔）和超大孔（100nm100nm），），应用占主应用占主导地位导地位
5、整体颗粒无孔整体颗粒无孔颗粒表面层多颗粒表面层多孔，内部无孔。孔，内部无孔。以合成树脂为基质的产以合成树脂为基质的产品，颗粒在品，颗粒在1010m m左右左右以合成树脂为基以合成树脂为基质的产品，颗粒质的产品，颗粒7 2020m m左右左右同左同左目前的主要发展方向目前的主要发展方向(研究热点研究热点):):颗粒单分散的填料颗粒单分散的填料;贯穿性超大孔结构的填料贯穿性超大孔结构的填料;小颗粒的非多孔填料。小颗粒的非多孔填料。2、HPLCHPLC色谱柱填料在化学结构上的要求色谱柱填料在化学结构上的要求 特定的选择性特定的选择性;良好的化学稳定性及热稳定性良好的化学稳定性及热稳定性;避免不可逆吸
6、附。避免不可逆吸附。不同填料的化学结构是通过对基质材料的不同填料的化学结构是通过对基质材料的化学改性而实现的。化学改性而实现的。l离子交换色谱填料离子交换色谱填料 颗粒表面携带季铵基、颗粒表面携带季铵基、DEAEDEAE基、磺酸基、羧基等强基、磺酸基、羧基等强弱阴阳离子集团。弱阴阳离子集团。l反相色谱填料反相色谱填料 C18C18、C8C8烷基等疏水性集团烷基等疏水性集团l正相色谱填料正相色谱填料 羟基、氨基、氰基等弱疏水性集团羟基、氨基、氰基等弱疏水性集团l亲和色谱填料亲和色谱填料 蛋白质、抗体、激素、抗菌素、酶等具有生物特异蛋白质、抗体、激素、抗菌素、酶等具有生物特异性的配基性的配基二、有
7、机高分子类型的二、有机高分子类型的HPLCHPLC填料基质树脂填料基质树脂 基质材料决定填料物理结构和化学结构基质材料决定填料物理结构和化学结构:颗粒大小与分布颗粒大小与分布,颗粒强度颗粒强度,孔径大小孔径大小,孔结构孔结构形态形态,颗粒内部的化学结构及其稳定性颗粒内部的化学结构及其稳定性,直接影响直接影响对颗粒的表面对颗粒的表面(包括内孔表面包括内孔表面)的化学修饰的化学修饰。可分为可分为:多糖型多糖型聚合物型聚合物型（一）多糖型基质材料（一）多糖型基质材料1.1.葡聚糖系葡聚糖系:高交联的羟丙基化葡聚糖高交联的羟丙基化葡聚糖,其颗粒刚性好其颗粒刚性好,粒度粒度小而且分布范围窄（小而且分布范
8、围窄（1010 2323m m）;SephasorbSephasorb HP HP UitrafineUitrafine 用于中低压色谱和高效色谱用于中低压色谱和高效色谱 烯丙基葡聚糖与烯丙基葡聚糖与N,N-N,N-亚甲基双丙烯酰胺交联共亚甲基双丙烯酰胺交联共聚而成的凝胶。聚而成的凝胶。SephacrylSephacryl系列系列(S-100HR,S-200HR,S-300HR)(S-100HR,S-200HR,S-300HR)属属于高效凝胶，较高流速下使用于高效凝胶，较高流速下使用2.2.琼脂糖系琼脂糖系:SepharoseSepharose与与2,3-2,3-二溴丙醇反应生成琼脂糖凝胶二溴
9、丙醇反应生成琼脂糖凝胶 SepharoseSepharose CL(CL-2B,CL-4B,CL-6B)CL(CL-2B,CL-4B,CL-6B)高度偶联琼脂糖凝胶高度偶联琼脂糖凝胶SepharoseSepharose Fast Flow Fast Flow(SepharoseSepharose 6FF,6FF,SepharoseSepharose 4FF)4FF)高效琼脂糖凝胶高效琼脂糖凝胶SepharoseSepharose high Performance high PerformanceSuperdaxSuperdax(葡聚糖与交联琼脂糖的结合葡聚糖与交联琼脂糖的结合)：快流速快流速S
10、uperoseSuperose(珠状琼脂糖经两次交联珠状琼脂糖经两次交联)：高效凝胶高效凝胶（二）聚合物型基质材料（二）聚合物型基质材料 交联聚苯乙烯树脂交联聚苯乙烯树脂:苯乙烯与二乙烯苯的交联共聚物苯乙烯与二乙烯苯的交联共聚物(PS-DVB)(PS-DVB)，是是应用最为广泛应用最为广泛的一类基质树脂。的一类基质树脂。交联聚甲基丙烯酸酯类树脂交联聚甲基丙烯酸酯类树脂:以甲基丙烯酸的甲脂、丁酯、羟基乙酯、以甲基丙烯酸的甲脂、丁酯、羟基乙酯、环氧丙酯等化合物为单体制备的交联高聚物。环氧丙酯等化合物为单体制备的交联高聚物。三、填料性能评价三、填料性能评价 填料的物化性质指标填料的物化性质指标 填料
11、的色谱性能表征填料的色谱性能表征1、物化性质指标物化性质指标:a.a.颗粒大小及其分布颗粒大小及其分布(d dp p););b.b.比表面积比表面积S(mS(m2 2/g)/g)；c.c.骨架密度骨架密度g g(g(g/ml)/ml)、溶剂吸收量、溶剂吸收量S Sr r(ml/g(ml/g)、溶胀因子溶胀因子f;f;d.d.比孔体积比孔体积V Vp p(ml/g(ml/g););e.e.孔度孔度；f.f.孔径大小及分布；孔径大小及分布；g.g.化学结构与化学性质。化学结构与化学性质。2、色谱性能表征色谱性能表征:保留值：保留值：保留时间保留时间(T(TR R),),保留体积保留体积(V(VR
12、R),),容量因子容量因子(K)(K)选择性：选择性：相邻二物质保留时间之比相邻二物质保留时间之比,与固定相、流与固定相、流动相及温度有关。动相及温度有关。柱效率：柱效率：理论塔板数理论塔板数(N)(N)，或理论塔板高度，或理论塔板高度(H)(H)表示。表示。填充柱的总空隙度和穿透性：填充柱的总空隙度和穿透性：分离度分离度(R)(R)：相邻两色谱峰的保留值之差与各自峰相邻两色谱峰的保留值之差与各自峰底宽度一半之和的比值。底宽度一半之和的比值。四、反相四、反相HPLCHPLC高分子填料高分子填料Reversed Phase Reversed Phase Chromatography,RPCChr
13、omatography,RPC 反相色谱反相色谱（原理参照（原理参照P237P237）：非极性固定：非极性固定相，极性流动相，强极性组分先洗脱出来。相，极性流动相，强极性组分先洗脱出来。1.1.目前目前RPCRPC分离柱分离柱以硅胶基质的键合相填料为主以硅胶基质的键合相填料为主，特别是特别是键合键合C18C18，C8C8烷基以及苯基填料烷基以及苯基填料。特点：特点：传质快，刚性好，柱效高，选择性好。传质快，刚性好，柱效高，选择性好。不足：不足：pH2pH28 8，容易使蛋白质失活（残留的硅，容易使蛋白质失活（残留的硅羟基）羟基）2.2.广泛使用的是广泛使用的是微球形交联聚苯乙烯树脂微球形交联聚
14、苯乙烯树脂，另有带另有带C18C18烷基侧链的聚丙酰胺、聚甲基烷基侧链的聚丙酰胺、聚甲基丙烯酸的烷基酯化物、聚乙烯醇的酯化丙烯酸的烷基酯化物、聚乙烯醇的酯化物，物，C18C18烷基键合的聚乙烯醇。烷基键合的聚乙烯醇。优点：优点：pHpH范围较广，表面有较强的疏水性范围较广，表面有较强的疏水性主要厂家主要厂家日本：东洋日本：东洋-曹达曹达Tosoh-TSKTosoh-TSK瑞士：瑞士：Hamilton,Hamilton,汉密尔顿汉密尔顿,英国：高聚物实验室英国：高聚物实验室Polymer LabPolymer Lab美国：美国：Bio-RadBio-Rad伯乐伯乐瑞典：安捷伦瑞典：安捷伦Agil
15、entAgilent详见：详见：P194P194表表10101 1 被分离样品的分子量大小与填料的孔径选择 如如PLRPPLRPS S填料：填料：孔径孔径10nm10nm，适于分离，适于分离15152020个氨基酸长度的肽类；个氨基酸长度的肽类；孔径孔径30nm30nm，适于分离中等分子量的球形蛋白质；，适于分离中等分子量的球形蛋白质；孔径孔径100nm100nm，适于分离较大的球形蛋白质或纤维状，适于分离较大的球形蛋白质或纤维状结构的化合物；结构的化合物；孔径孔径400nm400nm，适于分离很大分子量的蛋白质。，适于分离很大分子量的蛋白质。三氟乙酸(TFA)在在IECIEC中中,高分子类型
16、填料表现更大的优越性。高分子类型填料表现更大的优越性。大致有大致有3 3类：类：多糖基质的离子交换层析介质多糖基质的离子交换层析介质 聚合物基质的高效离子交换色谱填料聚合物基质的高效离子交换色谱填料 高聚物型离子交换色谱填料高聚物型离子交换色谱填料五、离子交换HPLC填料Ion exchange chromatography IEC1.1.多糖基质的离子交换层析介质多糖基质的离子交换层析介质 传统的多糖类软质凝胶制得强弱阴阳离子传统的多糖类软质凝胶制得强弱阴阳离子交换介质：交换介质：具有很好亲水性和生物相容性具有很好亲水性和生物相容性；高交联度多糖类凝胶填料：高交联度多糖类凝胶填料：还适于较高
17、压还适于较高压力和流速下操作。力和流速下操作。2.2.聚合物基质的高效离子交换色谱填料聚合物基质的高效离子交换色谱填料 交联共聚的苯乙烯交联共聚的苯乙烯-二乙烯苯二乙烯苯 聚甲基丙烯酸酯聚甲基丙烯酸酯;4-4-乙烯吡啶共聚物乙烯吡啶共聚物特点特点：高交联大孔结构高交联大孔结构,良好的刚性良好的刚性 和和小而均匀的粒度小而均匀的粒度a.多孔树脂的多孔树脂的IECIEC填料填料:柱效、穿透性、分离度、负载量、回收率的性能优异柱效、穿透性、分离度、负载量、回收率的性能优异 Mono Beads Mono Beads 系列：包括系列：包括Mono Q,Mono S,Mono PMono Q,Mono
18、S,Mono P SOURCESOURCE系列系列:15Q,15S,30Q,30S:15Q,15S,30Q,30S 贯流色谱填料贯流色谱填料POROSPOROS系列系列 羟基化聚醚凝胶：如羟基化聚醚凝胶：如TSK gel DEAE-5PW,SP-TSK gel DEAE-5PW,SP-5PW,CM-5PW5PW,CM-5PW等等 交联聚甲基丙烯酸羟基乙酯交联聚甲基丙烯酸羟基乙酯:亲水亲水,大孔大孔b.非多孔树脂的非多孔树脂的IECIEC填料填料:羟基化聚醚羟基化聚醚,交联聚苯乙烯交联聚苯乙烯,交联聚交联聚甲基丙烯酸酯甲基丙烯酸酯,交联琼脂糖交联琼脂糖等。等。优点优点:颗粒小颗粒小,均匀均匀,刚
19、性好刚性好,色谱穿透性色谱穿透性强强,流速适应范围宽。避免了固相内的吸流速适应范围宽。避免了固相内的吸附与扩散，因此具有高柱效附与扩散，因此具有高柱效,高分离度和高分离度和高样品回收率的特点。高样品回收率的特点。c.薄壳型树脂的薄壳型树脂的IECIEC填料填料:优点优点:柱效高柱效高,选择性好选择性好,分离度高分离度高,穿透性好穿透性好,回收高回收高,流速快等流速快等六、有机高分子类型的疏水六、有机高分子类型的疏水HPLCHPLC填料填料Hydrophobic interaction Hydrophobic interaction chromatography,chromatography,H
20、ICHIC HIC:HIC:填料表面具有弱疏水性填料表面具有弱疏水性,蛋白质的疏蛋白质的疏水基团与填料表面之间产生弱的疏水性相互水基团与填料表面之间产生弱的疏水性相互作用。高浓度盐条件下作用。高浓度盐条件下,蛋白质与疏水固定蛋白质与疏水固定相的吸附能力高相的吸附能力高,随着盐浓度的下降随着盐浓度的下降,吸附能吸附能力下降。当淋洗液离子强度逐渐降低时力下降。当淋洗液离子强度逐渐降低时,蛋蛋白质样品按其疏水性的不同依次被洗脱。白质样品按其疏水性的不同依次被洗脱。常见淋洗液有常见淋洗液有(NH4)(NH4)2 2SOSO4 4,NH,NH4 4Ac,Ac,NaClNaCl,磷磷酸盐等酸盐等,其中其中
21、(NH4)(NH4)2 2SOSO4 4是最广泛应用的。是最广泛应用的。疏水色谱疏水色谱HPLCHPLC填料填料 一般是一般是亲水性基质亲水性基质,或在合成的非亲水性基质上或在合成的非亲水性基质上连接一定的亲水基团，然后引入连接一定的亲水基团，然后引入疏水性基团疏水性基团,主主要有丁基、辛基、苯基等以及聚乙二醇。要有丁基、辛基、苯基等以及聚乙二醇。其基质可以是其基质可以是多糖类多糖类,也可以是各类也可以是各类高分子多聚高分子多聚物物,包括交联聚苯乙烯树脂、硅胶、羟基化聚醚包括交联聚苯乙烯树脂、硅胶、羟基化聚醚树脂、交联甲基丙烯酸酯类。树脂、交联甲基丙烯酸酯类。HICHIC填料填料绝大多数是多孔
22、结构绝大多数是多孔结构,主要是超大孔结主要是超大孔结构，也可以是非多孔结构的。构，也可以是非多孔结构的。P206P206表表10-410-4七、有机高分子类型的空间排阻七、有机高分子类型的空间排阻HPLCHPLC填料填料Size exclusion chromatography,Size exclusion chromatography,SEC SECSECSEC填料特征：填料特征：1.1.填料的性质填料的性质必须与溶质和淋洗体系相匹配必须与溶质和淋洗体系相匹配,可以被淋洗剂所可以被淋洗剂所；2.2.填料和试样尽可能填料和试样尽可能不发生不发生任何基团之间的任何基团之间的相互作用相互作用,即尽
23、可能避免非空间排阻效应；即尽可能避免非空间排阻效应；3.3.填料的多孔结构是填料的多孔结构是SECSEC建立的基础；建立的基础；SEC SEC填料的色谱特征：填料的色谱特征：除了柱效除了柱效,选择性选择性,分离度分离度,穿透性等一穿透性等一般色谱表征外般色谱表征外,尚需要满足以下指尚需要满足以下指标：标：排阻极限排阻极限;分离范围分离范围;固流相比固流相比凝胶填料主要类型凝胶填料主要类型多糖类多糖类 传统的软质凝胶传统的软质凝胶:葡聚糖葡聚糖,琼脂糖琼脂糖,聚丙烯酰聚丙烯酰胺型凝胶胺型凝胶 高交联的多糖类凝胶高交联的多糖类凝胶:Superdex,SuperoseSuperdex,Superos
24、e,SephacrylSephacryl,SepharoseSepharose CL CL高聚物型高聚物型p 多孔交联聚甲基丙烯酸酯类树脂多孔交联聚甲基丙烯酸酯类树脂,交联聚乙交联聚乙烯醇树脂烯醇树脂,亲水化处理的交联聚苯乙烯树脂亲水化处理的交联聚苯乙烯树脂,羟基化聚醚类羟基化聚醚类.(.(表表10-7 P213)10-7 P213)凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱Gel permeation chromatography,Gel permeation chromatography,GPCGPC 有机溶剂为流动相有机溶剂为流动相 THFTHF四氢呋喃四氢呋喃八、有机高分子类型生物亲和八、有机高分子类型生物亲和HPLCHPLC填料填料Affinity chromatography,Affinity chromatography,AFC AFC 优点优点:高选择性高选择性,能有效保持生物分子的能有效保持生物分子的高级结构稳定性高级结构稳定性,活性样品的回收率。活性样品的回收率。按其基质不同分按其基质不同分:多糖型和高聚物型多糖型和高聚物型。按其所带配体对被分离物质的选择性特按其所带配体对被分离物质的选择性特征可分为征可分为通用型和专用型通用型和专用型。
