1、授课教师：王 茜,电话：86110138 E-mail : wangqiandl73,细胞生物学教研室,学习目的和要求 1. 掌握原核细胞与真核细胞的异同。 2. 熟悉原核细胞和真核细胞的结构和功能特点 核酸、蛋白质分子的种类和生物学功能。 细胞的化学与分子组成；核酸、蛋白质的分子 结构特点 3.了解生命的分子起源、细胞的形成和进化；核酶和非编码调节性RNA 。,第二章 细胞的概念与分子基础,第一节 细胞的基本概念,一、细胞是生命活动的基本单位 二、原核细胞 三、真核细胞 四、非细胞生命形态病毒,一、细胞是生命活动的基本单位 细胞是构成有机体的基本单位； 细胞具有独立完整的代谢体系，是代谢与功
2、能的基本单位； 细胞是有机体生长与发育的基础； 细胞是遗传的基本单位，具有遗传的全能性； 没有细胞就没有完整的生命。,细胞的分类,细胞分为三大类型,原核细胞 古核细胞 真核细胞,早期细胞分为两大类,原核细胞（prokaryotic cell） 真核细胞（eukaryotic cell）,1990年，生物界被划分为三个域,细菌域（bacteria） 古菌域（archaea） 真核域（eukarya）,Cell and Molecular Basis,生物三域分类的系统树,Cell and Molecular Basis,特点： 1. 结构简单 环状裸露的DNA分子，无膜包裹，形成拟核(nucle
3、oid) 细胞质中无膜性细胞器，含有核糖体。 2. 体积小 直径约为1到数个微米。,二、原核细胞,主要代表： 支原体、衣原体、细菌、蓝藻又称蓝细菌,（一）支原体（mycoplasma） 最小最简单的细胞。 大 小：通常为0.10.3m。 细胞膜：由磷脂和蛋白质构成，没有细胞壁。 DNA：呈环形双链，胞质内分散存在，指导约400种蛋 白合成。,肺炎支原体,（二）细菌（bacteria） 原核细胞的典型代表 细胞壁：位于细菌外表面，主要成分为肽聚糖。 细胞膜：由脂质和蛋白质组成，有时可内陷形成中间体 细胞质： DNA：环状分子，很少有重复序列，无内含子。 质粒（plasmid）：能够独立于基因组D
4、NA以外，自我复制的环状结构。,有的细菌还有夹膜、鞭毛、菌毛等特殊结构。,核糖体：大部分游离于细胞质中，小部分附着在细胞膜内表面。,Cell and Molecular Basis,细菌结构示意图,（三）古细菌（archaebacteria） 一类很特殊的细菌，多生活在极端环境中，如高温、高盐环境。,特点： 具有原核生物的某些特征：无核膜及内膜系统。 具有真核生物的特征：RNA聚合酶和真核细胞的相似、DNA具有内含子并结合组蛋白等。 具有不同于原核细胞和真核细胞的特征：细胞膜中的脂类不可皂化，细胞壁不含肽聚糖。,(一)真核细胞的形态大小,三、真核细胞,形态：多种多样，常与细胞所处的部位及功能相
5、关。 大小：差异很大，与细胞类型有关 。,Cell and Molecular Basis,(二)真核细胞的基本结构 光镜下结构：细胞膜（cell membrane） 细胞质（cytoplasm） 细胞核（nucleus） 电子显微镜下，在细胞质中可以看到由单位膜组成的膜性细胞器以及微丝、微管、中间纤维等骨架系统。,动物细胞结构模式图,动物细胞,植物细胞,真核细胞 特点：结构复杂、形态结构各异,特征 原核细胞 真核细胞,核膜/核仁 无 有 重要细胞器 无（仅有核糖体70S） 有 细胞骨架 无 有 DNA量（信息量） 少 大 DNA分子结构 环状 线状 染色质或染色体 仅一条DNA ，且裸 有2
6、个以上DNA分 露，不与组蛋白结合， 子，与组蛋白和部 但可与少量类组蛋白结合 分酸性蛋白结合 基因结构特点 无内含子 有内含子 无大量的重复序列 有大量重复序列 转录与翻译 同时进行（胞质内） 核内转录，胞质内翻译 加工修饰 无 有,四、病毒,生物界中，病毒（virus）是惟一的非细胞形态的生命体。 特点： 在活细胞内才能表现出它们的基本生命活动。 在电子显微镜下才能看到。 结构： 核酸分子与蛋白质组成的核酸-蛋白质复合体。,分类：根据病毒的核酸类型可以将其分为两大类： DNA病毒； RNA病毒。 类病毒（viroid）：仅由感染性的RNA构成。 朊病毒（prion） ：仅由感染性的蛋白质亚
7、基构成。,病毒的分子结构,Cell and Molecular Basis,第二节 细胞的分子基础（自学） 第三节 细胞的起源与进化（自学）,archaebacteria bacteria cell membrane cytoplasm Cytosol eukaryotic cell mycoplasma nucleoid nucleus Prion prokaryotic cell protoplasm ribosome virus,中英文关键词对照,古细菌 细菌 细胞膜 细胞质 细胞质溶胶 真核细胞 支原体 拟核 细胞核 朊病毒 原核细胞 原生质 核糖体 病毒,Cell and Molec
8、ular Basis,Summary of Chapter Two a. Four major elements in the cells,A living cell is composed of a restricted set of elements, the four major ones (CHON) make up 90% of its weight. Among the weights， water accounts for about 70%，in which most intracellular reactions occur because of its special pr
9、operties： polar character，ability to form hydrogen bond and its high surface tension.,Section One,b. Cell chemistry is based on carbon compounds Disregarding water, nearly all of the molecules in a cell are carbon compounds. Carbon is able to form large molecules by forming four strong covalent bond
10、s（共价键） with other atoms and joining to other carbon atoms to form chains and rings. By these ways, large and numerous complex molecules such as DNA, RNA and proteins with no obvious upper limit to their size can be generated.,c. Small and large organic molecules The carbon compounds with molecular w
11、eights in the range 100-1000 and contain up to 30 carbon atoms are called Small Organic Molecules. Cells have four major families of small organic molecules: sugars, fatty acids, amino acids and nucleotides. They are free in cytoplasm where some of them are assembled to large polymers, called macrom
12、olecules with molecular weights between 10K to 100K (Kilo, thousand).,d. Transportation of genetic message depends upon gene transcription and translation. Genes are invisible genetic information-containing elements in DNA. In a gene, there are coding sequences called exons that are interrupted by n
13、oncoding sequences called introns. Portions of gene sequence are copied / transcripted into RNA to make protein. After removing introns, Sequences of nucleotides in mRNA are read in sets of three and translated into amino acids . The triplet of nucleotides that specifies one amino acid is called cod
14、on, while most amino acids are specified by several codons.,e. The importance of protein synthesis Proteins constitute more than half of the total dry mass of a cell. Their synthesis is central to cell maintenance, growth and development. Protein synthesis depends upon the collaboration of several c
15、lasses of RNA molecules (t, m and rRNAs),a. Different triplets of nucleotides encode specific amino acids. The codes and the types of amino acids they encode are virtually the same in all living organisms. This evidence strongly suggests that all present-day living things have descended from a singl
16、e line of primitive cells.,Section Two,b.One of the crucial events leading to the formation of the first cell must have been the development of an out membrane. However, there is a fundamental difference between the primitive cells and any other present-day living cells: the hereditary information i
17、n all cells alive today is stored in DNA rather than the RNA that is thought to have stored the information in primitive cells. RNA molecules are still here in present-day cells, but they just carry/transfer genetic message.,c. Precedent conditions for procaryote formation: formation of defined memb
18、rane; genetic information encoded by DNA RNA-directed protein synthesis and organelle/ribosome assembled proteins. Critical differences between procaryotic and eucaryotic cells should be well remembered.,d. Multicellular organisms can be formed when Single cells are associated with each other to for
19、m colonies; Cohesions occur between cells and between cells and extracellular matrix; Cell differentiation. specialization takes place to exhibit more than 200 distinct cell types such as nerve, muscle and connective tissue cells as well as a large number of their subtly different varieties.,第三章 细胞生
20、物学的研究 方法和策略,第一节 显微成像技术,显微镜的发明打开了微观世界的大门,光学显微镜,透射电子显微镜,扫描电子显微镜,光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。 电子显微镜：以电子束为光源。,在光学显微镜中，照明系统是可见光，使用的是玻璃透镜系统，可直接通过目镜观察镜像。 在电子显微镜中，照明系统为电子束，使用电磁透镜，通过荧光屏观察样品的镜像。,一、光学显微镜,分辨率(resolution)显微镜或人眼在25cm的明视距离处，能分辨被检物体微细结构最小间隔的能力。,R=0.61/sin,其中为入射光线波长； n=介质折射率； =样品对物镜镜口张角的半角,人眼分辨率为0.07 0.1mm，
21、 光镜分辨率为0.2m 最大放大倍数人眼/光镜分辨率,不同显微结构的尺寸,由左至右依次为动物细胞、细菌、线粒体、流感病毒、核糖体、绿色荧光蛋白、胸腺嘧啶。虚线为光学显微镜分辨极限。,线粒体是普通光学显微镜通常能观察到的细胞内最小结构,标本处理：常规固定、包埋、切片、染色,比较高级的显微镜上都设有倾斜式的双目镜筒。在物镜转换器上方装有四个棱镜，使经过物镜的光线平分为两路到达目镜，故双筒显微镜的亮度要比单筒者为暗。双筒显微镜的优点为同时用两眼观察，有较强的立体感。,1、普通光学显微镜,组 织 细 胞,2、荧光显微镜 （Fluorescence microscope）,特点：光源为紫外线，波长较短，
22、分辨力高于普通显微镜。,荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色） 图片来自http:/www.itg.uiuc.edu,Fluorescence image of epithelial cell, DNA in blue and Microtubules in green,成像反差强，检测灵敏度高。 用途：定性、定位和定量的研究组织内的荧光标记物质。 对活细胞内分子的动态变化进行实时观察,荧光显微镜 （大医）（Fluorescent microscope） 仪器型号：BX-51 TR32000 生产厂家:日本Olympus 配置: 物镜:1.25X、10X、 40X、 100X 照明:普
23、通光、荧光及暗视野 荧光滤光片:紫外光WU、蓝光 WB、绿光WG三种广谱滤 光片及WIB窄带通滤光片。,相机:光学相机及Kodak DC290数码相机(2.2M像素) 图象分析处理系统:具有专业数码图象处理系统，可对数码显微图象进行 尺寸、密度等进行分析。,3、倒置（相差）显 微镜 物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，通常具有相差物镜，有的还具有荧光装置。,4.相差显微镜,把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。 用途：观察未经染色的玻片标本.,5、激光共聚焦扫描显微境 （Laser confocal
24、 scanning microscope, LCSM）,单色激光作为光源。 共聚焦：物镜和聚光镜互相共焦点，只有从标本焦面发出的光线聚焦成像，焦面以外的漫射光不参加成像。 逐点、逐行、逐面快速扫描。 分辨力是普通光学显微镜的3倍。,应用：进行连续的光学切片，通过电脑进行三维重建。 显示细胞样品的立体结构。 用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次， 形成立体图像。,共聚焦激光显微镜获得被检物体三维结构的原理及呈现的三维图像,laser confocal scanning microscope, LCSM,LCSM照片，蓝色为细胞核，绿色为微管 图片来自http:/www.itg.uiuc.edu,
25、6、当代显微镜的发展趋势,采用组合方式，集普通光镜加荧光、暗视野、摄影装置于一体。 自动化与电子化。,二、电子显微镜,电子显微镜下的液晶分子,以电子束作光源，波长短。 分辨率 用于观察超微结构（ultrastructure），即小于0.2m、光学显微镜下无法看清的结构，又称亚显微结构（submicroscopic structures）。,1、透射电子显微镜 （transmission electron microscope, TEM）,理论值：0.002nm,实际值：0.1nm,生物样品：2nm,透射电子显微镜,TRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPE，TEM,内质网
26、透射电镜图（伪彩色）,透 射 电 子 显 微 镜（大医） 仪器型号:JEM-2000EX 生产厂家:日本电子公司 仪器性能:放大倍数100万倍 分辨率1.43埃 加速电压200kV 仪器应用：透射电子显微镜能够观 察生物体的亚细胞结 构、细菌、病毒、噬菌 体等微小有机体。,超薄切片机（大医）（Ultra microtome） 仪器型号：EM UC6 生产厂家：Leica 仪器性能：切片厚度 500埃,仪器应用：广泛应用于免疫细胞生物学、医学、高 分子材 料科学等领域，如环氧树脂包埋的植物、动物、 微生物等组织和高分子材料的超薄切片、透射电 镜观察细胞内部结构前的切片制备等。,2、扫描电子显微镜
27、,Scanning electron microscope（SEM）,人类血细胞SEM照片,人类血细胞SEM照片,光学显微镜、TEM、SEM成像原理比较,3、制样技术,电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本需制成厚度仅50nm的超薄切片，用超薄切片机制作。 通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。,第二节 细胞及其组分的分离和纯化技术 一从组织中分离不同类型细胞 1.制备单细胞悬液：机械方法 蛋白水解酶 EDTA 2 .分离不同类型的细胞：离心 FCM 3 .生化分析或细胞培养,1. 差速离心 Differential cen
28、trifugation,特点： 介质密度均一 速度由低向高逐级离心 用途：分离体积、大小相差悬殊的细胞和细胞器。 沉降顺序：核 线粒体 溶酶体与过氧化物酶体 内质网与高基体 核蛋白体（核糖体） （可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心 再行分离纯化）,（一）离心分离技术,差速离心(differential centrifugation),低速：1000g,10min,中速：20000g,20min,高速：80000g,60min,超速：150000g,180min,不同的细胞器、大分子和病毒的 密度及相应的沉降系数,2. 移动区带离心（moving-zone centrifugation
29、）,加入蔗糖或盐(氯化铯)，由顶部到底部逐渐增加密度,形成密度梯度(5-20%)，再将细胞匀浆加在最上层离心不同大小的颗粒以不同的速度沉降，分别在不同的区带集中，相互分离各沉降带分别收集。不同组分的沉降速度通常以沉降系数（sedimentation coefficient ）即S表示。蛋白质和核酸的沉降系数在1-200之间。,用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。 特点：介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗 粒的最小密度。 原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速 度沉降而达到分离。 每个单一组份的沉降速率取决于它们的形状、尺寸、密度、 离心力的大小、梯度液的密
30、度和粘性系数。 离心时间不宜太长，在最大颗粒尚未到达管底前停止离心,移动区带离心,用途： 分离密度不等的颗粒 特点： 欲分离的颗粒密度处于离心介质密度范围内。 介质有：氯化铯、硫酸铯、溴化铯、三碘苯衍生物等。 原理： 样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离 心上升或沉降到与自身密度相等的介质处，并停留 在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。,3. 等密度离心（isodensity centrifugation ）,(二)免疫磁珠法,利用带有特定单抗的免疫磁珠（immunomagnetic microsphere）与靶细胞的特异结合，快速地从多细胞悬液中将目的细胞分离出来。,Techn
31、ology for Cell Biology,分离纯度：9599,（三）流式细胞术( flowcytometer, FCM ) 从多细胞悬液中分离目的细胞的精密仪器 应用免疫细胞化学原理，用荧光特异性抗体与相应抗原结合的方式，标定欲分离的细胞（或细胞器），再通过自动化的激光/光电检测系统高速检测移动中的细胞悬液荧光，从混合的细胞群体中分离出特定的目标细胞。 样品处理：用带荧光的特异抗体标记待分离的细胞 分离速度：2万个细胞/s 分离纯度：95%,用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选,原理：细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器
32、检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。所用仪器称为流式细胞仪（flow cytometer）。,Beckman FC500 流式细胞仪分析结果,(四)激光俘获显微切割技术（Laser Capture Microdissection，LCM） 原理：在载玻片上制作冰冻或石蜡切片并染色，通过直接的显微镜观察，用能量较低的红外激光切割而获得所需要的组织细胞，甚至单个细胞。 应用：从组织切片中精确地分离一个单一的细胞,Technology for Cell Biology,Technology for Cell Biology,二
33、、细胞组分的分离纯化（自学）,1. 离心分离细胞组分和生物大分子 2. DNA的获得 3. RNA的提取 4. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 5. 层析技术,第三节 细胞体外培养技术,1.细胞培养( cell culture ) 是指从活体组织分离出特定的细胞，并在模拟体内生理环境的体外条件下进行培养，使之能够继续生存、生长以至增殖的一种方法。 2.原代培养( primary culture) 3.传代培养( secondary culture) 4.细胞系( cell line ),细胞培养基本条件 洁净环境 （无菌、无毒） 适宜的温度（37） 、CO2浓度（5%） 适宜的pH 营 养、培养基
34、（天然、合成：DMEM、RPMI1640 、TC199） 促细胞生长物质 ( 血清、生长因子、生长素、激素),细胞培养相关设备,细胞培养过程 取材 酶消化、制备细胞悬液 接种培养 传代、冻存,Plant Cell Culture,Animal Cell Culture,常用细胞库 CCTCC-中国典型培养物保藏中心 （http:/www.cctcc.org） CTCCCAS-中国科学院典型培养物保藏委员会 （ http:/www.ctcccas.ac/typecc/xibao) American Type Culture Collection (ATCC)美国细胞、菌种保藏中心 (http:/
35、www.atcc.org/ ),6.细胞融合(cell fusion),通过培养和诱导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cell fusion）。,有性繁殖时发生的精卵结合是正常的细胞融合，即由两个配子融合形成一个新的二倍体。,同核体：相同基因型的细胞融合而成。 异核体：不同基因型的细胞融合而成。 自发融合 诱发融合 诱导细胞融合的方法： 生物方法（仙台病毒、副流感病毒等 ） 化学方法（聚乙二醇PEG） 物理方法（电击和激光）。 应 用 * 基因定位 * 细胞学研究 * 单克隆抗体,单克隆抗体技术 正常淋巴细胞（如小鼠脾细胞）具有分泌抗体的能力，但不能长期培养，瘤细胞
36、（如骨髓瘤）可以在体外长期培养，但不分泌抗体。于是英国人Kohler和Milstein 1975将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔奖。,第四节 细胞化学和细胞内分子示踪技术,细胞化学技术（cytochemistry）：是在保持组织原位结构的情况下，研究细胞内活性大分子的分布、数量及动态变化的技术，是细胞形态观察和组分分析相结合形成的一种方法。,一 酶细胞化学技术(enzyme cytochemistry) 原理：细胞内分布着很多酶且各有其特定部位, 通过酶的 特异细胞化学反应，显示酶在细胞内的分布位置和 活性强弱。 捕获反应包括：金属盐沉淀法、色素沉淀法和嗜锇物质生成法,
37、+,酶促化学反应,捕获反应,二.免疫细胞化学技术(immunocytochemistry),抗原抗体复合物,敏感性、特异性、已知的、标记的抗体检测细胞中的抗原,抗原抗体复合物,方法： 包埋法：包埋介质 冷冻超薄切片法：新鲜组织,直接法：,间接法：,三、原位杂交技术（in situ hybridization，ISH） 使用标记的DNA或RNA探针，通过分子杂交检测原位组织和细胞中的特异性核酸分子的方法。,原位杂交技术与原理,四、放射自显影技术,放射性自显影技术(autoradiography)：用放射性同位素标记生物样品中的大分子或其前体物质，然后通过乳胶感光(卤化银还原成为银原子)，以及显影
38、和定影等过程，在显微和亚显微结构水平显示出被标记物在组织和细胞内的位置、数量及其变化。,常用放射性同位素：14C、3H、35S、32P 。 3H-亮氨酸和35S-蛋氨酸蛋白质。 3H-岩藻糖和3H-甘露醇糖类。 3H-胸腺嘧啶脱氧核苷、3H-胸苷或3H-尿苷核酸。,放射性同位素（radioisotope）：可衰变释放出、或射线而被检测。,操作步骤： 放射性化合物掺入活细胞 ； 不同时间取样制备切片； 暗盒中曝光； 显影和定影。 应用：对生物样品中放射性同位素标记的某种分子 进行定性或定量检测。,胰岛B细胞电镜放射自显影结果 3H-亮氨酸脉冲标记完成10分钟后，被标记的胰岛素蛋白（黑色银颗粒）从
39、粗面内质网进入高尔基复合体中； B. 3H-亮氨酸脉冲标记完成45分钟后，被标记的胰岛素蛋白进入分泌颗粒内。,绿色荧光蛋白,绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）：含有238个氨基酸残基，在蓝色光源(450490nm)的激发下，发射出绿色荧光(520nm)。 应用：显示特定蛋白在细胞内的定位。 构建融合基因表达载体。 转染细胞。 荧光显微镜下观察。,五、活细胞内分子示踪,辅酶II依赖性视黄醇脱氢-还原酶选择性剪接体亚型（NRDRB1）在Hela细胞中的定位。(汕头大学黄东阳提供),第五节 细胞功能基因组学技术（自学）,1. PCR技术 2. Southern
40、印迹技术 3. Northern印迹技术 4. 基因芯片 5. RNA干扰,第六节 细胞生物学研究的一般策略和工具的使用 （自学）,Summary of Chapter Three The principal aims of cell biology methods are: To examine the cells as a whole To analyze the constituent macromolecules To culture identical cell types outside the body and to study them comprehensively by m
41、ultiple experimental approaches Methodological improvement and development for cell biology investigation are progressing with time. However, there are some classical methods that can help us to fulfill the above purposes. They are:,Microscopic techniques: including light and electronic ones; Cytoch
42、emical techniques: including enzyme and immune cytochemistry. The principles of these two methods should be well understood.,Auto radiography: label cellular component, e.g. dNTP or a probe or antibody with radioactive isotopes (hot) or fluorescence materials (cold); integrate the labeled component
43、to the nucleic acid or protein in the cells randomly or specifically; and finally to evaluate their intracellular amount and distribution by checking the signals in the radiosensitive emulsion onto the cells.,Flowcytometry: A multi-functional and high throughput technique that can check the biochemi
44、cal and biophysical features and compositions of the cells, and fractionate the cells with different properties from a mixed population. Detailed usefulness of this method should be clearly known.,Cell Culture In comparison with microscopic techniques, the main advantages of cell culture are: a. bio
45、chemical molecules/message can be well kept b. Studies are performed on an individual cell system c. Multiple analyses can be done using proliferating cells,Basic Concept s of cell culture In vitro: indicates the experiments performed on cultured cell system In vivo: indicate s the experiments perfo
46、rmed on intact organisms Primary culture: culture is prepared directly from the tissue with or without an initial cell fractionation step. Cell clone: isolating a single cell and allowing it to proliferate to form a large colony. Cell line: immortalized cells with indefinite life span in a suitable nutrient medium.,原代培养是指直接从机体分离取得细胞、组织和器官后在体外进行的首次培养。一般过程如图所示。,返回,传代培养：是指将培养的细胞从原培养瓶中加以分离，以1：2以上的比例稀释后再接种于新的培养瓶中进行的扩大培养。 细胞系:从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，可无限繁殖、传代。,返回,
