1、军团菌的分离培养与鉴定军团菌的分离培养与鉴定 福建省疾病预防控制中心福建省疾病预防控制中心原灵原灵2009年年6月月3日日军团菌军团菌革兰阴性杆菌革兰阴性杆菌,浅红色的短杆菌，直径浅红色的短杆菌，直径0.30.30.5m0.5m，长约，长约1.21.25m5m或更长，或更长，菌体一端有鞭毛菌体一端有鞭毛.在含在含L L-半胱氨酸和焦磷酸铁的半胱氨酸和焦磷酸铁的BCYEBCYE琼琼脂培养基上生长，通常需要在脂培养基上生长，通常需要在3737 5%5%CO2培养箱培养箱培养培养2-102-10天。天。生长形成的菌落一般呈白色，也可能生长形成的菌落一般呈白色，也可能会从紫色变为蓝色，或是灰绿色。会从
2、紫色变为蓝色，或是灰绿色。初步在初步在BCYEBCYE琼脂培养基上生长的菌落为琼脂培养基上生长的菌落为刻花玻璃样，具有多型性刻花玻璃样，具有多型性.军团菌军团菌军团菌军团菌电镜图片军团菌科、属、种、血清型军团菌科、属、种、血清型u军团菌科军团菌科 (Legionellaceae(Legionellaceae）Legionella/Fluoribacter bozemanii/Tatlockia Legionella/Fluoribacter bozemanii/Tatlockia micdadeimicdadei u军团菌属：军团菌属：16s rRNA16s rRNA分析表明，在蛋白细菌系分析
3、表明，在蛋白细菌系亚群中，亚群中，军团菌科只有一个军团菌亚群。与引起军团菌科只有一个军团菌亚群。与引起Q Q热病的热病的coxiella coxiella burneti(burneti(贝氏克斯体）亲缘关系最近，二者具有同样的细贝氏克斯体）亲缘关系最近，二者具有同样的细胞内生活方式，可以利用共同的基因感染宿主细胞。胞内生活方式，可以利用共同的基因感染宿主细胞。u军团菌种军团菌种：现已发现：现已发现5050个种（个种（speciesspecies），），7070多个血清型多个血清型（serogroups)serogroups)，至少有，至少有2020个种可引起人感染。个种可引起人感染。种名发现
4、时间 种名发现时间 种名发现时间 Legionella pneumophila1979Legionella maceachernii 1985Legionella geestiana 1993Legionella bozemanae 1980Legionella parisiensis 1985Legionella londiniensis 1993Legionella dumoffii 1980Legionella rubrilucens 1985Legionella nautarum 1993Legionella gormanii 1980Legionella santicrucis 19
5、85Legionella quateirensis 1993Legionella micdadei 1980Legionella spiritensis 1985Legionella worsleiensis 1993Legionella pittsburghensis 1980Legionella steigerwaltii 1985Legionella lansingensis 1994Legionella jordanis 1982Legionella israelensis 1986Legionella lytica 1996Legionella longbeachae 1982Leg
6、ionella birminghamensis1988Legionella waltersii 1996Legionella oakridgensis 1983Legionella brunensis 1989Legionella taurinensis 1999Legionella wadsworthii 1983Legionella cincinnatiensis1989Legionella beliardensis 2001Legionella feeleii 1984Legionella moravica 1989Legionella drozanskii 2001Legionella
7、 sainthelensi 1984Legionella quinlivanii 1990Legionella fallonii 2001Legionella anisa 1985Legionella tucsonensis 1990Legionella gresilensis 2001Legionella cherrii 1985Legionella adelaidensis 1991Legionella rowbothamii 2001Legionella erythra 1985Legionella fairfieldensis 1991Legionella busanensis 200
8、3Legionella hackeliae 1985Legionella gratiana 1991Legionella drancourtii 2004Legionella jamestowniensis1985Legionella shakespearei 1992军团菌种SpeciesNo.of serogroupsNo.associated with disease1.L.pneumophila15152.L.bozemanii223.L.dumoffii114.L.micdadei115.L.longbeachae226.L.jordanis117.L.wadsworthii118.
9、L.hackeliae229.L.feeleii2210.L.maceachernii1111.L.birminghamensis1112.L.cincinnatiensis1113.L.gormanii1114.L.sainthelensi2215.L.tucsonensis1116.L.anisa1117.L.lansingensis1118.L.erythra2119.L.parisiensis1120.L.oakridgensis112020个个种种的的军军团团菌菌可可引引起起人人疾疾病病军团菌操作生物安全性军团菌操作生物安全性u应用的试剂须符合有毒物质操作要求和相关规定。应用的试剂须
10、符合有毒物质操作要求和相关规定。u生物安全生物安全级实验室，最好在安全柜中操作。级实验室，最好在安全柜中操作。u操作人员培训。操作人员培训。u菌种保存。菌种保存。可感染人类的高致病性病原微生物菌可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定（毒）种或样本运输管理规定病原菌名称病原菌名称危害程度危害程度分类分类实验活动所需生物安全实验室级别实验活动所需生物安全实验室级别运输包装分类运输包装分类学名学名中文名中文名大量活菌大量活菌操作操作动物感动物感染实验染实验样本样本检测检测非感染性非感染性材料实验材料实验A/BUN 编编号号Legionella pneumophila嗜肺军团嗜肺军
11、团菌菌第三类第三类BSL-2ABSL-2BSL-2BSL-1BUN 3373样本的采集和运输样本的采集和运输（一）标本的种类（一）标本的种类（二）标本的运输和相关生物安全要求（二）标本的运输和相关生物安全要求标本的种类标本的种类u 环境水标本：空调冷却塔水、冷凝水,温泉水,淋浴水,加湿器水；u 病人组织标本:如痰,支气管灌洗液,胸水,血液等标本。u 1983年新疆从一瘫患羔羊后肢中分离到军团菌。标本的运输和相关生物安全要求标本的运输和相关生物安全要求u在周围环境温度下运送水样标本,不必冷冻,但要防止受热和阳光,标本要尽可能快或最好在两天内送到实验室,室温下(21+3)贮藏在实验室或其他地方。u
12、对于临床标本，最好立即做预期实验，如不能马上进行，应放在-20冻存备用。水样标本中军团菌的分离方法水样标本中军团菌的分离方法检测依据检测依据:1 1、ISO-11731ISO-11731水质军团菌检测水质军团菌检测 2 2、公共场所集中空调通风系统公共场所集中空调通风系统 卫生规范卫生规范中的集中空调通风系统冷却水、冷凝中的集中空调通风系统冷却水、冷凝水中嗜肺军团菌的检验方法见附录水中嗜肺军团菌的检验方法见附录A A。适用于各种环境标本军团菌检测适用于各种环境标本军团菌检测 ，包括：，包括：饮饮用水、工业用水、天然水以及一些如沉积物、沉用水、工业用水、天然水以及一些如沉积物、沉淀物、软泥等物质
13、。淀物、软泥等物质。军团菌水质检测概括军团菌水质检测概括1.采样采样2.浓缩浓缩3.培养培养4.分离分离5.鉴定鉴定军团菌检测所需准备基本试剂军团菌检测所需准备基本试剂1.1.培养基（培养基（GVPCGVPC，BCYE,BCYE-CYS)BCYE,BCYE-CYS)2.2.试剂试剂 (生化试剂、甲醛的盐溶液）生化试剂、甲醛的盐溶液）3.3.酸缓冲液（酸缓冲液（0.2mol/L KCL-HCL)，碱缓冲液，碱缓冲液（0.03mol/L KOH）4.4.血清学试剂血清学试剂标本浓缩所需准备仪器设备标本浓缩所需准备仪器设备u 过滤过滤 滤器及漏斗，过滤装置需能够承受高压。滤器及漏斗，过滤装置需能够承
14、受高压。正压膜蠕动过滤泵，能够控制流速。正压膜蠕动过滤泵，能够控制流速。尼龙或聚碳酸酯滤膜尼龙或聚碳酸酯滤膜 硅胶管硅胶管 u 离心机离心机 离心力能够达到（离心力能够达到（60006000100100）g,g,要有安全盖。要有安全盖。u 漩涡振荡器漩涡振荡器 转速至少能够达到（转速至少能够达到（2002005 5）r/minr/min。培养检测所需准备材料培养检测所需准备材料1.1.直径大约为直径大约为90mm90mm或或100mm100mm的无菌培养皿的无菌培养皿2.2.培养箱，培养箱，COCO2 2能够恒温保持在（能够恒温保持在（36361 1）。3.3.水浴箱，能够保持在（水浴箱，能够
15、保持在（50501 1）4.4.显微镜或荧光显微镜。显微镜或荧光显微镜。样品采样准备材料样品采样准备材料1.1.玻璃、聚乙烯或类似的容器瓶：灭菌处理。水样一般采集玻璃、聚乙烯或类似的容器瓶：灭菌处理。水样一般采集为为250-500ml250-500ml，收集在容器瓶中。，收集在容器瓶中。2.2.如果所用的容器，如聚乙烯瓶，不能高压，可用流动的热如果所用的容器，如聚乙烯瓶，不能高压，可用流动的热水（不低于水（不低于7070）或蒸汽进行巴斯德氏消毒，时间不低于）或蒸汽进行巴斯德氏消毒，时间不低于5 5分钟。分钟。3.3.小的无菌容器瓶：可用来收集淤泥、沉淀物或沉积物。小的无菌容器瓶：可用来收集淤泥
16、、沉淀物或沉积物。4.4.广口的容器：用来收集淤泥等，要有螺丝盖。广口的容器：用来收集淤泥等，要有螺丝盖。5.5.灭菌棉拭子。灭菌棉拭子。一般建议用塑料包装的容器一般建议用塑料包装的容器采样采样后后样品样品处理处理 方法与步骤方法与步骤 样品处理样品处理 1.沉淀或离心：如有杂质可静置沉淀或沉淀或离心：如有杂质可静置沉淀或1000r/min离心离心1min去除。去除。2.过滤：将经沉淀或离心的样品通过孔径过滤：将经沉淀或离心的样品通过孔径0.220.45m滤膜过滤，取下滤膜置于滤膜过滤，取下滤膜置于15ml灭菌水中，灭菌水中，充分洗脱，备用。充分洗脱，备用。3.热处理：取热处理：取1ml洗脱样
17、品置洗脱样品置50水浴加热水浴加热30min。4.酸处理：取酸处理：取5ml洗脱样品，调洗脱样品，调pH至至2.2，轻轻摇，轻轻摇匀，放置匀，放置5min。ISO-11731ISO-11731水质军团菌检测水质军团菌检测浓缩标本酸处理浓缩标本酸处理酸缓冲液：酸缓冲液：仔细地量取仔细地量取17.4ml17.4ml浓盐酸加到浓盐酸加到1L1L蒸馏水中，配成蒸馏水中，配成0.2mol/L0.2mol/L的盐酸缓冲液；称的盐酸缓冲液；称14.9gKCl14.9gKCl加到加到1L1L蒸馏水中，配蒸馏水中，配成成0.2mol/L0.2mol/L的的KClKCl溶液。将溶液。将3.9ml 0.2mol/L
18、3.9ml 0.2mol/L的盐酸溶液和的盐酸溶液和25ml 0.2mol/L25ml 0.2mol/L的的KClKCl溶液混合，用溶液混合，用1mol/L1mol/L的的KOHKOH溶液调溶液调pHpH至至2.22.20.20.2，装在一个带塞的玻璃瓶内，于室温暗处贮存，装在一个带塞的玻璃瓶内，于室温暗处贮存，不要超过不要超过1 1个月。个月。1.1.将将1 110ml10ml样品（浓缩或未浓缩的）放入带有螺旋帽的容器样品（浓缩或未浓缩的）放入带有螺旋帽的容器中，再将其中，再将其6000g6000g离心离心10min10min或或3000g3000g离心离心30min30min。2.2.用无
19、菌吸管吸取上清，使体积变为原来的一半。用振荡器用无菌吸管吸取上清，使体积变为原来的一半。用振荡器或用力混合，使沉淀重悬。或用力混合，使沉淀重悬。3.3.加入酸缓冲液使体积和原来相同加入酸缓冲液使体积和原来相同,并轻晃摇匀静置并轻晃摇匀静置5min5min。样品浓缩样品浓缩离心离心过滤过滤接种接种酸处理酸处理 热处理热处理水样的正压膜过滤法水样的正压膜过滤法1.1.安放滤膜；安放滤膜；2.2.过滤；过滤；3.3.取膜；取膜；4.4.洗膜。洗膜。水样的离心水样的离心1.1.将将200ml200ml左右样品倒入容积为左右样品倒入容积为300300500ml500ml的无菌离心瓶的无菌离心瓶中；中；2
20、.2.6000g6000g离心离心10min10min，或者，或者3000g3000g离心离心30min30min，离心温度在，离心温度在15152525之间；之间；3.3.无菌操作去除上清；无菌操作去除上清；4.4.用用5 520ml20ml溶液或无菌蒸馏水将沉淀重悬。溶液或无菌蒸馏水将沉淀重悬。水样浓缩物的贮存水样浓缩物的贮存1.1.最好对样品立刻进行分析；最好对样品立刻进行分析；2.2.标本于（标本于（6 62 2）储藏最多不超过储藏最多不超过1414天。天。对于军团菌来说，如果储藏于对于军团菌来说，如果储藏于0 066，这种损失是，这种损失是最明显的。而且，温度在最明显的。而且，温度在
21、2020或或2020以上时，异养生物的以上时，异养生物的生长速度就会变快。生长速度就会变快。浓缩标本热处理浓缩标本热处理1.1.向无菌容器中放入（向无菌容器中放入（1 10.50.5）mlml（浓缩或未浓缩）的标（浓缩或未浓缩）的标本。本。2.2.在（在（50501 1）水浴中放置（水浴中放置（30302 2）minmin。军团菌培养基军团菌培养基Muller-Hinton琼脂琼脂第一次分离出嗜肺军团菌使用的培养基第一次分离出嗜肺军团菌使用的培养基活性炭酵母抽提物琼脂，活性炭替代培活性炭酵母抽提物琼脂，活性炭替代培了淀粉以去除培养基的毒性，并且氨基了淀粉以去除培养基的毒性，并且氨基酸也逐渐被酵
22、母抽提物替代酸也逐渐被酵母抽提物替代CYE琼脂琼脂CYE琼脂加入琼脂加入-酮戊二酸酮戊二酸BCYE琼脂琼脂BCYE琼脂中含有选择性抗生素琼脂中含有选择性抗生素GVPC琼脂琼脂军团菌培养基1.酵母浸出物（细菌级）酵母浸出物（细菌级）10.0g2.琼脂琼脂 12.0g3.活性炭活性炭 2.0g4.-酮戊二酸酮戊二酸 1.0g5.ACES (2-乙酰基乙酰基-2-氨基乙烷磺酸氨基乙烷磺酸)10.0g6.KOH（颗粒型）（颗粒型）2.8g7.L-半胱氨酸盐酸盐半胱氨酸盐酸盐 0.6g8.焦磷酸铁焦磷酸铁 0.4g 蒸馏水蒸馏水 补充至补充至1000mlBCYEBCYE培养基培养基L L-半胱氨酸和焦磷
23、酸铁溶液半胱氨酸和焦磷酸铁溶液1.1.称取称取0.6g0.6g L L-半胱氨酸盐酸盐和半胱氨酸盐酸盐和0.4g0.4g焦磷酸铁分别溶解焦磷酸铁分别溶解于于10ml10ml蒸馏水中，制备新鲜的蒸馏水中，制备新鲜的L L-半胱氨酸盐酸盐溶液半胱氨酸盐酸盐溶液和焦磷酸铁溶液。和焦磷酸铁溶液。2.2.分别通过分别通过0.22m0.22m的滤膜过滤除菌。贮存于无菌容器中，的滤膜过滤除菌。贮存于无菌容器中，-20-20左右储存不得超过三个月。左右储存不得超过三个月。BCYE-BCYE-培养基配制培养基配制1.1.将颗粒状将颗粒状ACESACES放入放入500ml500ml蒸馏水中溶解。量取蒸馏水中溶解。
24、量取480ml480ml蒸馏蒸馏水，加入全部水，加入全部2.8gKOH2.8gKOH颗粒，轻摇至溶解。将以上两种颗粒，轻摇至溶解。将以上两种溶液混合，制成溶液混合，制成ACESACES缓冲液缓冲液,用用0.1mol/L KOH0.1mol/L KOH和和0.1mol/L HCl0.1mol/L HCl溶液调节溶液调节PHPH至至6.9-7.06.9-7.02.2.ACESACES缓冲液中加入活性炭、酵母浸出物、缓冲液中加入活性炭、酵母浸出物、-酮戊二酸。酮戊二酸。摇匀。摇匀。3.3.加入琼脂，微波稍化后，加入琼脂，微波稍化后，121121高压高压15min15min。4.4.高压后，室温或水浴
25、中冷却至高压后，室温或水浴中冷却至5050左右。左右。5.5.在无菌条件下加入在无菌条件下加入L-L-半胱氨酸溶液和焦磷酸铁溶液。半胱氨酸溶液和焦磷酸铁溶液。6.6.按按20ml20ml量倒入直径为量倒入直径为9090100mm100mm的平板中，培养基的最的平板中，培养基的最终终pHpH值大约为值大约为6.96.9左右。左右。7.7.待平板中的湿气干燥后，待平板中的湿气干燥后，44左右储存于闭光的密闭容左右储存于闭光的密闭容器中，最多可储存器中，最多可储存4 4周。周。GVPCGVPC选择性培养基选择性培养基BCYE-BCYE-琼脂培养基中添加下列抗生素琼脂培养基中添加下列抗生素1.1.万古
26、霉素万古霉素 2.2.多粘菌素多粘菌素B B 3.3.放线菌酮放线菌酮 4.4.无胺甘氨酸无胺甘氨酸 3g/L3g/LBCYE-CysBCYE-Cys培养基培养基 为不含为不含L-L-半胱氨酸的酵母浸出物、炭粉培养基。按照半胱氨酸的酵母浸出物、炭粉培养基。按照配制配制BCYEBCYE培养基的方法配制，不加培养基的方法配制，不加L-L-半胱氨酸。半胱氨酸。标本肺组织、支气管灌洗液、血液、痰、胸水、胸腔引流物水源血清 处理与制备水样处理与制备血清学检测方法：*间接荧光抗体染色法*试管凝集试验*微量凝集试验（参考）*DOT-ELISA法*间接血凝试验（参考）*ELISA法接种军团菌BCYE培养基接种
27、军团菌选择性GVPC培养基37，5%CO2，培养3-14天挑可疑菌落革兰氏染色涂片镜检37,5%CO2,培养3-14天革兰氏染色阴性杆菌革兰氏染色阳性杆菌 纯培养 弃去 确认试验 血清玻片凝集试验 PCR检测 生化试验 选择培养基的接种选择培养基的接种1.1.一个一个GVPCGVPC培养基平板上可以接种培养基平板上可以接种0.10.10.5ml(0.5ml(浓缩或未浓浓缩或未浓缩缩)未经处理的样品。未经处理的样品。2.2.用无菌的涂抹器将液体均匀的涂抹在培养基表面。用无菌的涂抹器将液体均匀的涂抹在培养基表面。3.3.用同样的方法尽可能快地将经过热处理的用同样的方法尽可能快地将经过热处理的0.1
28、0.10.5ml0.5ml标本标本接种在另外一块接种在另外一块GVPCGVPC培养基平板上。培养基平板上。4.4.再用同样的方法尽可能快地将经过酸处理的再用同样的方法尽可能快地将经过酸处理的0.10.10.5ml0.5ml标标本接种到第三块本接种到第三块GVPCGVPC培养基平板上。培养基平板上。500ml水样过滤浓缩法过滤浓缩法将 5 0 0 m l 水 样 于0.22um滤膜过滤然后放于5ml无菌水中超声波振动3分钟=浓缩样本或高速离心浓缩法高速离心浓缩法将200ml水样置于离心机6000g离心10分钟，15-25 =浓缩样本直接涂布法直接涂布法于GVPC（2个平板）上分别涂布0.2ml原
29、液用PBS缓冲液0.01mol/L（PH7.2）稀释1：10的样本酸处理法酸处理法2ml浓缩液+2ml酸缓冲液（PH2.0）摇匀50.5分钟热处理法热处理法2 m l 浓 缩 液 于5 0 1 水 浴301分钟直接涂布法直接涂布法于GVPC平板上涂布0.1ml浓缩液，用PBS缓冲液稀释1：10的样本 涂布：0.2ml于GVPC平板涂布：0.2ml于GVPC平板孵育、平板观察及确认接种标本培养接种标本培养u接种过的培养基静置直至接种物被完全吸收，然后将平板接种过的培养基静置直至接种物被完全吸收，然后将平板倒置，在（倒置，在（36361 1）培养培养7-107-10天。天。u为了保证培养箱内的空气
30、的湿度，可以在培养箱内放置一为了保证培养箱内的空气的湿度，可以在培养箱内放置一个盛水的碟子。在每次观察培养物时，向碟子内注满新鲜个盛水的碟子。在每次观察培养物时，向碟子内注满新鲜的水（根据需要）。的水（根据需要）。u在含在含2.5-5.0%CO22.5-5.0%CO2的环境下培养有利于军团菌的生长。的环境下培养有利于军团菌的生长。孵育6个GVPC平板/每份样本37，5%CO2，培养3-10天 菌落验证：从每一个平皿上挑取2个可疑菌落，接种血平板及接种BCYE和L半光氨酸缺失的BCYE琼脂平板，3537培养2天，凡在BCYE琼脂平板上生长,而在L半光氨酸缺失的BCYE琼脂平板及血平板不生长的则为
31、军团菌菌落。平板的检查平板的检查观察结果：观察结果：在在3-103-10天的培养期间内，每天的培养期间内，每2 24 4天至少观察天至少观察3 3次，因为次，因为军团菌生长军团菌生长缓慢，易被其它菌掩盖。缓慢，易被其它菌掩盖。军团菌菌落特点（军团菌菌落特点（1 1）u军团军菌落通常呈灰白色，但也能呈蓝色、灰绿色、深褐军团军菌落通常呈灰白色，但也能呈蓝色、灰绿色、深褐色或深红色。色或深红色。u一般表面光滑湿润，边缘完整，并显示典型的毛玻璃样外一般表面光滑湿润，边缘完整，并显示典型的毛玻璃样外观。观。u在紫外灯下，某些种的菌落（博杰曼军团菌、高曼军团菌、在紫外灯下，某些种的菌落（博杰曼军团菌、高曼
32、军团菌、杜莫夫军团菌、安绥军团菌、奇锐军团菌、斯泰戈瓦尔特杜莫夫军团菌、安绥军团菌、奇锐军团菌、斯泰戈瓦尔特军团菌、格瑞梯纳军团菌、图森军团菌、巴黎军团菌）能军团菌、格瑞梯纳军团菌、图森军团菌、巴黎军团菌）能自动发出白色的耀眼荧光；某些种的军团菌也能发出红光。自动发出白色的耀眼荧光；某些种的军团菌也能发出红光。军团菌菌落特点（军团菌菌落特点（2 2）u嗜肺军团菌的菌落呈暗淡的绿嗜肺军团菌的菌落呈暗淡的绿色，并常伴有浅黄色。色，并常伴有浅黄色。u为了避免军团菌被杀死，平板为了避免军团菌被杀死，平板暴露于紫外灯下不能超过规定暴露于紫外灯下不能超过规定时间。时间。u值得注意的是，新发现的某些值得注意
33、的是，新发现的某些种的军团菌所具有的特征可能种的军团菌所具有的特征可能会和上述特征有所区别。会和上述特征有所区别。军团菌菌落特点军团菌菌落特点可疑军团菌菌落的进一步鉴定可疑军团菌菌落的进一步鉴定1.1.BCYEBCYE或其他培养基上传代培养或其他培养基上传代培养2.2.革兰染色镜检革兰染色镜检3.3.生化鉴定生化鉴定4.4.PCRPCR检测军团菌特异性基因片段检测军团菌特异性基因片段5.5.免疫荧光的方法确定军团菌的种类免疫荧光的方法确定军团菌的种类 BCYEBCYE或其他培养基上传代培养（或其他培养基上传代培养（1 1）1.1.至少从每块至少从每块GVPCGVPC平板上挑选出两个典型的军团菌
34、菌落，平板上挑选出两个典型的军团菌菌落，在在BCYEBCYE和和BCYE-BCYE-CysCys培养基上传代培养，传代培养要在两培养基上传代培养，传代培养要在两种培养基上同时进行。种培养基上同时进行。2.2.在（在（36361 1）至少培养两天。至少培养两天。3.3.凡是在凡是在BCYEBCYE培养基上生长而在培养基上生长而在BCYE-BCYE-CysCys培养基上不生长培养基上不生长的菌落即可初步认定为军团菌。的菌落即可初步认定为军团菌。BCYEBCYE或其他培养基上传代培养（或其他培养基上传代培养（2 2）u营养琼脂或血琼脂培养基可以代替营养琼脂或血琼脂培养基可以代替BCYE-CysBCY
35、E-Cys培养基。如果培养基。如果在这三种培养基上都不生长，原来选择性培养基上的可疑在这三种培养基上都不生长，原来选择性培养基上的可疑军团菌菌落应该继续传代培养。军团菌菌落应该继续传代培养。u橡树岭军团菌和幽灵湖军团菌在初次分离培养时需要橡树岭军团菌和幽灵湖军团菌在初次分离培养时需要L-L-半半胱氨酸和铁离子，但随后在胱氨酸和铁离子，但随后在L-L-半胱氨酸缺失时生长微弱。半胱氨酸缺失时生长微弱。BCYEBCYE培养基上传代培养培养基上传代培养革兰染色镜检革兰染色镜检军团菌是革兰染色阴性，浅红色的短杆菌，直径0.30.5m，长约1.25m或更长，菌体一端有鞭毛，长时间培养后鞭毛可能变成长丝状。
36、短杆状长丝状军团菌生化鉴定军团菌生化鉴定 军团菌生化特性生化试验结果触酶/弱+氧化酶-/+硝酸盐还原-尿素酶-明胶液化+水解马尿酸+淀粉水解弱+尿素酶试验尿素酶试验u阴性：培养基不变色u阳性：培养基由黄色变为红色硝酸盐还原试验硝酸盐还原试验u阴性：无红色出现u阳性：呈现红色 进行试验时必须有未接种的培养基管作为阴性对照。进行试验时必须有未接种的培养基管作为阴性对照。-萘胺具有致萘胺具有致 癌性、故使用时应加注意。癌性、故使用时应加注意。明胶液化试验明胶液化试验 将待试菌培养物穿刺接种于明胶高层约2/3深度。于36361 1 2.5-5.0%CO2培养2-3天后将培养基置于4 30分钟，取出观察
37、。u 阴性：凝固u 阳性：不凝固马尿酸水解试验马尿酸水解试验将待鉴定菌株，于0.4mL马尿酸钠溶液中，制成浓厚菌悬液，于361水浴培养2h后，沿管壁加入3.5水合印三酮试剂，形成两层，如果产生蓝紫色至深紫色，为阳性反应。阳性阴性氧化酶试验氧化酶试验阴性阳性触酶试验触酶试验取细菌至载玻片上涂抹，加1-2滴3%过氧化氢水溶液。若会迅速冒出气泡，则表示此细菌含有触酶，属于阳性反应。淀粉酶水解试验淀粉酶水解试验阳性反应：（淀粉被分解）琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培 养物周围出现无色透明环阴性反应：菌落周围无透明环确定军团菌的种型确定军团菌的种型 OxoidOxoid 的乳胶试剂盒可以鉴定出：的乳胶试剂盒
38、可以鉴定出：嗜肺军团菌血清1型;嗜肺军团菌血清2-14混合型；L.longbeachae1和2型，L.bozemanii1和2型，L.dumoffii，L.gormanii，L.jordanis，L.micdadei，L.anisa混合型。确定军团菌的种型确定军团菌的种型-11.1.在进行鉴定试验前，要保证在在进行鉴定试验前，要保证在BCYEBCYE培养基上生长的菌落培养基上生长的菌落是经过形态学检查的纯菌。是经过形态学检查的纯菌。2.2.属的鉴定，属的鉴定，16sRNA16sRNA。嗜肺军团菌的确定嗜肺军团菌的确定 应进行生化培养与血清学实验确定嗜肺军团菌。有条件的可做嗜肺军团菌特异的PCR
39、检测。生化培养：氧化酶（/弱+），硝酸盐还原，尿素酶，明胶液化，水解马尿酸,淀粉酶水解弱+血清学实验：用嗜肺军团菌诊断血清进行分型。PCR：mip,dnaJ 军团菌血清鉴定军团菌血清鉴定日本生研所Lp1-6,Lb,Lg,Lm,Ll结果表述结果表述1.1.为了计算原始水样或沉积物中菌落形成数（为了计算原始水样或沉积物中菌落形成数（CFU/mlCFU/ml），），从三块从三块GVPCGVPC平板培养基中挑选出已确定军团菌生长最多平板培养基中挑选出已确定军团菌生长最多的平板。根据浓缩倍数推算出原始水样中的细菌数。的平板。根据浓缩倍数推算出原始水样中的细菌数。2.2.计算三个计算三个GVPCGVPC平
40、板培养基上菌落生长的平均数是不适宜平板培养基上菌落生长的平均数是不适宜的，因为这是不能累加的。的，因为这是不能累加的。检验报告检验报告实验报告应包括以下信息实验报告应包括以下信息1.国际标准的参考国际标准的参考2.鉴定该标本的全部必需的细节，包括采样部位、采样时的鉴定该标本的全部必需的细节，包括采样部位、采样时的操作、样品性质、水系统或植物的种类、采样点的类别。操作、样品性质、水系统或植物的种类、采样点的类别。3.被检测标本的体积和数量被检测标本的体积和数量4.采样日期采样日期 样品收集日期样品收集日期 实验室接收日期实验室接收日期 实验室检测日期实验室检测日期5.分析过程中所观察到的任何情况
41、都可能影响最后的结果。分析过程中所观察到的任何情况都可能影响最后的结果。菌株保存菌株保存（一）短期保存（一）短期保存 将军团菌接种在将军团菌接种在BCYEBCYE斜面培养基上，可以在斜面培养基上，可以在4 4 保存数周。保存数周。（二）长期保存（二）长期保存 如要长期保存军团菌，最好用冻干保存法或低温如要长期保存军团菌，最好用冻干保存法或低温 冷冻保存法。而冻干保存法因为在冷冻保存法。而冻干保存法因为在4 4 或或 20 20 保保 存时间更长，且运输过程中不受影响，因此是最好的存时间更长，且运输过程中不受影响，因此是最好的 保存方法。保存方法。低温冷冻保存法低温冷冻保存法1、将军团菌接种在BCYE平板上，361，2.5%-5%CO2培养箱或烛缸中培养，确定没有污染。2、将已灭菌的含有ACES、L-半胱氨酸和15%-20%甘油的保存液分装至2ml的螺帽冻存管中，每管1ml。3、用灭菌棉签从BCYE平板上刮取适量细菌。放入以上装有保存液的冻存管中。注意，使用的冻存管必须能耐受低温。4、将冻存管放入-70 冰箱保存。也可以放于-20冰箱，但是菌株存活率可能受影响。谢谢 谢谢
