1、植物检疫专业核酸检测方法验证程序赵文军植物检疫专业委秘书处2013-6-26 主要内容主要内容 一一.背景背景 二、总则二、总则 三、标准起草实验室验证三、标准起草实验室验证 四、独立实验室验证四、独立实验室验证 五、验证报告格式五、验证报告格式 六、试点验证标准六、试点验证标准第一章第一章 背景背景1 1、植、植物检疫标准制定情况物检疫标准制定情况思想观念的转变，2004年前意识标准淡薄标准从无到有标准的快速发展，分子生物学技术的发展促进了植物检疫的标准化。新的植物检疫名录的颁布促进了标准的快速发展。已发布446项标准质量急需提高，标准的科学性与可操作性第一章 背景2 2、有害生物检测鉴定标
2、准的过程情况、有害生物检测鉴定标准的过程情况课题研究成果转化参考国内外文献验证，本实验室验证国际或区域性标准转化，本实验室验证从文献到标准，主要是形态鉴定方面的。第一章 背景3 3、有害生物检测鉴定标准验证情况、有害生物检测鉴定标准验证情况中国检科院开展了植物病毒标准的验证总局立项课题 上海局主持验证标准制定中本实验室验证部分标准的委托验证大部分标准没有经过足够严谨的独立实验室验证，急需开展验证，提升标准质量，促进标准实施。第一章 背景4、验证方法的选择验证方法的选择植物检疫性有害生物检测鉴定涉及主要方法有形态学：多用于昆虫、杂草、真菌，特点：经验性强；免疫学：病毒、细菌，特点：易标准化，抗体
3、质量对结果影响大；分子生物学：病毒、细菌、真菌、昆虫特点：最常用的为PCR凝胶电泳及实时荧光PCR，易标准化。综合考虑，首先开展核酸类检测分子检测方法进行试点验证。第一章 背景5 5、验证方案的起草过程、验证方案的起草过程2012年底第一稿征求部分专家意见，2013.2月完成第二稿，2013.5月，会议讨论 形成第三稿 征求全部专业委人员意见，小幅修改形成第四稿第二章 总则1、目的目的为提高植物检疫专业核酸检测方法的科学性和适用性，规范验证流程，特制定本程序。2、范围、范围本程序适用于标准制修订过程中核酸检测方法的验证，包括采用现有方法和自主研发的新方法制修订的标准。若所制定的标准为等同采用国
4、际标准，仅采用本实验室验证程序即可，但鼓励标准制修订方进行完整的验证流程。若所制定的标准为修改采用国际标准，且修改了关键性技术，则应进行完整的验证流程。3、组织机构组织机构植物检疫专业委负责本专业有害生物核酸检测方法验证的组织、审核等管理工作。委员会通过下设秘书处承担具体职责，包括审核验证实验室的资质，指定并组织验证实验室开展验证工作，组织专家进行验证材料的审核及验证数据的统计分析等。秘书长：陈乃中 副秘书长：赵文军秘书：段胜男（中国检科院）、卢晓雨（深圳局）、康芬芳（天津局）、黄丽丽（江西局）4、术语与定义术语与定义4.1核酸检测方法验证是确认某一核酸检测方法适用于某一检测对象的过程。4.2
5、 本实验室验证标准制修订实验室在合理的时间间隔内，以方法适用范围内不同样品为对象，对同一方法的验证指标进行确证的过程，初步判断方法可靠性。4.3 独立实验室验证独立于标准制修订方的实验室验证，判定方法的验证指标能否达到预期用途。5、验证程序验证程序第三章 本实验室验证1、验证方案1.1 方法要求待验证的检测方法应为标准化的，描述应明确完整。所有涉及该方法的因素，包括阳性样品核酸、阴性样品核酸的来源及阳性样品鉴定报告、试剂、耗材、仪器、设备、器具、仪器设备的参数设置、样品的制备等均应包括在文件中。1.2 方法预期用途标准制修订方应根据实际情况描述方法的预期用途，应当包括检测方法的适用范围和样品类
6、型等。1.3 验证指标标准制修订方应根据方法的预期用途选择合适的验证指标，设计并形成验证方案。典型的验证指标包括方法的特异性、灵敏度、重复性、重现典型的验证指标包括方法的特异性、灵敏度、重复性、重现性等。性等。2、本实验室验证首先验证文本中规定的适用范围，初步判断方法的可靠性。验证过程中，若某一指标的结果表明检测方法不能满足检测目标的特定要求，应对该方法作必要的修改并重新验证，直至能够证明其满足预期用途。3、验证材料的审核标准制修订方完成验证后，须向秘书处提交验证材料，具体包括：a）标）标准草案、准草案、b）验证方案、）验证方案、c）验证报告。）验证报告。秘书处组织专家评估提交材料的完整性与符
7、合性及验证方案的合理性。若提交的材料不完整，应要求其补足材料；若材料完整，验证方案合理，且验证结果能够满足预期用途的要求，则进行独立实验室验证程序。第四章 独立实验室验证秘书处组织验证实验室进行独立实验室验证。1、验证实验室的选择验证实验室的选择1.1 验证实验室数量参加验证的实验室不少于5个，原则上要求获得至少5个实验室的有效数据报告。在特殊情况下，如参加独立验证实验的实验室确实不足等原因，经秘书处商定后，可在较小的实验室范围内进行验证实验，但至少有两家以上有效数据报告。1.2 验证实验室的要求参加验证的实验室应具代表性，由秘书处从验证实验室库中抽取，验证实验室按照验证方案开展实验。1.3
8、验证实验室的选择原则秘书处根据需验证的有害生物的种类及口岸检疫的具体情况，结合实验室认可、指定口岸等因素，考虑地域、仪器和人员配置等条件，选择独立验证实验室。1.4 独立验证实验室库包括（1）总局规划的重点实验室及区域性重点实验室（2）技术能力较强，具有开展核酸检测能力的系统内实验室；（3）某些产品的指定口岸所在的检验检疫局实验室；（4）国内其他具有能力的相关实验室。（5）中国检科院为暂定固定的独立实验室2、验证样品核酸的要求核酸的提供：标准制修订方负责验证样品核酸的准备，核酸的质量：应满足标准所列方法的要求，并满足核酸的稳定性和均匀性要求，并经相关学科的复核鉴定专家确认。对照核酸：原则上包括
9、近似种样品核酸（针对具体有害生物种类，近似种的选取及数量由相关学科复核鉴定专家商定，若不能提供近似种样品核酸，需提供2位相应学科复核鉴定专家的书面同意意见及理由）。核酸的量：考虑到验证过程中可能会出现操作失误，样品数量应充分满足测试所需。3 3 方法验证指标方法验证指标3.1 特异性对待检对象不同地理种群的检测结果为阳性；与待检对象亲缘关系较近的有害生物的检测结果为阴性；同寄主上的其他有害生物尤其是引起类似症状的有害生物的检测结果为阴性；对适用范围中健康寄主植物及其产品的检测结果为阴性。3.2 灵敏度考察方法是否具备足够的灵敏度以满足口岸检疫的要求。对于每种代表性样品需要独立验证其灵敏度。可用
10、已知的阳性样品进行实验，对阳性样品制备的核酸溶液梯度稀释的方式确定最低检测灵敏度，以刚好能被有效检出的浓度水平作为灵敏度。3.3重复性对于同一样品的检测，需重复3次实验以上，分析各检测结果之间的差异是否显著，以测试方法的可靠性。3.4重现性在不同地区，不同实验室，不同主流品牌试剂，不同操作人员的情况下，测试方法的稳定性与可靠性。方法应适用于实验室拥有的同类主流检测仪器，若所用参数不同，应在文件中说明。对方法中涉及的关键仪器设备，需在主流型号的仪器上测试，确保结果的可靠性。4、验证实验的实施秘书处与选定的验证实验室联系并经实验室确认后，根据验证方案，标准制修订方将验证样品核酸和验证方案分发给各验
11、证实验室。各实验室应在规定时间内完成验证实验，每个验证实验室应需重复测试3次。5、验证材料的提交验证实验室将验证实验报告及评价报告提交至秘书处，组织专家审核。若结果满足方法预期用途，则完成独立实验室验证程序。若结果不能完全满足方法的预期用途，秘书处将结果反馈给标准制定方，并要求其对方法进行必要的审查并重新进行本实验室的验证程序；第五章 验证报告参考格式 1、验证实验报告验证实验室应提供验证实验中涉及关键步骤的原始记录（包括PCR电泳图、荧光PCR的荧光图谱或芯片检测的原始数据图等），以确保实验结果的可追溯性。验证实验报告应包括详细的实验步骤、关键仪器型号、操作及数据结果等，并对结果进行分析，报
12、告需反映实验及结果的真实性。2、验证评价报告方法特异性特异 完全满足使用要求 比较特异 基本满足使用要求特异性不够 不能满足使用要求描述：方法灵敏度灵敏度高 完全满足使用要求 比较灵敏 基本满足使用要求灵敏度不够 不能满足使用要求描述：重复性请验证专家根据实际情况评价。方法重现性请验证专家根据实际情况评价。可操作性方法科学，可操作性强，适合口岸实际情况 可操作性一般，时间长，试剂购买难，操作比较复杂 难于操作 常规实验室不具备硬件及软件条件，不适合目前口岸实验室使用。描述：安全性1、对人员及环境安全性安全 所用试剂安全环保，对操作人员及环境无伤害 安全性尚可 需要防护设施，适合应用不安全 易导致操作人员伤害，需要常规实验室不具备的防护设施。2、有害生物逃逸及扩散的可能性安全 常规操作不会导致有害生物逃逸及扩散安全性尚可 需要防护设施，能有效防止有害生物逃逸及扩散不安全 易导致有害生物逃逸及扩散综合评价2013年试点验证的植物检疫行业标准年试点验证的植物检疫行业标准2012B182黄瓜花叶病毒检疫鉴定方法黄瓜花叶病毒检疫鉴定方法 植检植检深圳局深圳局2012B184马铃薯马铃薯M病毒检疫鉴定方法病毒检疫鉴定方法 植检植检黑龙江局黑龙江局谢谢 谢谢
