1、兔自身免疫性干眼模型制作与检兔自身免疫性干眼模型制作与检测测兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型概要概要通过体外分离、培养兔泪腺上皮细胞和自体外周血淋巴细胞，建立通过体外分离、培养兔泪腺上皮细胞和自体外周血淋巴细胞，建立二者的共培养体系。将体外激活的自体外周血淋巴细胞通过耳缘静二者的共培养体系。将体外激活的自体外周血淋巴细胞通过耳缘静脉注射的方法诱发自身免疫性泪腺炎。从而建立稳定的兔自身免疫脉注射的方法诱发自身免疫性泪腺炎。从而建立稳定的兔自身免疫性干眼模型，对干眼临床指标及泪腺细胞因子表达进行检测。性干眼模型，对干眼临床指标及泪腺细胞因子表达进行检测。兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼
2、模型实验动物实验动物：成年雌性新西兰白兔，体质量成年雌性新西兰白兔，体质量2.63.5kg。实验前进行兔子临床眼科检查实验前进行兔子临床眼科检查,排除已患有眼部炎症和其他疾病的动物，建立正常兔眼的排除已患有眼部炎症和其他疾病的动物，建立正常兔眼的临床检查指标的基线水平。临床检查指标的基线水平。饲养环境符合医学实验动物环境的要求，动物饲养房温度为饲养环境符合医学实验动物环境的要求，动物饲养房温度为 252，相对湿度，相对湿度 50%75%，12 小时光照昼夜循环，通风状况好。小时光照昼夜循环，通风状况好。兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型实验所用的主要仪器、设备及材料实验所用的主要仪器、设
3、备及材料：生物超净工作台生物超净工作台CO2恒温细胞培养箱恒温细胞培养箱移液枪移液枪-80超低温冰箱超低温冰箱倒置相差显微镜倒置相差显微镜台式离心机台式离心机裂隙灯显微镜摄像系统裂隙灯显微镜摄像系统离心管、枪头离心管、枪头PCR仪仪实时定量实时定量PCR仪仪流式细胞仪流式细胞仪流式管流式管超纯水装置超纯水装置低温水箱低温水箱裂隙灯显微镜裂隙灯显微镜恒温水浴锅恒温水浴锅眼科手术器械眼科手术器械祸旋仪祸旋仪高压蒸汽消毒器高压蒸汽消毒器电子天平电子天平鼓风式干燥箱鼓风式干燥箱磁力搅拌器磁力搅拌器PH测量计测量计荧光显微镜荧光显微镜SY-600恒温水箱恒温水箱Nylon细胞滤网细胞滤网兔自身免疫性干眼
4、模型兔自身免疫性干眼模型主要试剂及溶液配制主要试剂及溶液配制：淋巴细胞培养基（淋巴细胞培养基（CM）RPMI1640细胞培养基细胞培养基 450ml胎牛血清（胎牛血清（FBS）10%青链霉素青链霉素 100U/mlL-谷氨酰胺谷氨酰胺 2mM2-mercaptoethano 0.5ml泪腺上皮细胞培养基（泪腺上皮细胞培养基（DMEM）DMEM（1X high glucose）450ml胎牛血清（胎牛血清（FBS）10%青链霉素青链霉素 100U/mlL-谷氨酰胺谷氨酰胺 2mM兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型主要试剂及溶液配制主要试剂及溶液配制：Hams液液Hams F-12 1LHe
5、pes 10ml/L牛血清蛋白蛋白（牛血清蛋白蛋白（BSA）100U/ml胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂 50mg/L丁酸丁酸 0.22g/L青链霉素青链霉素 100U/mlL-谷氨酰胺谷氨酰胺 2mM亚油酸亚油酸 1mg/ml 42ul各组分充分溶解于各组分充分溶解于900ml Hams F-12后调节后调节PH值至值至7.4，Hams F-12定容至定容至1000ml，0.22m 滤器过滤，滤器过滤，4冰箱保存备用。冰箱保存备用。兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型主要试剂及溶液配制主要试剂及溶液配制：Hanks液液Hanks Salts 1bottleHepes 2.38gEDTA 0
6、.76g各组分充分溶解于各组分充分溶解于900ml 超纯水后调节超纯水后调节PH值至值至7.4，超纯水定容至，超纯水定容至 1000mL，0.22m 滤器过滤，滤器过滤，4冰箱避光保存。冰箱避光保存。混合消化酶（混合消化酶（CDH）胶原酶胶原酶 collagenase 450unit/ml透明质酸酶透明质酸酶 hyyaluronidase 200unit/mlDNA酶酶 25unit/ml分别称取计算好的分别称取计算好的型胶原酶和透明质酸酶，将其充分溶解于一定体积的型胶原酶和透明质酸酶，将其充分溶解于一定体积的 Hams液中，液中，加入溶解分装好的加入溶解分装好的 DNA 酶充分混匀，酶充分混
7、匀，0.22m 滤器过滤，滤器过滤，4冰箱备用。冰箱备用。兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型主要试剂及溶液配制主要试剂及溶液配制：10%FicollFicoll 粉与粉与 DPBS 按比例配制高压灭菌按比例配制高压灭菌,分装后分装后-20C 避光保存。避光保存。实时突光定量实时突光定量 PCR 试剂盒试剂盒 SYBR Green(Roche 491385001)PE-Anti-Human Foxp3(Biolegend)Anti-Rabbit CD4(Mouse anti-Rabbit Monoclonal AntibodyAbD)淋巴细胞分离液淋巴细胞分离液 无无 RNA 酶水（酶水（
8、DEPC 水）水）兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型实验方法实验方法：1、兔泪腺上皮细胞分离、纯化、培养、兔泪腺上皮细胞分离、纯化、培养（1）新西兰大白兔肌肉注射陆眠宁和氯胺酮（两者的比例为）新西兰大白兔肌肉注射陆眠宁和氯胺酮（两者的比例为2:3，0.3-0.4ml/kg）进行麻醉，）进行麻醉，剪去兔左眼睫毛，将生理盐水和碘伏按剪去兔左眼睫毛，将生理盐水和碘伏按1:1稀释，充分清洗术眼结膜囊，再用生理盐水清洗，以稀释，充分清洗术眼结膜囊，再用生理盐水清洗，以免碘伏刺激眼表，后用免碘伏刺激眼表，后用0.5%盐酸丁卡因滴眼液滴术眼，后用无菌手术器械将麻醉后的兔子在超盐酸丁卡因滴眼液滴术眼，后
9、用无菌手术器械将麻醉后的兔子在超净台中操作摘取兔左下泪腺净台中操作摘取兔左下泪腺,将泪腺转移到提前配置好的装有双抗和将泪腺转移到提前配置好的装有双抗和Hams液的液的50ml离心管中。离心管中。（2）在细胞间超净台进行以下操作，将泪腺和少量的）在细胞间超净台进行以下操作，将泪腺和少量的Hams液放入培养皿中，先剔除泪腺组液放入培养皿中，先剔除泪腺组织周围的血管、脂肪组织和筋膜，无菌刀将腺体切碎至约织周围的血管、脂肪组织和筋膜，无菌刀将腺体切碎至约1mm1mm的组织块，用移液枪加入的组织块，用移液枪加入Hanks液后吹打吹散组织块，转移到液后吹打吹散组织块，转移到50ml离心管中倾斜静置离心管中
10、倾斜静置15min，弃掉上清。，弃掉上清。（3）然后再加入）然后再加入Hams液吹打均匀倾斜静置液吹打均匀倾斜静置15min，小心弃掉上清，以防组织块的丢失。，小心弃掉上清，以防组织块的丢失。（4）加入配置好的消化酶（胶原酶，透明质酸酶，）加入配置好的消化酶（胶原酶，透明质酸酶，DNA酶）酶）,磁力搅拌器提前设置好温度和转磁力搅拌器提前设置好温度和转速，速，37恒温水浴消化恒温水浴消化10min。兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型实验方法实验方法：1、兔泪腺上皮细胞分离、纯化、培养、兔泪腺上皮细胞分离、纯化、培养（5）取出后静置）取出后静置15min，弃掉上清，加入，弃掉上清，加入10m
11、l Hanks液反复吹打后静置液反复吹打后静置15min，弃掉上清。，弃掉上清。（6）再加入配置好剩余的消化酶，）再加入配置好剩余的消化酶，37水浴消化水浴消化30min，观察组织块的大小，可适当的增减，观察组织块的大小，可适当的增减10min。（7）然后用）然后用Hams液浸润液浸润40m无菌细胞筛，将其置于无菌细胞筛，将其置于50ml离心管上，将稀释后的混合液吹离心管上，将稀释后的混合液吹打均匀后过滤，打均匀后过滤，1000rpm离心离心6min，弃上清。，弃上清。（8）加入）加入20ml Hanks液吹打均匀，离心液吹打均匀，离心1000rpm，6min，弃上清，加入，弃上清，加入5ml
12、 Hams液充液充分混匀。分混匀。（9）提前准备质量分数为）提前准备质量分数为10%的的Ficoll（Sigma Ficoll粉与粉与 Hams液配制），用液配制），用Hams液液稀释到稀释到2%、3%、4%，从下到上依次为，从下到上依次为4%、3%、2%各各5ml加入加入50ml离心管中，将细胞悬液缓离心管中，将细胞悬液缓慢加入到慢加入到Ficoll液面上，进行密度梯度离心，液面上，进行密度梯度离心，400 rpm离心离心10min，上下加速度为，上下加速度为0。兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型实验方法实验方法：1、兔泪腺上皮细胞分离、纯化、培养、兔泪腺上皮细胞分离、纯化、培养（10
13、）离心后，细胞在最底层。弃上清，用）离心后，细胞在最底层。弃上清，用PBS缓冲液洗两遍细胞，洗掉杂质和缓冲液洗两遍细胞，洗掉杂质和Ficoll，离心，离心结束尽可能弃干净上清。结束尽可能弃干净上清。（11）加入）加入DMEM完全培养基（完全培养基（10%FBS+1%双抗双抗+1%谷氨酰胺谷氨酰胺+DMEM基础培养基），进行基础培养基），进行细胞计数和细胞活性观察，细胞计数后取一定数量细胞计数和细胞活性观察，细胞计数后取一定数量105细胞于细胞于100L PBS内吹打均匀，再加入内吹打均匀，再加入100L的台盼蓝，显微镜下观察计数板上细胞染色情况，计录未着染的细胞百分比。的台盼蓝，显微镜下观察计
14、数板上细胞染色情况，计录未着染的细胞百分比。（12）将分离的泪腺上皮细胞）将分离的泪腺上皮细胞1.5105/孔放置孔放置24孔板中于孔板中于37、5%CO2、100%饱和湿度的饱和湿度的培养箱中培养。培养箱中培养。兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型实验方法实验方法：2、兔外周血淋巴细胞分离、培养、兔外周血淋巴细胞分离、培养（1）将新西兰大白兔固定，兔耳中动脉碘伏消毒后用酒精棉球擦拭使其血管扩张，用提前准）将新西兰大白兔固定，兔耳中动脉碘伏消毒后用酒精棉球擦拭使其血管扩张，用提前准备的静脉采血针和采血管采血，每只兔预计抽大约备的静脉采血针和采血管采血，每只兔预计抽大约20mL的外周血。的外
15、周血。（2）用提前预热的）用提前预热的37的的PBS缓冲液将外周血稀释缓冲液将外周血稀释3倍后装在倍后装在50mL离心管中（每管约离心管中（每管约30ml）。）。（3）将每管约）将每管约30ml稀释的外周血缓慢加入到稀释的外周血缓慢加入到10mL淋巴细胞分离液液面上，离心淋巴细胞分离液液面上，离心2000 rpm，20min，上下加速度为，上下加速度为0。（4）离心后可见离心管中分三层，在上、中间层界面处有一以淋巴细胞为主的白色云雾状狭）离心后可见离心管中分三层，在上、中间层界面处有一以淋巴细胞为主的白色云雾状狭窄带，这一层细胞即为所需要，吸取收集该层淋巴细胞带放入新的窄带，这一层细胞即为所需
16、要，吸取收集该层淋巴细胞带放入新的50mL离心管中。离心管中。（5）加入）加入PBS缓冲液，离心缓冲液，离心2000 rpm，10min,弃上清，再加入弃上清，再加入PBS缓冲液离心。缓冲液离心。兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型实验方法实验方法：2、兔外周血淋巴细胞分离、培养、兔外周血淋巴细胞分离、培养（6）加淋巴细胞培养基（）加淋巴细胞培养基（10%FBS+1%双抗双抗+1%谷氨酰胺谷氨酰胺+RPMI1640培养基培养基+巯基乙醇），巯基乙醇），计数，进行细胞计数和细胞活性观察，细胞计数后取一定数量计数，进行细胞计数和细胞活性观察，细胞计数后取一定数量105细胞于细胞于100LPBS
17、内吹打均匀，内吹打均匀，再加入再加入100L的台盼蓝，计录未着染的细胞百分比。的台盼蓝，计录未着染的细胞百分比。（7）分别配制与泪腺上皮细胞等密度的细胞液。）分别配制与泪腺上皮细胞等密度的细胞液。兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型实验方法实验方法：3、建立自体细胞混合培养体系、建立自体细胞混合培养体系泪腺上皮细胞培养于平底泪腺上皮细胞培养于平底24孔板内（孔板内（1.5x105个个/孔），单独培养孔），单独培养2d的泪腺上皮细胞，进行的泪腺上皮细胞，进行线线照射（剂量为照射（剂量为25Gy），使其失去反应能力，成为刺激细胞。），使其失去反应能力，成为刺激细胞。载有泪腺上皮细胞的载有泪腺上
18、皮细胞的24孔板照完射线后，每孔加入当天分离等数量的外周血淋巴细胞孔板照完射线后，每孔加入当天分离等数量的外周血淋巴细胞1.5105个，此时泪腺上皮细胞已贴壁，淋巴细胞为悬浮细胞，加入淋巴细胞时候小心缓慢加入，以防个，此时泪腺上皮细胞已贴壁，淋巴细胞为悬浮细胞，加入淋巴细胞时候小心缓慢加入，以防吹起已贴壁的泪腺上皮细胞，建立混合培养体系，培养吹起已贴壁的泪腺上皮细胞，建立混合培养体系，培养5天。天。兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型实验方法实验方法：4、自身免疫干眼模型的制备、自身免疫干眼模型的制备（1）实验分组：）实验分组：24只术前检查合格的雌性新西兰大白兔，按照随机数表法给兔子编号
19、，分为只术前检查合格的雌性新西兰大白兔，按照随机数表法给兔子编号，分为2组即正常对照组，干眼模型组。干眼模型组为静脉回输自体激活的外周血淋巴细胞诱导的兔自组即正常对照组，干眼模型组。干眼模型组为静脉回输自体激活的外周血淋巴细胞诱导的兔自身免疫性干眼。正常对照组为静脉回输与干眼模型组等体积的身免疫性干眼。正常对照组为静脉回输与干眼模型组等体积的PBS缓冲液。缓冲液。（2）干眼模型的制备：将标注好的雌性新西兰白兔固定，预先准备好输液器、）干眼模型的制备：将标注好的雌性新西兰白兔固定，预先准备好输液器、5ml、10ml针针管、酒精、碘伏，以及预先准备好的淋巴细胞（混合体系混合培养管、酒精、碘伏，以及
20、预先准备好的淋巴细胞（混合体系混合培养5天，观察发现淋巴细胞较之天，观察发现淋巴细胞较之前体积变大，呈圆形，聚集性分布，周围可见围绕的泪腺上皮细胞，用前体积变大，呈圆形，聚集性分布，周围可见围绕的泪腺上皮细胞，用1ml枪头缓慢吹起落在底枪头缓慢吹起落在底部的淋巴细胞，收集到部的淋巴细胞，收集到50ml离心管中，在这个过程中在显微镜下观察进来避免吹起贴壁的泪腺离心管中，在这个过程中在显微镜下观察进来避免吹起贴壁的泪腺上皮细胞，用上皮细胞，用PBS缓冲液将缓冲液将24孔板洗两遍，孔板洗两遍，2000rpm离心离心10min，弃掉上清，再用，弃掉上清，再用PBS缓冲液缓冲液洗一遍，之后加洗一遍，之后
21、加1ml的的PBS缓冲液计数，吹散细胞，尽可能不要有细胞团块避免栓塞发生的可能，缓冲液计数，吹散细胞，尽可能不要有细胞团块避免栓塞发生的可能，最后按照淋巴细胞最后按照淋巴细胞2105每只兔子的数量，每只兔子每只兔子的数量，每只兔子1ml转移到转移到50ml离心管中放在冰上保持细离心管中放在冰上保持细胞活性，以备使用）。胞活性，以备使用）。兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型实验方法实验方法：4、自身免疫干眼模型的制备、自身免疫干眼模型的制备釆用静脉输液器，预先将釆用静脉输液器，预先将PBS充满整个静脉回输装置排空空气预防空气栓塞。通过耳缘静脉回充满整个静脉回输装置排空空气预防空气栓塞。通过
22、耳缘静脉回输激活的自体激活的外周血淋巴细胞（输激活的自体激活的外周血淋巴细胞（2x106/ml，1ml）为干眼模型组，耳缘静脉碘伏消毒后）为干眼模型组，耳缘静脉碘伏消毒后用用2ml的注射器推注的注射器推注1mLPBS确保液体进入静脉血管中，然后在接头处换成有细胞液的注射器，确保液体进入静脉血管中，然后在接头处换成有细胞液的注射器，注射前保证无细胞沉淀以防栓塞，匀速推注，最后换成装有注射前保证无细胞沉淀以防栓塞，匀速推注，最后换成装有PBS的注射器，再输入的注射器，再输入1ml左右的左右的PBS保证细胞完全进入到血管中，以防细胞丢失。静脉回输等量保证细胞完全进入到血管中，以防细胞丢失。静脉回输等
23、量PBS的新西兰白兔为对照组。的新西兰白兔为对照组。兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型临床指标的检测临床指标的检测：移植前和移植后移植前和移植后2周、周、4 周、周、6 周分别进行以下临床指标的观察：周分别进行以下临床指标的观察：泪液分泌量实验（泪液分泌量实验（Schirmers实验）实验）将兔子固定好，在非表麻条件下，将将兔子固定好，在非表麻条件下，将 Schirmers 试纸条顶端放置于下穹窿结膜中外侧试纸条顶端放置于下穹窿结膜中外侧1/3处，处，检查者辅助闭合兔眼，此时尽量避免兔子第三眼睑遮住角膜以及试纸条，计时检查者辅助闭合兔眼，此时尽量避免兔子第三眼睑遮住角膜以及试纸条，计时1
24、分钟后取出试纸分钟后取出试纸条，记录湿润长度，试验过程中尽量避免试纸条接触角膜，以免造成角膜上皮损伤。条，记录湿润长度，试验过程中尽量避免试纸条接触角膜，以免造成角膜上皮损伤。泪膜稳定性实验（泪膜破裂时间泪膜稳定性实验（泪膜破裂时间tear break-up time，BUT）将兔子固定好，眼表滴将兔子固定好，眼表滴10L荧光素液，检查者辅助兔眨眼荧光素液，检查者辅助兔眨眼 3 次，计时次，计时1分钟，检查者辅助打开分钟，检查者辅助打开上下眼睑，检查者用手持裂隙灯，在钴蓝光下观察角膜表面泪膜破裂时间以及泪河高度，重复上下眼睑，检查者用手持裂隙灯，在钴蓝光下观察角膜表面泪膜破裂时间以及泪河高度，
25、重复三次取平均值。三次取平均值。角膜、结膜荧光素钠染色实验角膜、结膜荧光素钠染色实验将兔子固定好，复方托比卡按散瞳，等待大约十分钟，等其瞳孔完全散开后，眼表滴将兔子固定好，复方托比卡按散瞳，等待大约十分钟，等其瞳孔完全散开后，眼表滴10L荧光荧光素液，计时素液，计时1分钟，使荧光素液均匀平铺于眼表，检查者辅助打开上下眼睑，将裂隙灯下调至钴分钟，使荧光素液均匀平铺于眼表，检查者辅助打开上下眼睑，将裂隙灯下调至钴蓝光，观察角膜、结膜的着染情况并拍照记录。蓝光，观察角膜、结膜的着染情况并拍照记录。兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型组织病理学观察组织病理学观察：分别于移植后分别于移植后6周从各组
26、中新西兰大白兔注射戊巴比妥钠（周从各组中新西兰大白兔注射戊巴比妥钠（56mg/kg）处死兔子，分离上下）处死兔子，分离上下泪腺、结膜、角膜置于泪腺、结膜、角膜置于10%甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋，甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋，HE染色后观察浸润细胞的情况。染色后观察浸润细胞的情况。（1）取泪腺、结膜等组织块，用）取泪腺、结膜等组织块，用 10%甲醛溶液固定，固定后常规石蜡包埋，切片。甲醛溶液固定，固定后常规石蜡包埋，切片。（2）石蜡包埋切片后用二甲苯脱蜡，二甲苯）石蜡包埋切片后用二甲苯脱蜡，二甲苯I、二甲苯、二甲苯各各5min，100乙醇、乙醇、2min，95的乙醇、的乙醇、1min，80乙
27、醇、乙醇、75的乙醇各的乙醇各1min，蒸馏水洗，蒸馏水洗2min。（3）苏木素染色）苏木素染色5min后冲洗。后冲洗。（4）1%盐酸乙醇浸泡盐酸乙醇浸泡30s（数下）。（数下）。（5）自来水浸泡）自来水浸泡15min。（6）伊红液染色）伊红液染色2min。（7）常规脱水，）常规脱水，95乙醇乙醇I、1min，95乙醇乙醇、1min，100乙醇乙醇I、1min，100乙醇乙醇、1min，二甲苯石碳酸（，二甲苯石碳酸（3：1）1min，二甲苯透明，二甲苯，二甲苯透明，二甲苯I、1min，二甲苯，二甲苯、1min。（8）中性树脂封片固定。）中性树脂封片固定。兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型
28、泪腺组织泪腺组织RNA的提取的提取：（1）分别于移植后）分别于移植后6周将各组中新西兰大白兔注射戊巴比妥钠（周将各组中新西兰大白兔注射戊巴比妥钠（56mg/kg）处死兔子，收集）处死兔子，收集上、下泪腺、结膜、角膜组织，将泪腺组织剪至上、下泪腺、结膜、角膜组织，将泪腺组织剪至1cm的组织块装于的组织块装于1.5mlEP管中，迅速放于液管中，迅速放于液氮后转移到氮后转移到-80的冰箱中。的冰箱中。（2）将所提）将所提RNA组织找到放到液氮瓶中，现将研钵和研棒提前一天组织找到放到液氮瓶中，现将研钵和研棒提前一天84液浸泡，提前液浸泡，提前2小时小时18.2纯水浸泡，用卫生纸擦干后先用液氮降温，待研
29、钵中的液氮稳定后，将组织块在液氮中研纯水浸泡，用卫生纸擦干后先用液氮降温，待研钵中的液氮稳定后，将组织块在液氮中研磨，保证充足的液氮，将组织块研磨成粉末后，加入磨，保证充足的液氮，将组织块研磨成粉末后，加入1ml的的Trizol后转移到后转移到1.5ml的的EP管中，充管中，充分吹打。分吹打。（3）再按每）再按每1mlTrizol加入加入0.2ml比例的氯仿，盖紧盖子，用力上下剧烈摇晃比例的氯仿，盖紧盖子，用力上下剧烈摇晃15秒，呈粉色秒，呈粉色混合物。混合物。（4）常温静置）常温静置15min，4离心机离心机12000rpm 离心离心15min，离心后可见，离心后可见EP管内分为三层，最管内
30、分为三层，最上层为上清液，中间一层为白色膜状物，最底层为红色沉淀物。上层为上清液，中间一层为白色膜状物，最底层为红色沉淀物。（5）将上清转移至另一新的标记好的）将上清转移至另一新的标记好的1.5mL进口进口EP管中，再加入等体积的异丙醇，室温静管中，再加入等体积的异丙醇，室温静置置10min，4 离心机离心机12000rpm离心离心10min。兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型泪腺组织泪腺组织RNA的提取的提取：（6）弃掉上清，加入）弃掉上清，加入1ml的的75%乙醇（提前配置：乙醇（提前配置：750uL无水乙醇无水乙醇+250uL DEPC水），倒水），倒置上下摇晃几次，置上下摇晃几次
31、，4 离心机离心机10000rpm 离心离心5min。（7）观察管底，避免枪头碰到管底，弃掉上清，打开管盖干燥）观察管底，避免枪头碰到管底，弃掉上清，打开管盖干燥10min。（8）随后将）随后将RNA溶于溶于20uL的的DEPC水中，置于冰上，混匀后取水中，置于冰上，混匀后取1L在在NanoDrop ND-100上上测测RNA浓度，测三次，取其均值，记录标注好并将浓度，测三次，取其均值，记录标注好并将RNA-保存在保存在80冰箱中。冰箱中。兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型泪腺组织泪腺组织RNA逆转录逆转录：（1）将保存于）将保存于-80的所需的的所需的RNA置于冰上待其溶解，根据标注好
32、所测的浓度按照置于冰上待其溶解，根据标注好所测的浓度按照1gRNA，20l体系逆转录，计算出不同体系逆转录，计算出不同RNA所加的体积。所加的体积。（2）先将）先将RNA所在所在EP管涡旋离心，将标记好的管涡旋离心，将标记好的EP管分别加入计算好体积的管分别加入计算好体积的RNA，Oligo(dT)1l,DEPC水补到水补到12l，涡旋离心后置于冰上待用。，涡旋离心后置于冰上待用。（3）用）用Thermo PCR仪，提前设置好温度时间，待仪，提前设置好温度时间，待PCR仪机器盖子温度升高后放入样本，仪机器盖子温度升高后放入样本，65 5min。（4）取出样本置于冰上，每个样本按顺序加入）取出样
33、本置于冰上，每个样本按顺序加入 5Reaction buffer 4l Inhibitor 1l Transcriptase 1l 10MmdNTP Mix 2l（5）涡旋离心混匀后，待）涡旋离心混匀后，待PCR仪机器盖子温度升高到仪机器盖子温度升高到40后放入各样本，后放入各样本，42 60分钟，分钟，70 5分钟，待反应结束后即分钟，待反应结束后即EP管中的为逆转录生成的管中的为逆转录生成的cDNA，将其逆转录产物，将其逆转录产物cDNA置于冰上，然置于冰上，然后用后用DEPC水稀释水稀释10倍，涡旋离心混匀后置于倍，涡旋离心混匀后置于-80冰箱保存。冰箱保存。兔自身免疫性干眼模型兔自身免
34、疫性干眼模型实时定量实时定量PCR（quantitative real-time PCR）RT-PCR：反应原理反应原理:使用美国使用美国Applied Biosystems公司的实时荧光定量聚合酶链反应（公司的实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）仪分析）仪分析应用应用 Applied Biosystems 7900HT FastReal-time PCR System，SYBR Green 法，使用法，使用 Fast SYBRGreen Master Mix。在。在PCR反应过程中反应过程中SYBRGreen荧光染料掺入荧光染料掺入DNA双链后发双链后发射荧光信号，而不掺入射荧光信号，而不掺入
35、DNA双链的双链的SYBR荧光染料不会有荧光信号，所以荧光染料不会有荧光信号，所以SYBR Green荧光信号荧光信号与与DNA扩增产物的增加一致。双链扩增产物的增加一致。双链DNA在变性过程中解开呈单链，没有荧光在变性过程中解开呈单链，没有荧光,在形成双链在形成双链DNA的复性和延伸过程中的复性和延伸过程中,SYBR Green发出荧光，此阶段发出荧光，此阶段PCR仪器釆集荧光信号。利用此信号的变仪器釆集荧光信号。利用此信号的变化对化对PCR扩增反应中扩增产物扩增量的变化进行检测，用循环数对基因定量分析。扩增反应中扩增产物扩增量的变化进行检测，用循环数对基因定量分析。GAPDH将作将作为反应
36、内在参照为反应内在参照,用内参对所检测样品所含的用内参对所检测样品所含的DNA进行定量分析的方法。相对定量结果分析采用进行定量分析的方法。相对定量结果分析采用比较荧光强度达阈值时的循环数比较荧光强度达阈值时的循环数(Ct)值法（值法（2-Ct法），扩增的倍数法），扩增的倍数=2-Ct，Ct=（Ct目目的基因的基因-Ct内参）实验组内参）实验组-（Ct目的基因目的基因-Ct内参）对照组。各指标均重复检测内参）对照组。各指标均重复检测3次，取平均值。本次，取平均值。本实验通过实时定量实验通过实时定量PCR检测泪腺组织中检测泪腺组织中Th1、Th17、Treg细胞分化相关细胞因子及转录因子细胞分化相
37、关细胞因子及转录因子mRNA相对表达量。相对表达量。兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型实时定量实时定量PCR（quantitative real-time PCR）RT-PCR：所测基因上下游引物序列如下：所测基因上下游引物序列如下：GAPDH Forward primer GGGTGGTGGACCTCATGGT Reverse primer CGGTGGTTTGAGGGCTCTTAIFN-Forward primer CTCTGCCTCATCTTGGGTTCTT Reverse primer GGTGTTCTGTTTCTCTGGTTAGTGTGTIL-10 Forward primer
38、 GGCTGAGGCTGCGACAAT Reverse primer TGCCTTGCTCTTGTTTTCACATGF-Forward primer CAAGGACCTGGGCTGGAA Reverse primer AGGCAGAAGTTGGCGTGGTAIL-6 Forward primer GCAGAAAAACCAGTGGCTGAA Reverse primer GGCCGCGCAGGATGAIL-17 Forward primer GGAATGAGGACCACCACATGA Reverse primer CTGCGTAGGACCAGGATCTCTTTNF-Forward primer
39、AGCTTCTCGGGCCCTGAGT Reverse primer CCACTTGCGGGTTTGCTACTT-bet Forward primer GATGCGCCAGGAAGTTTCA Reverse primer TGTTGGAGGCCCCTTTATTGRORrt Forward primer GGCCTACCACGCCGA Reverse primer TCCATGCCACCGTATTTGC兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型实时定量实时定量PCR（quantitative real-time PCR）RT-PCR：（1）从）从-20冰箱中取出引物，置于冰上待其完全溶解，先配置冰
40、箱中取出引物，置于冰上待其完全溶解，先配置100uM浓度的，混合均匀，随浓度的，混合均匀，随后分装稀释到后分装稀释到4uM浓度的引物。浓度的引物。（2）从）从-20冰箱中取出冰箱中取出FastSYBR Green Master Mix，置于冰上避光待其完全溶解待用。，置于冰上避光待其完全溶解待用。（3）从）从-80 冰箱中取出冰箱中取出cDNA置于冰上待其完全溶解，溶解后混均匀。置于冰上待其完全溶解，溶解后混均匀。（4）8ul反应体系包括反应体系包括:SYBR Green 4ul 上游引物（上游引物（4uM）lul 下游引物（下游引物（4uM）lul cDNA 2ul提前配置好提前配置好SYB
41、R Green和上下游引物的混合液，计算好所需的和上下游引物的混合液，计算好所需的cDNA的量，的量，384孔板中每孔先孔板中每孔先加入加入SYBR Green和上下游引物的混合液，再根据样本所检测加入和上下游引物的混合液，再根据样本所检测加入cDNA。兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型实时定量实时定量PCR（quantitative real-time PCR）RT-PCR：（5）配制混合液和）配制混合液和384孔板的上样操作过程均需避光进行，加样结束后，孔板的上样操作过程均需避光进行，加样结束后，384孔板封膜。孔板封膜。（6）先将）先将384孔板置于祸旋器涡旋孔板置于祸旋器涡旋lO
42、秒，使其反应体系充分混合均匀。秒，使其反应体系充分混合均匀。（7）提前预冷离心机，再将）提前预冷离心机，再将384孔板置于离心机孔板置于离心机4000rpm，4min离心。离心。（8）再将）再将384孔板放入孔板放入Applied Biosystems 7900HT Fast Rea1-Time PCR 仪仪,做好标记做好标记,设设好参数开始，好参数开始，50 2min,95 10min,40个循环，循环条件为个循环，循环条件为95C,15s,60 1min。（9）结束后保存数据，分析结果。）结束后保存数据，分析结果。兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型流式细胞检测流式细胞检测 Treg
43、细胞细胞：泪腺组织流式细胞学检测泪腺组织流式细胞学检测（1）新西兰大白兔用陆眠宁和氯胺酮麻醉后，空气栓塞处死兔子，新西兰大白兔处死后，在）新西兰大白兔用陆眠宁和氯胺酮麻醉后，空气栓塞处死兔子，新西兰大白兔处死后，在超净台中摘取右下下泪腺，转移到含有双抗的超净台中摘取右下下泪腺，转移到含有双抗的 Hams 液的液的 50ml离心管中。离心管中。（2）在细胞间超净台进行以下操作，将泪腺和少量的）在细胞间超净台进行以下操作，将泪腺和少量的Hams液放入培养皿中，先剔除泪腺组液放入培养皿中，先剔除泪腺组织周围的血管、脂肪组织和筋膜，无菌刀将腺体切碎至约织周围的血管、脂肪组织和筋膜，无菌刀将腺体切碎至约
44、1mm1mm的组织块，用移液枪加入的组织块，用移液枪加入Hanks液后吹打吹散组织块，在液后吹打吹散组织块，在50ml离心管中倾斜静置离心管中倾斜静置15min，弃掉上清。，弃掉上清。（3）然后再加入）然后再加入Hams液吹打均匀倾斜静置液吹打均匀倾斜静置15min，小心弃掉上清，以防组织块的丢失。，小心弃掉上清，以防组织块的丢失。（4）提前配制好胶原酶消化液，将浓度为）提前配制好胶原酶消化液，将浓度为 600U/ml 的胶原酶加入到泪腺组织块中的胶原酶加入到泪腺组织块中,其置于其置于 37水浴箱，水浴箱，（5）离心管置于水浴箱中，约）离心管置于水浴箱中，约 20min 摇晃离心管数二三十次，
45、使组织块充分接触消化酶，观摇晃离心管数二三十次，使组织块充分接触消化酶，观察组织块的大小，消化察组织块的大小，消化 3h 左右。左右。（6）将组织块消化的混合液加）将组织块消化的混合液加 Hams 液稀释，用液稀释，用 40um 的细胞滤过筛过滤，过滤掉其余杂质。的细胞滤过筛过滤，过滤掉其余杂质。兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型流式细胞检测流式细胞检测 Treg 细胞细胞：泪腺组织流式细胞学检测泪腺组织流式细胞学检测（7）将细胞消化液离心）将细胞消化液离心 2000rpm,6min，离心后弃上清，用，离心后弃上清，用 PBS 缓冲液重悬后再次离心，缓冲液重悬后再次离心，2000rpm,
46、6min，随后在倒置显微镜下观察细胞形态。，随后在倒置显微镜下观察细胞形态。（8）同样在观察细胞形态和纯度的同时进行细胞计数，调整细胞的密度，取各组数量相等的）同样在观察细胞形态和纯度的同时进行细胞计数，调整细胞的密度，取各组数量相等的细胞于流式管中细胞于流式管中,离心离心 2000rpm,6min。（9）弃掉上清，每管加入）弃掉上清，每管加入 600ul 固定液，吹打均匀，固定液，吹打均匀，4C 冰箱避光保存过夜，细胞固定打冰箱避光保存过夜，细胞固定打孔。孔。（10）次日各流式管中加入）次日各流式管中加入 600ul 缓冲液缓冲液,离心离心 1500rpm,lOmin，弃上清，重复再洗一遍。
47、，弃上清，重复再洗一遍。（11）弃上清）弃上清,每孔加入每孔加入 50ul 缓冲液缓冲液,FITC-anti Rabbit-CD4,PE-antihmnan-F0XP3各加入各加入 1ul 进行染色，涡旋后，避光放入进行染色，涡旋后，避光放入 4C 冰箱。冰箱。（13）弃上清加入）弃上清加入 600ul 缓冲液，离心缓冲液，离心 1500rpm,lOmin，弃上清加入缓冲液，弃上清加入缓冲液1500rpm,lOmin 再次离心后。再次离心后。（14）弃掉上清，用）弃掉上清，用 lOOul 缓冲液重悬，涡旋后上美国缓冲液重悬，涡旋后上美国 BD 公司公司 FACS 流式细胞仪上机检测。流式细胞仪
48、上机检测。兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干眼模型流式细胞检测流式细胞检测 Treg 细胞细胞：脾脏组织流式细胞学检测脾脏组织流式细胞学检测（1）陆眠宁和氯胺酮将兔子麻醉后，空气栓塞处死兔子。腹部备皮）陆眠宁和氯胺酮将兔子麻醉后，空气栓塞处死兔子。腹部备皮,并用清洁消毒铺巾。在超并用清洁消毒铺巾。在超净台中用手术刀打开腹腔，找到胃，并向后翻，找到脾脏组织并分离，先置于有双抗的净台中用手术刀打开腹腔，找到胃，并向后翻，找到脾脏组织并分离，先置于有双抗的 RPMI-1640 培养基的培养基的 50ml 离心管中。离心管中。（2）进入细胞超净台，提前准备好）进入细胞超净台，提前准备好 lOOmm 细
49、胞培养皿，将取出的脾脏和少量的细胞培养皿，将取出的脾脏和少量的 RPMI-1640 培养基一起放入培养皿中培养基一起放入培养皿中,用用 400 目的滤网碾磨。研磨完全。目的滤网碾磨。研磨完全。（3）先用培养基将固定好的棉花柱）先用培养基将固定好的棉花柱(20ml)浸润湿，将吹打均匀的组织悬液过棉花柱，过滤到浸润湿，将吹打均匀的组织悬液过棉花柱，过滤到棉花柱正下方的棉花柱正下方的 50ml 离心管中离心管中,离心离心,2000rpm,8min。（4）弃上清，用）弃上清，用 20ml 培养基重悬细胞培养基重悬细胞,吹打均匀后缓缓将细胞悬液加入到等体积的吹打均匀后缓缓将细胞悬液加入到等体积的 20m
50、l Ficoll 液面上液面上,离心离心 2000rpm,20min，上下加速度为，上下加速度为 0。（5）离心后离心管中分三层，同分离外周血淋巴细胞，吸取中间层白色雾状的淋巴细胞，离）离心后离心管中分三层，同分离外周血淋巴细胞，吸取中间层白色雾状的淋巴细胞，离心心 2000rpm,8min，弃上清再洗一遍。，弃上清再洗一遍。（6）倒置显微镜下观察细胞形态和纯度的同时进行细胞计数，调整细胞的密度，取各组数量）倒置显微镜下观察细胞形态和纯度的同时进行细胞计数，调整细胞的密度，取各组数量相等的细胞于流式管中相等的细胞于流式管中,离心离心 2000rpm,6min。兔自身免疫性干眼模型兔自身免疫性干
