1、高效液相色谱仪（High Performance Liquid Chromatograph）一.工作原理 储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相)内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。二.特点1.速度快：通常分析一个样品在1530 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。2.分辨率高：可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。3.灵
2、敏度高：紫外检测器可达纳克级，荧光和电化学检测器可达皮克级。4.色谱柱可反复使用：用一根色谱柱可分离不同的化合物。5.样品量少，容易回收：样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。三.仪器组成储液器输液泵进样器色谱柱检测器操作软件1.储液器盛放流动相，材质一般为玻璃，也有不锈钢或特种塑料材质，容积大小不等，以500-2000ml比较常见。2.输液泵2.1 基本要求：提供5-50Mpa的柱前液压；输出无脉动恒定的液流；流速范围0.1-10ml/min；流量精密度RSD 0.5%或更好；系统组件耐腐蚀，耐高压，没有爆炸危险。2.2 组成模式（1）等度模式 输液泵输出的液体流速不变。（2）
3、梯度模式 输液泵输出的液体流速随时间改变，又分为低压梯度 和高压梯度。低压梯度用一个输液泵加一个电磁阀 （比例阀）即可实现，成本较低，流动相混合比例误差 相对大；高压梯度每一路流动相都需要一个单独的输 液泵，成本较高，流动相混合比例更准确。3.进样器3.1 手动进样器 Rheodyne 7725i型 世界各大色谱制造商均选用此品牌，进样次数 可达30000次3.2 手动进样针 针头为平头，容积以10或20ul最常见 品牌：瑞士hamilton，国产上海高鸽等3.3 自动进样器全自动进样，提高进样过程的稳定性，降低劳动强度，可满足几十个甚至上百个样品的进样需求。有些自动进样器带有控温功能，适合热
4、敏性样品。4.色谱柱4.1 分类：反相色谱柱：C18色谱柱，C8色谱柱，C4色谱柱等，固定相极性小于流 动相，流动相成分包括水，甲醇，乙腈等。正相色谱柱：氨基柱，氰基柱，硅胶柱等，固定相极性大于流动相，流 动相成分包括苯，己烷，庚烷等。4.2 品牌：安捷伦，沃特斯，Merck，岛津，GL Sciences，资生堂，菲罗门，依利特，迪马等5.检测器5.1 紫外吸收检测器（UVD）：是目前HPLC中应用最广泛的检测器。它的主要特点是灵敏度高（10-9g），线性范围宽（105），对流速和温度变化不敏感，可用于梯度洗脱。它要求被检测样品组分有紫外吸收，属于选择性检测器。5.2 二极管阵列检测器（PDA
5、D）：是20世纪80年代才出现的一种光学多通道检测器，它可以看作是UVD的一个分支。在对每个洗脱组分进行光谱扫描，经计算机处理后，得到光谱和色谱结合的三维图谱。其中吸收光谱用于定性（确证是否是单一纯物质），色谱用于定量，常用于复杂样品（如生物样品、中草药）的定性定量分析。5.3 荧光检测器（FLD）：同样属于选择性检测器，其灵敏度在目前常用的HPLC检测器中是最高的，应用也较多，仅次于UVD。它适用于能激发荧光的化合物。很多与生命科学有关的物质，如氨基酸、胺类、维生素、甾族化合物及某些代谢药物都可以用荧光法检测。荧光检测器在生物样品痕量分析中很有用，尤其在用荧光衍生后，可以检测很微量的氨基酸和
6、肽。5.4 示差折光检测器（RID）：是一种通用型检测器，只要被测组分与洗脱液的折光指数有差别就可使用。生命科学中常遇到各类糖类化合物，没有紫外吸收，一般常用示差折光检测器。它的通用性比UVD广，但灵敏度要低，对温度变化敏感，并与梯度洗脱不相容，因而限制了它的使用。5.5 蒸发光散射检测器（ELSD）：也是一种通用型的检测器，可检测挥发性低于流动相的任何样品，而不需要样品含有发色基团。ELSD的响应值与样品的质量成正比，因而能用于测定样品的纯度或者检测未知物。ELSD灵敏度比RID高，对温度变化不敏感，基线稳定，可用于梯度洗脱。现在ELSD已被广泛应用于碳水化合物、类脂、脂肪酸和氨基酸、药物以
7、及聚合物等的检测。5.6 电化学检测器(ED)：电化学检测器主要有安培、极谱、库仑、电位、电导等检测器，属选择性检测器，可检测具有电活性的化合物。目前它已在各种无机和有机阴阳离子、生物组织和体液的代谢物、食品添加剂、环境污染物、生化制品、农药及医药等的测定中获得了广泛的应用。其中，电导检测器在离子色谱中应用最多。5.7 质谱检测器（MSD）：是另一种通用型检测器，在灵敏度、选择性、通用性及化合物的分子量和结构信息的提供等方面都有突出的优点。但它的昂贵操作费用和复杂性限制了它的推广应用。应用范围和主要特点应用范围和主要特点梯梯度度线性线性范围范围最小检测最小检测量量紫外-可见有紫外吸收的物质，大
8、多数有机物都可以检测优点：噪声低，对流动相的温度变化不敏感，检测后不破坏样品，可用于制备。缺点：紫外吸收大的溶剂不能用做流动相可10510-9g二极管阵列有紫外吸收的物质，大多数有机物都可以检测优点：噪声低，对流动相的温度变化不敏感，检测后不破坏样品，可用于制备。缺点：紫外吸收大的溶剂不能用做流动相，价格较高可高于紫外荧光自身发荧光的物质或荧光衍生物优点：适合生物样品痕量分析缺点：易受背景荧光、ph值和溶剂影响可10310-12g示差折光几乎所有溶质都可检测优点：通用性广，没有紫外吸收的物质可以使用缺点：灵敏度低，对温度敏感不可10410-6g蒸发光挥发性低于溶剂的样品均可检测优点：对温度变化
9、不敏感，基线稳定，不依赖样品的光学特性缺点：价格昂贵，需要载气可高于示差折光电化学（电导）具有氧化还原特性的物质优点：高灵敏度高选择性，离子色谱必备缺点：对流速温度敏感，不适合有机溶剂体系，干扰较多不可10610-9g6.其他部件6.1 在线脱气机用于除去流动相中溶解的微量气体，对于保证高效液相色谱数据的准确性，防止仪器工作中的一些故障是很有必要的。6.2 柱温箱用于保持色谱柱工作温度的稳定性，有利于保证高效液相色谱数据的准确性和重现性。7.操作软件安装在电脑上，基本作用为记录和处理数据。品牌液相色谱仪一般带有自己专用的操作软件，除了记录处理数据之外还可以控制输液泵和检测器，实现梯度洗脱功能。
10、YL9110岛津岛津LC-20AT安捷伦安捷伦1260沃特世沃特世1525普析普析L600天美天美LC2130流速范围0.001-10ml/min0.001-10ml/min0.001-10ml/min0.001-22.5ml/min0.001-10.000ml/min0.001-9.999ml/min流速准确性1%2%1%1.0%1%流速精密度0.1%RSD0.1%RSD0.07%RSD0.1%RSD0.075%RSD0.075%RSD梯度浓度准确度0.5%1%0.2%1%1%某些品牌液相输液泵对比YL9120岛津岛津SPD-20AV安捷伦安捷伦G1314F沃特世沃特世2489普析普析L60
11、0天美天美LC2030波长范围190-900nm190-900nm 190 600 nm190-700nm 190-800nm190-600nm基线噪声0.3510-5AU0.2510-5AU0.2510-5AU5x10-6AU0.7510-5 AU1.010-5AU基线漂移110-4AU/hr110-4AU/h110-4AU/h1 x 10-4 AU/h110-4AU/h波长准确性1nm1nm1nm1nm1nm2nm波长精密度0.1nm0.1nm0.2nm0.2nm某些品牌液相UV检测器对比四.UPLC（UHPLC）UPLC，又名UHPLC，即超高效液相色谱，沃特世公司首先提出概念并生产出世
12、界上第一台UPLC，是目前分离科技中效能最高的仪器。其特点如下：1.超高分离度 UPLC系统运用的固定相粒度能达到1.7m，该系统达到的效能将比5m粒度系统高70%，而比3.5m高40%。2.超高分离速度 运用1.7m的颗粒，相对于5m颗粒，在不影响柱效的情况下，柱长将可以立方级的减少，而且可以在3倍的流速下运行，相同的解析度情况下，分离速度提高了9倍。3.超高灵敏度 由于UPLC运用了更短的柱子（柱长L更小），进一步增加了峰高。因此，在提高柱效的同时，运用1.7m的UPLC系统比5m和3.5m的系统灵敏度分别提高了70%和40%，而在柱效下相同情况下，能分别提供3倍和2倍的灵敏度。五.配置YL9100-LYL9100-MYL9100-H脱气机无无YL9101脱气机输液泵YL 9111二元高压泵YL 9111二元高压泵YL 9110四元低压泵进样器7725i手动进样器YL9150自动进样器YL9150自动进样器柱温箱无YL9131柱温箱YL9131柱温箱检测器YL9120可见/紫外检测器自选自选
