1、抗真菌药敏试验及结果判读抗真菌药敏试验及结果判读主讲人：刘伟北京大学第一医院皮肤性病科真菌室国家皮肤与免疫疾病临床研究中心北京大学真菌和真菌病研究中心 北京大学第一医院 教授、博士生导师 皮肤病分子诊断北京市重点实验室副主任 教育部新世纪优秀人才XXX主任医师/副主任医师/主治医师刘伟刘伟主任医师主任医师01020403目目录录05抗真菌药敏试验及意义抗真菌药敏试验及意义纸片扩散法纸片扩散法E-test法法液基稀释法液基稀释法临床意义临床意义抗真菌药敏试验及意义抗真菌药敏试验及意义01抗真菌药敏试验及意义抗真菌药敏试验及意义 定义 是测定抗真菌药物对病原真菌的最低抑菌浓度（MIC）-可抑制病原
2、真菌生长的最低药物浓度，和最低杀菌浓度（MFC）-可杀死真菌的最低药物浓度，及最低有效浓度（MEC）-出现有效抑制作用的最低药物浓度，的体外试验方法 意义监测临床病原真菌对不同抗真菌药物的体外敏感性，对于已有药物指导临床用药的选择，发现新型耐药株评价新型抗真菌药物的体外抗菌活性，开发新药 种类纸片扩散法、E-test法、液剂稀释法抗真菌药物抗真菌药物分类及作用机制分类及作用机制作用靶点为麦角固醇作用靶点为麦角固醇(细胞膜)多烯类多烯类-Drug-ergosterol interactionAmphotericin B,nystatin唑类唑类-Inhibition of ergosterols
3、ynthesisImidazoles:Triazoles:丙烯胺类丙烯胺类-Inhibition of ergosterolsynthesisTerbinafine,butenafine吗啉类吗啉类-Inhibition of ergosterolsynthesis作用靶点为细胞壁作用靶点为细胞壁棘白菌素类棘白菌素类-抑制匍聚糖合成抑制匍聚糖合成Echinocandins肽肽-核苷类核苷类抑制几丁质合成抑制几丁质合成Nikkomycin Z嘧啶类嘧啶类干扰核酸合成干扰核酸合成Flucytosine其它类其它类Sordarins,azasordarinsGriseofulvinAmorolfin
4、eCanuto et al.The Lancet Infect Dis 2002;2:550纸片扩散法纸片扩散法02纸片扩散法纸片扩散法 临床实验室标准研究所（Clinical laboratory standard institute，CLSI）M44-A Tested Drug：FLC，VRC Media：Mueller-Hinton agar+2%dextrose+0.5ug/ml methylene blue Quality control：C.albicans ATCC 90028，C.parapsilosis ATCC 22019，C.tropicalis ATCC 750，C.k
5、rusei ATCC 6258 质控以ATCC 22019为例FLC：25ug，22-23mmVRC:1ug，28-37mm纸片扩散法纸片扩散法 临床实验室标准研究所（Clinical laboratory standard institute，CLSI）M44-A 操作用无菌生理盐水制备菌悬液，调整菌悬液浓度（1-5106CFU/mL）后用棉签沾取菌液，均匀沿3个方向涂布；室温下放置15分钟待干燥后将药片紧密压在培养基上，于35下孵育18-24小时，测量抑菌圈直径，据以确定药敏 结果（mm）和判读折点SusS-DDResVRC=1714-16=19 15-18=14E-test法法03E-t
6、est法法 是将不同量的抗真菌药物包被在商品化的特殊试剂条上进行测定的方法 Tested Drug：FLC，ITC，VRC，CAS，AMB等 Media：PMI 1640+MOPS+2%glucose+1.5%Bacto琼脂 Quality controlE-test法法 操作用无菌生理盐水覆盖生长良好的菌落后，吸取菌悬液，调整菌悬液浓度，用无菌棉签沾取菌悬液，均匀沿3个方向涂布于平板上，将琼脂板在生物安全柜中室温放置15分钟，待其表面干燥；用无菌镊子将真菌药敏条置于平皿上，不再移动；然后置于35下孵育，其中念珠菌孵育24-48小时、新生隐球菌48-72小时、曲霉及根霉18-24小时、镰刀菌2
7、4-48小时后移至室温24-48小时；每天检查抑菌圈，读取结果液基稀释法液基稀释法04液基稀释法液基稀释法 临床实验室标准研究所（Clinical laboratory standard institute，CLSI）方案 国内于1994年及时引进并推广应用，对于酵母菌的M27-P，T，A，A2方案，分为试管法和微量法，以后者为主 对于丝状菌，2002年问世，试管法和微量法，后者为主 Medium，inoculation，incubation，终点判读均统一规定 质量控制：C.albicans ATCC 90028、C.parapsilosis ATCC 22019、C.tropicalisA
8、TCC 750、C.krusei ATCC 6258等意义：保证操作方法尽可能标准化液基稀释法液基稀释法操作操作 药液制备 培养基：RPMI 1640 液基（含MOPS，pH7.0）水溶性药物：如FLC，蒸馏水制备储存液先称量，制备20倍于最高药敏试验浓度的药液（如1280）；然后以RPMI1640稀释，分别获得10倍于各个浓度的药液（640），进一步以RPMI1640分别稀释5倍后，接种于药敏板 非水溶性药物：如ITC等，DMSO制备储存液，浓度不超过1%先称量，制备100倍于最高药敏试验浓度的药液（如1600）；然后以DMSO稀释，分别获得100倍于各个浓度的药液（800，400），进一步
9、以RPMI1640分别稀释50倍后，接种于药敏板液基稀释法液基稀释法操作操作 菌悬液制备 酵母菌：35度，PDA或SDA孵育24-48h丝状菌：曲霉，波氏，孢子丝菌等，35度，PDA孵育7天；镰刀菌，35度，PDA孵育48-72h,继续在25度孵育7天-以保证菌的纯度和活力 以生理盐水制备悬液，到0.5McFarland或计数到1-5X106CFU/ml;进一步稀释100倍（丝状菌，0.5-2.5X104CFU/ml）或1000倍（酵母菌，0.5-2.5X103CFU/ml）液基稀释法液基稀释法结果结果 MIC:与生长对照管比较，生长受抑管的最低药物浓度即为MIC值 不同的药物有不同的判读标准
10、-AmB:典型，容易判断，100%受抑为标准-Azoles and 5-FC:终点常不清楚，以50%（M27-A2），或100%（M38-A中ITC）受抑为标准 MFC：Minimal fungalcidal concentration MEC：minimal effective concentration 对照：生长对照：不生长对照：MIC（g/ml）敏感S剂量依赖性敏感SDD中介I耐药RFLC=8ITC*=1VRC=1CAS=1MCFG=1ANDFG=1液基稀释法液基稀释法结果判读折点结果判读折点 白念珠菌,热带念珠菌及近平滑念珠菌(24h)近平滑念珠菌的棘白菌素类药物判读折点:=8 re
11、sistant液基稀释法液基稀释法念珠菌临床判读折点（念珠菌临床判读折点（24h）AntifungalagentsSpeciesMIC Range(g/mL)SSDD/IRFLCVRCCASMCFGANFGC.albicans/C.parapsilosis/C.tropicalisC.glabrataC.albicans/C.parapsilosis/C.tropicalisC.kruseiC.albicans/C.tropicalis/C.kruseiC.glabrataC.parapsilosi/C.guilliermondiiC.albicans/C.tropicalis/C.kruse
12、iC.glabrataC.parapsilosi/C.guilliermondiiC.albicans/C.tropicalis/C.kruseiC.glabrataC.parapsilosi/C.guilliermondii20.120.50.250.1220.250.0620.250.1224320.25-0.510.50.2540.50.1240.50.2548641210.5810.25810.58液基稀释法液基稀释法CLSI流行病学折点（曲霉，流行病学折点（曲霉，48h）AntifungalagentsItraconazoleVoriconazlePosaconazoleAmphot
13、ericin BCaspofunginSpeciesA.fumigatus/A.flavus/A.terreus/A.nidulansA.niger/A.versicolorA.fumigatus/A.flavus/A.terreusA.niger/A.nidulans/A.versicolorA.fumigatus/A.terreus/A.nigerA.flavusA.nidulans/A.versicolorA.fumigatus/A.flavus/A.niger/A.versicolorA.nidulans/A.terreusA.fumigatus/A.nidulansA.flavus/
14、A.niger/A.terreus/A.versicolorECV(g/mL)12120.50.251240.50.25试验方法试验方法检测菌种检测菌种肉汤稀释法(Microbroth/Microtiter)M27-A3酵母菌M38-A2霉菌纸片扩散法(DiskDiffusion)M44-A酵母菌M51-P霉菌试验方法试验方法检测菌种检测菌种肉汤稀释法(Microbroth/Microtiter)E.DEF7.2酵母菌E.DEF9.1霉菌EUCAST法法 临床实验室标准研究所（European Commission on Antimicrobial SusceptibilityTesting，
15、EUCAST）方案EUCAST对CLSI法进行修订，形成了自己的标准方法EUCAST 的区别：接种浓度是CLSI的100倍；RPMI悬液包含葡萄糖浓度为2%，是CLSI的10倍；培育时间是24小时，而CLSI是48小时在一项比较性研究中，从血流分离100株念珠菌,两种方法显示出良好的一致性药物MIC(g/mL)SIR伊曲康唑222伏立康唑222泊沙康唑0.250.250.25液基稀释法液基稀释法EUCAST法折点（曲霉，法折点（曲霉，24h）烟曲霉、黄曲霉、土曲霉和构巢曲霉多唑类药物耐药泛唑类药物耐药特定唑类药物耐药对临床的意义对临床的意义05Correlation of antifungal
16、 susceptibilitywith clinical outcome（一致性）CLSI M27-AFLC对600余株念珠菌MIC值：分离自150余例AIDS的食管念珠菌病，一致性好；治疗失败者，MIC值大于64 g/mlMahmoud A.G,JCM 1996,34:489-495Keep in mind 90-60 ruleMIC vs clinical outcome 临床疗效susceptible：90%response to therapy对治疗有效resistant：60%response to therapy对治疗有效Rex J,CID 2002,35:982Applicati
17、on of antifungal susceptibilitysuggestions疾病孤立的粘膜念珠菌病复发的粘膜念珠菌病高危患者中念珠菌定植应该经验性治疗念珠菌血症及深部感染深部感染需要延长治疗时建议经验性治疗，不做药敏菌种鉴定，如果治疗失败应该考虑到药敏菌种鉴定，建立当地药敏试验流行病学资料菌种鉴定，应用唑类药物时应该考虑药敏试验，并定期掌握当地药敏试验流行病学资料对所有菌株都测药敏Hopenthal et al,Diagn Microb Infect Dis,2004,48:153-160女性，10岁，急淋，在化疗过程中出现高热；给予头孢匹胺等抗细菌、氟康唑预防真菌感染处理；肺部CT检
18、示：肺内结节灶；痰镜检示：分支分隔菌丝，培养为烟曲霉，改用VRC；9天后，体温38.1，咳嗽减轻；继续治疗一周后复查CT见肺脏病变减轻不明显，故而给予AMB，20mg/d，一周后无发热、咳嗽，肺内病变未扩大；继续治疗一周后无明显症状，CT示肺内结节局限，故停用AMB而出院Sample IDICZVCZPCZCYP51AMAT微卫星CSP4787-11681TR34/L98H114-21-8-31-8-6-8-10-20t024787-21621297T/F495ITR34/L98H/S 223-23-8-29-8-6-8-10-20t02耐三唑类的烟曲霉混合感染耐三唑类的烟曲霉混合感染检测到耐药菌株应该更换抗真菌药物治疗感谢聆听感谢聆听
