1、双层平板法观察噬菌蛭弧菌双层平板法观察噬菌蛭弧菌斑实验斑实验实验 十 一、蛭弧菌简介 蛭弧菌蛭弧菌(Bdellovibrio)(Bdellovibrio)是寄生于其他细菌是寄生于其他细菌并能导致其裂解的一类并能导致其裂解的一类细菌细菌。它虽然比通。它虽然比通常的细菌小，能通过细菌滤器，有类似噬常的细菌小，能通过细菌滤器，有类似噬菌体的作用，但它不是病毒，是一类能菌体的作用，但它不是病毒，是一类能 吃吃掉掉 细菌的细菌。细菌的细菌。1962 1962年首次发现于菜豆叶烧病假单胞菌年首次发现于菜豆叶烧病假单胞菌体中，随后从土壤、污水中都分离到了这体中，随后从土壤、污水中都分离到了这种细菌。种细菌。
2、特征蛭弧菌属于蛭弧菌科。具有细蛭弧菌属于蛭弧菌科。具有细菌的一切形态特征：菌的一切形态特征：单细胞单细胞，弧形弧形或逗点状，有时或逗点状，有时呈螺旋状呈螺旋状0.3-0.60.3-0.60.8-1.20.8-1.2微米，或仅为杆微米，或仅为杆菌长度的菌长度的1/3-1/41/3-1/4端生端生鞭毛鞭毛，比其他细菌的，比其他细菌的鞭毛鞭毛粗粗3-43-4倍，运动活跃倍，运动活跃革兰氏染色阴性。革兰氏染色阴性。细胞中蛋白质含量较高，有的细胞中蛋白质含量较高，有的占干重的占干重的60-70%60-70%。DNADNA含量含量5%5%，GCGC百分数为百分数为42-51%42-51%。生活方式有寄生型
3、，也有兼性寄生，极少数营腐生。非寄有寄生型，也有兼性寄生，极少数营腐生。非寄生型营腐生生活，可在生型营腐生生活，可在蛋白胨和酵母提取物培养蛋白胨和酵母提取物培养基基上生长繁殖，绝大多数都丧失了寄生性。上生长繁殖，绝大多数都丧失了寄生性。从自然界分离得到的蛭弧菌都是依赖寄生型，迄从自然界分离得到的蛭弧菌都是依赖寄生型，迄今为止，还没有直接从自然界分离得到非寄生型今为止，还没有直接从自然界分离得到非寄生型。不依赖宿主的蛭弧菌，只能生活在实验室条件不依赖宿主的蛭弧菌，只能生活在实验室条件下。下。生长要求寄生型蛭弧菌生长，要求寄生型蛭弧菌生长，要求pH6.0-8.5pH6.0-8.5；温度；温度23-
4、23-3737，低于，低于1212，高于，高于4242时均不生长；能稳时均不生长；能稳定分解蛋白质，一般不利用碳水化合物，而以定分解蛋白质，一般不利用碳水化合物，而以肽、氨基酸作碳源和能源；能液化明胶；严格肽、氨基酸作碳源和能源；能液化明胶；严格好氧。好氧。侵入对象蛭弧菌与宿主细胞之间，常表现出一定的特异性。蛭弧菌与宿主细胞之间，常表现出一定的特异性。不过，有的特异性较差，能侵入多种细菌。例如不不过，有的特异性较差，能侵入多种细菌。例如不同的蛭弧菌菌株，能侵入各类不同的植物病原菌。同的蛭弧菌菌株，能侵入各类不同的植物病原菌。侵入机理周质空间分布和分离广泛存在于自然界，广泛存在于自然界，土壤、河
5、水、附近海洋水域及下水道污水。土壤、河水、附近海洋水域及下水道污水。将蛭弧菌与敏感菌混合倒平板，在适宜条件下培养将蛭弧菌与敏感菌混合倒平板，在适宜条件下培养2-32-3天，平板上天，平板上便会出现类似噬菌体的噬菌斑，并逐渐扩大，宿主细胞完全被溶便会出现类似噬菌体的噬菌斑，并逐渐扩大，宿主细胞完全被溶解而形成透明区。从这些透明区中就可分离到蛭弧菌。利用这一解而形成透明区。从这些透明区中就可分离到蛭弧菌。利用这一特征，还可计算出蛭弧菌噬菌体的数目。同时可追踪增殖过程、特征，还可计算出蛭弧菌噬菌体的数目。同时可追踪增殖过程、寄生潜伏时间、新产生蛭弧菌的数量以及它们的活性等。寄生潜伏时间、新产生蛭弧菌
6、的数量以及它们的活性等。应用价值用于净化水体和清除工、农、医等方面的有害细菌。用于净化水体和清除工、农、医等方面的有害细菌。大量存在于污水中，对大肠杆菌和沙门氏菌属的细菌均有广大量存在于污水中，对大肠杆菌和沙门氏菌属的细菌均有广泛的寄生性，因此，有人以蛭弧菌作为水域污染程度的一项泛的寄生性，因此，有人以蛭弧菌作为水域污染程度的一项最终指标最终指标理论研究：理论研究：宿主细菌宿主细菌-蛭弧菌蛭弧菌-蛭弧菌噬菌体蛭弧菌噬菌体这个这个 三位一体三位一体 的的寄生系统。寄生系统。二、实验目的1.1.了解噬菌蛭弧菌的生物特性了解噬菌蛭弧菌的生物特性2.2.掌握双层平板法分离蛭弧菌技术掌握双层平板法分离蛭
7、弧菌技术 三、实 验 材 料仪器仪器 显微镜，生化培养箱，电子天平，高压灭菌锅，显微镜，生化培养箱，电子天平，高压灭菌锅，电热干燥箱，超净工作台，冰箱，高速离心机，普电热干燥箱，超净工作台，冰箱，高速离心机，普通离心机。通离心机。菌种菌种大肠杆菌（大肠杆菌（Escherichia coli）、噬菌蛭弧菌）、噬菌蛭弧菌（Bdellovibrio bacteriovoru）。）。实验试剂实验试剂 （1 1）牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉粉牛肉粉5g5g（0.5%0.5%）；蛋白胨）；蛋白胨10g10g（1%1%）；琼脂）；琼脂20g20g（2%2%）；蒸馏水）；蒸馏水1000ml100
8、0ml；pH 7.0pH 7.07.27.2 （2 2）双层平板培养基双层平板培养基 下层琼脂培养基：琼脂下层琼脂培养基：琼脂17.5g17.5g（1.75%1.75%）；蒸馏水）；蒸馏水1000ml1000ml 上层上层LBLB培养基：蛋白胨培养基：蛋白胨5g5g（0.5%0.5%）；酵母提取物）；酵母提取物1.5g1.5g（0.15%0.15%）；）；NaCl 2.5gNaCl 2.5g（0.25%0.25%）；琼脂）；琼脂4g4g（0.4%0.4%）；蒸馏水）；蒸馏水1000ml1000ml。大肠杆菌的制备大肠杆菌的制备 将大肠杆菌接种牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，放在将大肠杆菌接种牛肉膏蛋
9、白胨培养基斜面上，放在3737培培养箱里培养养箱里培养24 h24 h后，备用。后，备用。四、实四、实 验验 程程 序序1.1.利用双层平板法分离噬菌蛭弧菌利用双层平板法分离噬菌蛭弧菌2.2.观察噬菌蛭弧菌斑出现及其形态的观察观察噬菌蛭弧菌斑出现及其形态的观察即：通过双层平板法使噬菌蛭弧菌对大肠杆菌的裂解而形成噬菌斑。双层平板法主要优点：五、实验方法及操作1 1、蛭弧菌悬液的制备：挑取蛭弧菌单斑浸泡于蛭弧菌悬液的制备：挑取蛭弧菌单斑浸泡于1.5 mL 1.5 mL 无菌水中，捣碎混匀，无菌水中，捣碎混匀，10000 g10000 g离心离心1 min1 min，得到蛭弧菌，得到蛭弧菌悬液，备用
10、。悬液，备用。2 2、大肠杆菌悬液的制备：取、大肠杆菌悬液的制备：取0.5 mL0.5 mL无菌水在大肠杆菌无菌水在大肠杆菌的斜面上，用接种环钩分散乳化菌苔，制备菌悬液，的斜面上，用接种环钩分散乳化菌苔，制备菌悬液，备用。备用。3 3、倒入融化的琼脂培养基、倒入融化的琼脂培养基20ml20ml于无菌培养皿中，冷于无菌培养皿中，冷却凝固，备用。制作却凝固，备用。制作下层琼脂培养基下层琼脂培养基。4 4、吸取、吸取3.5 mL3.5 mL上层上层LBLB培养基（培养基（5050）中加入）中加入0.2mL0.2mL蛭蛭弧菌液和弧菌液和0.3 mL0.3 mL大肠杆菌菌悬液大肠杆菌菌悬液，混匀后立即倾
11、注于，混匀后立即倾注于下层培养基上，待凝固后置于下层培养基上，待凝固后置于3535培养箱内培养培养箱内培养24h-24h-120 h120 h。试验操作注意事项 1 1、上层、上层LBLB培养基温度必须控制在培养基温度必须控制在5050左右，温度左右，温度过高导致大肠杆菌和蛭弧菌失活。过高导致大肠杆菌和蛭弧菌失活。2 2、加入、加入0.2mL0.2mL蛭弧菌液和蛭弧菌液和0.3 mL0.3 mL大肠杆菌菌悬液时大肠杆菌菌悬液时动作要快，倒入下层培养基上迅速摇匀，避免动作要快，倒入下层培养基上迅速摇匀，避免LBLB培养培养基凝固。基凝固。3 3、一定要等培养基凝固后，在倒置培养。、一定要等培养基凝固后，在倒置培养。六、实验结果 1 1、观察噬菌斑出现及大小、观察噬菌斑出现及大小 2 2、记录噬菌斑个数、记录噬菌斑个数七、思考题1.1.比较双层平板法与单层平板法的特点。比较双层平板法与单层平板法的特点。2.2.噬菌蛭弧菌生长与其他细菌生长有什么不同？噬菌蛭弧菌生长与其他细菌生长有什么不同？3.3.为什么要把上层培养基温度必须控制在为什么要把上层培养基温度必须控制在5050左右？左右？
