1、发酵过程参数相关分析原理及应用发酵过程参数相关分析原理及应用国家生化工程技术研究中心（上海）国家生化工程技术研究中心（上海）庄英萍庄英萍 主要内容主要内容发酵过程特性概述发酵过程特性概述发酵过程的参数分类及检测发酵过程的参数分类及检测理化相关理化相关生物相关生物相关应用举例应用举例下阶段工作展望下阶段工作展望发酵过程特性概述发酵过程特性概述生物反应器中基因、细胞和反应器不同尺度网络之生物反应器中基因、细胞和反应器不同尺度网络之间存在着以时间为坐标多输入多输出的互动关系。间存在着以时间为坐标多输入多输出的互动关系。表现在同一尺度下多过程的耦合，不同尺度下也往表现在同一尺度下多过程的耦合，不同尺度
2、下也往往会有不同过程发生。往会有不同过程发生。多尺度的研究方法要求从一个尺度观察另一尺度现多尺度的研究方法要求从一个尺度观察另一尺度现象，即所谓跨尺度观察与控制，即可能提供在生物象，即所谓跨尺度观察与控制，即可能提供在生物技术研究中所没有发现的现象。技术研究中所没有发现的现象。研究尺度间相互作用和耦合的原则和条件，只有这研究尺度间相互作用和耦合的原则和条件，只有这样才能进一步分析不同尺度下的各种子过程之间的样才能进一步分析不同尺度下的各种子过程之间的相互量化关系，并与已知条件关联，构成描述复杂相互量化关系，并与已知条件关联，构成描述复杂系统的综合模型或描述。系统的综合模型或描述。发酵过程的特性
3、发酵过程的特性发酵过程多以分批操作形式进行，随着细胞生长发酵过程多以分批操作形式进行，随着细胞生长和代谢过程的变化，各种测量参数（自动或手工和代谢过程的变化，各种测量参数（自动或手工实验室测定）随时间的变化而变化，通过对这些实验室测定）随时间的变化而变化，通过对这些变化进行研究，有可能获得对发酵工艺和过程控变化进行研究，有可能获得对发酵工艺和过程控制的有关认识，有利于发酵过程优化。制的有关认识，有利于发酵过程优化。有必要在计算机辅助下对过程进行时序性综合研有必要在计算机辅助下对过程进行时序性综合研究和分析。究和分析。通过这些趋势曲线可以看出检测参数的多样性、通过这些趋势曲线可以看出检测参数的多
4、样性、时变性、相关耦合性和不确定性。时变性、相关耦合性和不确定性。代谢曲线对照常规发酵过程分析的缺陷性常规发酵过程分析的缺陷性分析发酵数据时，通过产品小试研究形成工厂生产的分析发酵数据时，通过产品小试研究形成工厂生产的工艺控制为目标，把重点放在寻找最佳的操作点或某工艺控制为目标，把重点放在寻找最佳的操作点或某参数时序变化规律，在方法上主要依据人工经验的试参数时序变化规律，在方法上主要依据人工经验的试差法，由此逐渐形成作为生产工艺管理的工艺规程。差法，由此逐渐形成作为生产工艺管理的工艺规程。-缺乏机理性认识，有局限性。缺乏机理性认识，有局限性。发酵过程动力学研究强调了参数趋势曲线的动态性并发酵过
5、程动力学研究强调了参数趋势曲线的动态性并采用了过程数学模拟等进行仿真，可进一步总结经验采用了过程数学模拟等进行仿真，可进一步总结经验规律，引入动态优化控制方法，为过程工艺优化研究规律，引入动态优化控制方法，为过程工艺优化研究提供了内容。提供了内容。-强调参数各自的时序变化，缺乏数据时序强调参数各自的时序变化，缺乏数据时序变化之间的相关分析变化之间的相关分析发酵过程特性产生的原因发酵过程特性产生的原因随着菌体生长和基质消耗，过程状态随时间变化的，随着菌体生长和基质消耗，过程状态随时间变化的，因此测量参数的时变性反映了发酵过程的时变系统特因此测量参数的时变性反映了发酵过程的时变系统特征。征。由于发
6、酵过程多容量性和严重非线性特征，表现在过由于发酵过程多容量性和严重非线性特征，表现在过程测量参数的离散性，主要是细胞代谢对环境因子的程测量参数的离散性，主要是细胞代谢对环境因子的高度敏感性和细胞代谢的不可逆性，有时还表现在基高度敏感性和细胞代谢的不可逆性，有时还表现在基因水平的启动和表达的影响，输入的初始条件极细微因水平的启动和表达的影响，输入的初始条件极细微的差别会产生结果的巨大变化，即发酵过程混沌现象。的差别会产生结果的巨大变化，即发酵过程混沌现象。由于对上述现象缺乏认识，更无法控制，也就描述为由于对上述现象缺乏认识，更无法控制，也就描述为测量参数的不确定性，应加强有关生物学机理的认识，测
7、量参数的不确定性，应加强有关生物学机理的认识，才能在产品的工业发酵生产上取得突破性进展。才能在产品的工业发酵生产上取得突破性进展。好氧生物反应器供氧情况变化引起的变化好氧生物反应器供氧情况变化引起的变化 当降低搅拌转速时，供氧速率（当降低搅拌转速时，供氧速率（OTROTR）下降必然引起溶解氧）下降必然引起溶解氧浓度（浓度（DODO）的下降，这是一个属于生物反应器系统中的过程）的下降，这是一个属于生物反应器系统中的过程传递和混和问题传递和混和问题 OURCCaKCL)*(dtd 如果如果DODO下降到临界氧浓度以下时，就引起菌体呼吸强度下降到临界氧浓度以下时，就引起菌体呼吸强度的减弱，这实质上是
8、氧成为限制性基质时的动力学行为的减弱，这实质上是氧成为限制性基质时的动力学行为 CKCXQOUROmO 当当DODO继续下降，就可能产生厌氧代谢，代谢途径发生迁继续下降，就可能产生厌氧代谢，代谢途径发生迁移，甚至发生胞内酶体系的改变移，甚至发生胞内酶体系的改变 发生反应体系的结发生反应体系的结构性变化。构性变化。温度诱导的基因工程菌生长与表达温度诱导的基因工程菌生长与表达 当用当用PL,CPL,C启动子构建表达载体时，启动子构建表达载体时，PL,RPL,R启动子受启动子受噬菌体噬菌体cIcI基因的负基因的负调控，调控，cIcI基因产生的阻遏蛋白结合基因产生的阻遏蛋白结合在操纵基因上，阻止转录的
9、进行在操纵基因上，阻止转录的进行。当在当在28283030培养时，利用培养时，利用cIcI的温的温度敏感突变基因的突变体可以产生度敏感突变基因的突变体可以产生有活性阻遏蛋白，阻遏有活性阻遏蛋白，阻遏PL,RPL,R转录，转录，细菌大量生长。细菌大量生长。温度上升到温度上升到4242，造成阻遏蛋白失活，造成阻遏蛋白失活，PL,RPL,R解除阻遏，解除阻遏，启动外源基因的高效转录和表达，启动外源基因的高效转录和表达，从而合成大量有价值的外源蛋白。从而合成大量有价值的外源蛋白。参数曲线相关分析的优势参数曲线相关分析的优势从发酵过程多尺度系统理论来看，参数趋势曲从发酵过程多尺度系统理论来看，参数趋势曲
10、线相关有可能是某一尺度的线性或动力学行为，线相关有可能是某一尺度的线性或动力学行为，也可能是多尺度系统的结构性突变，因此用常也可能是多尺度系统的结构性突变，因此用常规的单一尺度模式有时就无法解释过程中发生规的单一尺度模式有时就无法解释过程中发生的许多现象。的许多现象。虽然这些过程检测大多是环境中的状态或操作虽然这些过程检测大多是环境中的状态或操作量，但可以通过进一步分析，得到反映分子、量，但可以通过进一步分析，得到反映分子、细胞和反应器工程水平的不同尺度问题的联系，细胞和反应器工程水平的不同尺度问题的联系，从而实现跨尺度观察和跨尺度操作。从而实现跨尺度观察和跨尺度操作。参数相关耦合的定义参数相
11、关耦合的定义参数耦合相关是指各种直接参数、间接参数参数耦合相关是指各种直接参数、间接参数以及实验室手工参数随着发酵过程的进行而以及实验室手工参数随着发酵过程的进行而变化，并且参数间发生某种耦合相关。变化，并且参数间发生某种耦合相关。这种参数相关是生物反应器中物料、能量或这种参数相关是生物反应器中物料、能量或信息传递、转换、以及平衡或不平衡的结果，信息传递、转换、以及平衡或不平衡的结果，其微观因素也许只是发生在基因、细胞或反其微观因素也许只是发生在基因、细胞或反应器工程水平的某一个尺度上，但最终会在应器工程水平的某一个尺度上，但最终会在宏观过程中有所反映，这就为我们研究生物宏观过程中有所反映，这
12、就为我们研究生物反应器中不同尺度的数据关联分析方法提供反应器中不同尺度的数据关联分析方法提供了线索。了线索。发酵过程参数检测技术要求越来越高发酵过程参数检测技术要求越来越高微生物学微生物学生物化学生物化学分子生物学分子生物学发酵工艺学发酵工艺学化学工程化学工程现代控制理论现代控制理论各种工程开发各种工程开发参数检测参数检测(自动或手工检测自动或手工检测)综合性研究：综合性研究：定性和定量的描述定性和定量的描述工业生产工业生产随着生物技术的快速发展，生化工程对传感技术、计随着生物技术的快速发展，生化工程对传感技术、计算机数据处理的要求越来越高，有望形成新的技术领域算机数据处理的要求越来越高，有望
13、形成新的技术领域在线计算机在线计算机（一）、（一）、发酵过程的参数分类及检测发酵过程的参数分类及检测直接参数直接参数 通过传感器通过传感器把非电量变化直接转化为电量变化把非电量变化直接转化为电量变化，实时地送计算机数据采集。物理参数、化学参数、实时地送计算机数据采集。物理参数、化学参数、生物量参数就地测量生物量参数就地测量(in line)(in line)、在线测量（、在线测量（on on lineline）手工参数手工参数:取样后实验室手工测量参数，离线输入。取样后实验室手工测量参数，离线输入。间接参数间接参数:由一些直接参数计算得到的各种反映过程特性的由一些直接参数计算得到的各种反映过程
14、特性的参数。反映菌体代谢活性、反应器工程特性、反应参数。反映菌体代谢活性、反应器工程特性、反应器操作特性等。器操作特性等。直接参数直接参数 物理参数物理参数 化学参数化学参数温温度度 压压力力 功功率率输输入入 通通气气流流量量 泡泡沫沫水水平平 加加料料速速率率 基基质质 前前体体 诱诱导导物物 培培养养液液重重量量 培培养养液液体体积积 生生物物热热 培培 养养 液液 表表 观观 粘粘度度 积积累累消消耗耗量量 基基质质 酸酸 碱碱 消消泡泡剂剂 细细胞胞量量 气气泡泡含含量量 气气泡泡表表面面积积 表表面面张张力力 p pH H 氧氧化化还还原原电电位位 溶溶解解氧氧浓浓度度 溶溶解解
15、C CO O2 2浓浓度度 排排气气 O O2 2分分压压 排排气气 C CO O2 2分分压压 其其他他排排气气成成分分 成成分分浓浓度度 糖糖 氮氮 前前体体 诱诱导导物物 产产物物 中中间间代代谢谢物物 金金属属离离子子 脱脱氢氢酶酶活活力力 各各种种酶酶活活力力 细细胞胞内内成成分分 蛋蛋白白质质 D DN NA A R RN NA A 生化反应过程中参数检测的复杂性生化反应过程中参数检测的复杂性 1)1)反应器上插入的传感器必须能耐热，经受高温灭反应器上插入的传感器必须能耐热，经受高温灭菌；菌；2)2)菌体以及其他固体物质极易吸附在传感器的表面，菌体以及其他固体物质极易吸附在传感器的
16、表面，使一些传感器的使用性能受到影响；使一些传感器的使用性能受到影响；3)3)生物反应过程往往是耗氧的过程，故在反应器内生物反应过程往往是耗氧的过程，故在反应器内通气带来的气泡影响，往往对测量过程会造成干扰；通气带来的气泡影响，往往对测量过程会造成干扰；4 4）使用在反应器上的传感器，其结构必须防止杂）使用在反应器上的传感器，其结构必须防止杂菌进入和避免产生灭菌死角，因而使传感器结构复菌进入和避免产生灭菌死角，因而使传感器结构复杂或使其检测性能产生变化；杂或使其检测性能产生变化；5)5)生化反应过程中化学成分的分析往往是重要的检生化反应过程中化学成分的分析往往是重要的检测内容，但对其电信号的转
17、换困难。测内容，但对其电信号的转换困难。带有计算机系统的的生物反应器检带有计算机系统的的生物反应器检测参数示意图测参数示意图 间接参数间接参数摄摄氧氧率率（O OU UR R）二二氧氧化化碳碳生生成成率率（C CE ER R）呼呼吸吸商商（R RQ Q）细细胞胞浓浓度度（X X）细细胞胞生生长长速速率率（R Rx x）比比生生长长速速率率（）细细胞胞得得率率（Y YX X/S S）糖糖利利用用率率 氧氧利利用用率率 比比基基质质消消耗耗率率（u u）前前体体利利用用率率 产产物物量量（P P）比比生生产产率率（）体体积积氧氧传传递递系系数数（K KL La a）功功率率、功功率率准准数数 雷雷
18、诺诺数数 细细胞胞量量 生生物物热热 碳碳平平衡衡 能能量量平平衡衡 几个重要的间接参数计算公式几个重要的间接参数计算公式（二）、（二）、参数相关基本特性参数相关基本特性 各种直接参数、间接参数以及手工测定的实各种直接参数、间接参数以及手工测定的实验室参数随着发酵过程的进行而验室参数随着发酵过程的进行而变化，变化，并且参数间并且参数间发生某种耦合相关，这种参数相关反映了发酵过程发生某种耦合相关，这种参数相关反映了发酵过程多尺度（水平）的问题多尺度（水平）的问题特征。特征。发酵过程检测参数的特性发酵过程检测参数的特性所检测到的参数均是动态平衡的结果所检测到的参数均是动态平衡的结果 检测参数检测参
19、数 =供给供给 消耗消耗残留基质浓度对代谢的影响残留基质浓度对代谢的影响限制性基质的概念限制性基质的概念代谢曲线一代谢曲线一发酵过程典型的代谢曲线发酵过程典型的代谢曲线发酵过程参数相关分类发酵过程参数相关分类理化相关理化相关 纯属物质理化性质变化所引起的参数相关纯属物质理化性质变化所引起的参数相关生物相关生物相关 生物相关是指通过生物细胞的生命活动所引起的生物相关是指通过生物细胞的生命活动所引起的参数之间耦合相关参数之间耦合相关（三）、（三）、理化相关理化相关纯属物质理化性质变化所引起的参数相关纯属物质理化性质变化所引起的参数相关 物理过程：物质或能量传递、混和、平物理过程：物质或能量传递、混
20、和、平衡或不平衡衡或不平衡*传热（加热或冷却）传热（加热或冷却）温度温度发酵过程中打开冷却水的阀门引起罐温的下降发酵过程中打开冷却水的阀门引起罐温的下降 化学过程：发生某些化学反应的结果化学过程：发生某些化学反应的结果*酸碱加入酸碱加入 ，加入某种酸碱物质引起的加入某种酸碱物质引起的pHpH的变化的变化理化相关理化相关*搅拌转速、通气流量、罐压力搅拌转速、通气流量、罐压力 溶解氧溶解氧 DODO转速转速，气泡，气泡，气液接触表面积，气液接触表面积，KLaKLa，OTROTROUROUR，DODO理化相关理化相关*通气流量通气流量 排气二氧化碳（排气二氧化碳（ECOECO2 2)*通气流量通气流
21、量 溶解二氧化碳（溶解二氧化碳（P P）罐压测量与罐压测量与DODO值值常规测量与代谢流方法测量的差异常规测量与代谢流方法测量的差异*加油泡沫加油泡沫 ，气泡破裂释放气泡破裂释放2 2理化相关（二）理化相关（二）理化相关理化相关*搅拌转速搅拌转速 COCO2 2 释放后释放后pHpH变化变化*温度温度 DO DO 传感原理传感原理 ：T T,OUROUR,DO,DO理化相关的普遍特性理化相关的普遍特性*理化相关对不同细胞对象具有普遍性，理化相关对不同细胞对象具有普遍性，不因细胞生理活性的变化呈现不同的特不因细胞生理活性的变化呈现不同的特性。性。要注意过程数据采集的非同步性引要注意过程数据采集的
22、非同步性引起的误相关，特别要注意间接参数的变起的误相关，特别要注意间接参数的变化产生的对过程研究的误导。化产生的对过程研究的误导。（四）、生物相关（四）、生物相关生物相关是指通过生物细胞的生命活动所引起的参数之间耦合生物相关是指通过生物细胞的生命活动所引起的参数之间耦合相关，主要体现在二种方式：相关，主要体现在二种方式：其一，通过生物细胞生长代谢后引起的培养液物性的变化，进其一，通过生物细胞生长代谢后引起的培养液物性的变化，进而引起的参数相关。而引起的参数相关。菌体生长引起的生物相关特性菌体生长引起的生物相关特性*快速生长期时，培养液粘度上升，快速生长期时，培养液粘度上升，K KL La a下
23、下降，引起降，引起DODO水平的变化。水平的变化。*培养液粘度的变化也会引起溶解二氧化培养液粘度的变化也会引起溶解二氧化碳碳COCO2 2与排气二氧化碳浓度与排气二氧化碳浓度ECOECO2 2的差异。的差异。*轴向流桨叶所持留的微气泡与快速增长轴向流桨叶所持留的微气泡与快速增长的菌体形成气溶胶现象，结构性粘度严的菌体形成气溶胶现象，结构性粘度严重影响培养液的混和、传递特性。重影响培养液的混和、传递特性。菌体生长与参数相关菌体生长与参数相关菌体生长时菌量必定增加，由于测定技术的困难，可用菌体干重、菌体生长时菌量必定增加，由于测定技术的困难，可用菌体干重、取样离心体积（取样离心体积（PMVPMV）
24、、显示粘度、发酵液流出时间等表示。）、显示粘度、发酵液流出时间等表示。菌体生长时，菌体生长时，OUROUR与与CERCER发生变化。但是由于发生变化。但是由于OUROUR与所利用的碳源与所利用的碳源的还原度有关，以及与菌体代谢途经密切相关，而的还原度有关，以及与菌体代谢途经密切相关，而CERCER主要涉及主要涉及到碳平衡，所以一般宜以到碳平衡，所以一般宜以CERCER与菌体生长相关。与菌体生长相关。氮源在菌体代谢过程中不能作为能源供应，因此氮源的变化一般氮源在菌体代谢过程中不能作为能源供应，因此氮源的变化一般与菌体的维持无关。但是菌体生长时，必需由氮源提供生长所需与菌体的维持无关。但是菌体生长
25、时，必需由氮源提供生长所需的的N N元素材料。元素材料。菌体生长所引起的培养液流变特性的变化，由此而引起反应器混菌体生长所引起的培养液流变特性的变化，由此而引起反应器混和传递特性的变化。和传递特性的变化。KLaKLa就是一个反映这种特性的较容易测定的就是一个反映这种特性的较容易测定的特征参数。特征参数。磷是菌体生长的重要因子，它既是菌体生长时的组成材料又是微磷是菌体生长的重要因子，它既是菌体生长时的组成材料又是微生物进行平衡生长的限制因素之一，因此在培养液中测定总磷或生物进行平衡生长的限制因素之一，因此在培养液中测定总磷或溶磷含量是必要的，由此可以与其他生长有关的参数相关联。溶磷含量是必要的，
26、由此可以与其他生长有关的参数相关联。高搅拌转速时菌体生长与高搅拌转速时菌体生长与KLaKLa变化变化 高转速时的头孢高转速时的头孢C C菌丝形态变化菌丝形态变化 头孢菌素头孢菌素C C发酵过程菌体生长引起的参数变化发酵过程菌体生长引起的参数变化头孢菌素发酵过程菌体生长与产量的关系头孢菌素发酵过程菌体生长与产量的关系金霉素发酵后期发酵液稀化现象金霉素发酵后期发酵液稀化现象 发酵过程中泡沫与发酵过程中泡沫与K KL La a的关系的关系代谢引起的生物相关代谢引起的生物相关 通过生物细胞及代谢途径的不同所引起的活性通过生物细胞及代谢途径的不同所引起的活性变化变化,直接对控制对象特性发生影响。直接对控
27、制对象特性发生影响。菌体细胞代谢活性变化而直接引起的某测定参数的变菌体细胞代谢活性变化而直接引起的某测定参数的变化，即为代谢特性参数相关。化，即为代谢特性参数相关。-代谢强度的变化代谢强度的变化 -代谢途径的变化代谢途径的变化 -引起的基质消耗或代谢产物形成的不同引起的基质消耗或代谢产物形成的不同 代谢活性变化：环境条件的线性或动力学因素、细胞代谢活性变化：环境条件的线性或动力学因素、细胞内某调节因子引起的代谢流迁移、基因水平的信息流。内某调节因子引起的代谢流迁移、基因水平的信息流。发酵过程中补糖策略的实施发酵过程中补糖策略的实施 发酵过程中以某一营养物质作为限制性基质，发酵过程中以某一营养物
28、质作为限制性基质，采用营养物流加技术是常用的一种发酵调控策略。采用营养物流加技术是常用的一种发酵调控策略。其中以流加糖（淀粉或葡萄糖）是最普遍采用的方其中以流加糖（淀粉或葡萄糖）是最普遍采用的方法，归纳起来主要有以下几点理由。法，归纳起来主要有以下几点理由。适应生物反应器的供氧能力，控制菌体生长速率与适应生物反应器的供氧能力，控制菌体生长速率与最大生物量。最大生物量。在菌体生长期完成后，在细胞水平控制比生长速率，在菌体生长期完成后，在细胞水平控制比生长速率，使菌体酶体系处于最有利于生产的状态，或控制比使菌体酶体系处于最有利于生产的状态，或控制比生长速率来解决基因水平上的分解代谢产物的阻遏生长速
29、率来解决基因水平上的分解代谢产物的阻遏作用。作用。低浓度葡萄糖可以降低高浓度时所引起的分解代谢低浓度葡萄糖可以降低高浓度时所引起的分解代谢阻遏作用。阻遏作用。生物相关：排气氧浓度与溶解氧浓度的对应关系生物相关：排气氧浓度与溶解氧浓度的对应关系 不同发酵周期的不同发酵周期的EOEO2 2浓度与浓度与DODO的几种对应关系。这种不的几种对应关系。这种不同的对应关系是与不同操作条件和菌体呼吸强度有关的。同的对应关系是与不同操作条件和菌体呼吸强度有关的。rpmDOECO2EO2加糖加糖ECO2ECO2ECO2EO2EO2EO2DODODOrpmrpmrpmhhhh非碳源限制，临界氧浓度以下（变化不显著
30、）碳源限制，临界氧浓度以下（变化显著）非碳源限制，临界氧浓度以上（EO2变化不显著）碳源限制，临界氧浓度以上（EO2变化显著）补糖与排气补糖与排气COCO2 2 、pHpH的关系的关系青霉素发酵过程，补糖将引起排气青霉素发酵过程，补糖将引起排气COCO2 2浓度浓度的增加和培养液的增加和培养液pHpH下降，产生的二氧化下降，产生的二氧化碳和碳和pHpH的变化可用下述简图描述：的变化可用下述简图描述：pHECO2加糖(h)产生的二氧化碳可以用青霉素产生菌的生长和产物形成的化学产生的二氧化碳可以用青霉素产生菌的生长和产物形成的化学简式来说明：简式来说明：菌体生长：菌体生长：C C6 6H H121
31、2O O6 6+NH+NH3 3+3.3O+3.3O2 2+0.06H+0.06H2 2SOSO4 4 0.42C7.1H13.2O4.4N0.06S+3CO 0.42C7.1H13.2O4.4N0.06S+3CO2 2+4.8H+4.8H2 2O O菌体维持：菌体维持：C C6 6H H1212O O6 6+6O+6O2 2 6CO 6CO2 2+6H+6H2 2O O青霉素生产：青霉素生产：C C6 6H H1212O O6 6+(NH+(NH4 4)2 2SOSO4 4+0.5O+0.5O2 2+PAA+PAA C9H C9H1212O O4 4N N2 2S+2COS+2CO2 2+H
32、+H2 2O O 糖对糖对pHpH的影响主要从二个方面起作用，一方面，由于糖的的影响主要从二个方面起作用，一方面，由于糖的补入，立即被菌体利用形成补入，立即被菌体利用形成COCO2 2，溶解的二氧化碳使培养液的，溶解的二氧化碳使培养液的pHpH下降，另一方面，糖被菌体利用以后产生有机酸下降，另一方面，糖被菌体利用以后产生有机酸。生物相关生物相关补糖与氮源的利用关系补糖与氮源的利用关系补料与磷含量的变化情况补料与磷含量的变化情况补料与物料平衡补料与物料平衡在菌体生长期或产物生产期，基础培养基中的碳源在菌体生长期或产物生产期，基础培养基中的碳源或中间补入的碳源被菌体利用后，经分解代谢和合或中间补入
33、的碳源被菌体利用后，经分解代谢和合成代谢，形成菌体生长、中间代谢物和能量消耗，成代谢，形成菌体生长、中间代谢物和能量消耗，这些都应符合物质平衡和能量平衡原理。这些都应符合物质平衡和能量平衡原理。-可把可把生物反应器中微生物细胞活动用化学元素的平衡式生物反应器中微生物细胞活动用化学元素的平衡式来表示。来表示。在多参数趋势曲线基础上，以物质守恒的原理进行在多参数趋势曲线基础上，以物质守恒的原理进行相关分析。对相关分析。对OUROUR、CERCER、补糖量（或速率）、补氮、补糖量（或速率）、补氮量（或速率）、产物生成量和菌体生成量等进行碳量（或速率）、产物生成量和菌体生成量等进行碳和氮平衡估算。如果
34、发现不平衡现象，就有可能是和氮平衡估算。如果发现不平衡现象，就有可能是某种未知的代谢产物形成。可以进一步结合发酵过某种未知的代谢产物形成。可以进一步结合发酵过程的其他现象，如程的其他现象，如RQRQ、pHpH值、菌丝形态等进行分析，值、菌丝形态等进行分析，得到有意义的结果。得到有意义的结果。生物相关：生物相关：OUROUR与与DODO的基本相关特征的基本相关特征OURDOrpm加糖DO和OUR之间的动力学特征O2消耗与过程传递的物质平衡时间(h)细胞水平细胞水平 代谢调节代谢调节*dc/dt=Kdc/dt=KL La(ca(c*c)c)OUROUR*rpm rpm K KL La a*K KL
35、 La(ca(c*-c)OUR-c)OUR*dc/dt 0dc/dt KOUR KL La(ca(c*-c)dc/dt 0 c-c)dc/dt 碳源；DO-批阶段和分批补料阶段的判定，氧限制优化优化：指数流加与DO控制结合高密度高比生长速率50 L50 L500 L500 L12 T12 T鸟苷发酵过程关键技术研究鸟苷发酵过程关键技术研究 参数相关分析与状态方程建立参数相关分析与状态方程建立 通过鸟苷发酵过程的数据采集发现：通过鸟苷发酵过程的数据采集发现：404040小时小时OUROUR下降，耗糖速率增加，氨氮用量增加下降，耗糖速率增加，氨氮用量增加 鸟苷产率迅速下降鸟苷产率迅速下降代谢流迁移
36、代谢流迁移 代谢途径迁移的酶学测代谢途径迁移的酶学测试试 HMP HMP途经途经EMPEMP途经途经磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶 磷酸葡萄糖脱氢酶磷酸葡萄糖脱氢酶 丙酮酸激酶丙酮酸激酶 柠檬酸合成酶柠檬酸合成酶 丙氨酸脱氢酶丙氨酸脱氢酶 跨尺度分析与工艺改进跨尺度分析与工艺改进 确定以代谢流由确定以代谢流由EMPEMP向向HMPHMP途径回复迁移途径回复迁移为目标进行过为目标进行过程工艺优化，并程工艺优化，并以以OUROUR的下降的下降作为跨尺度操作的相关因子作为跨尺度操作的相关因子 发现调控因子发现调控因子A A加入后短期内加入后短期内OUROUR的下降速度就开始放的下降速度就开始放慢，到慢，到
37、4848小时开始维持稳定直至放罐，并且发酵后期的糖小时开始维持稳定直至放罐，并且发酵后期的糖耗速率也变慢耗速率也变慢 工艺改进后实施效果工艺改进后实施效果小试与中试规模小试与中试规模 ：17.217.2克克/L 34/L 34克克/L(60/L(60小时小时)100M100M3 3生产规模生产规模 ：1616克克/L/L 3232克克/L(60/L(60小时小时)阿维菌素发酵过程的参数相关分析阿维菌素发酵过程的特点阿维菌素发酵过程的特点典型的丝状菌液体深层发酵过程典型的丝状菌液体深层发酵过程菌丝形态是重要参数菌丝形态是重要参数菌丝形态会影响发酵液的流变特性、培养菌丝形态会影响发酵液的流变特性、
38、培养体系的传质和传热、影响目的产物合成体系的传质和传热、影响目的产物合成菌体形态分化也与丝状微生物生理状态密菌体形态分化也与丝状微生物生理状态密切相关切相关发酵过程中的供氧与菌丝剪切力是一较难发酵过程中的供氧与菌丝剪切力是一较难协调的矛盾协调的矛盾 不同操作条件下菌丝形态差异不同操作条件下菌丝形态差异50L发酵罐不同初始碳源浓度批发酵过程菌丝图像(100倍)（a）淀粉浓度13%，45h（左）、70h（右）；（b）淀粉浓度11%，45h（左）、68h（右）(a)(b)图像分析技术在阿维菌素发酵过程中的应用图像分析技术在阿维菌素发酵过程中的应用(c)(d)(e)(a)(b)菌丝图像分析菌丝图像分析
39、流程流程(a)(a)原始图像原始图像(b)(b)目标二值图目标二值图(c)(c)菌丝球核菌丝球核 (d)(d)菌丝掩图菌丝掩图（e e）菌丝图）菌丝图不同搅拌反应器对阿维菌素发酵过程的影响不同搅拌反应器对阿维菌素发酵过程的影响50L50L发酵罐同时配置不同形式的搅拌浆发酵罐同时配置不同形式的搅拌浆利用计算流体力学方法计算不同桨叶利用计算流体力学方法计算不同桨叶组合的速度矢量场情况组合的速度矢量场情况 不同搅拌将情况下细胞代谢特性的研究不同搅拌将情况下细胞代谢特性的研究 05 01 0 01 5 02 0 02 5 03 0 04 0 0 05 0 0 06 0 0 07 0 0 08 0 0
40、09 0 0 01 0 0 0 01 1 0 0 01 2 0 0 0 T im e(h)Mycelial area(m2)C05 01 0 01 5 02 0 02 5 03 0 01.01.21.41.61.82.0 CircularityT im e(h)D05 01 0 01 5 02 0 02 5 03 0 03 0 0 04 0 0 05 0 0 06 0 0 07 0 0 08 0 0 09 0 0 0Core area(m2)T im e(h)A05 01 0 01 5 02 0 02 5 03 0 02 5 03 0 03 5 04 0 04 5 05 0 0Core per
41、imeter(m)T im e(h)B05 01 0 01 5 02 0 02 5 03 0 00.50.60.70.80.91.0 Roughness T im e(h)F05 01 0 01 5 02 0 02 5 03 0 08 59 09 51 0 0Compactness(%)T im e(h)E不同桨叶组合不同桨叶组合下除虫链霉菌下除虫链霉菌球核面积，核球核面积，核区周长，区周长，菌丝球面积，菌丝球面积，圆形因子，菌圆形因子，菌丝球密度，边丝球密度，边缘菌丝密度的缘菌丝密度的变化趋势变化趋势Im01Im01（）；）；Im02Im02（）；（）；Im03Im03（）生理实验结果生理实
42、验结果第一组：剪切力小、混合第一组：剪切力小、混合好、菌丝形态好，发酵单好、菌丝形态好，发酵单位：位：3500u/ml 3500u/ml 第二组：菌量最小、菌球第二组：菌量最小、菌球最小，发酵单位：最小，发酵单位：3000u/ml 3000u/ml 第三组：剪切力最小、混第三组：剪切力最小、混合较差、前期菌球大，发合较差、前期菌球大，发酵单位：酵单位：2800 u/ml2800 u/ml 阿维菌素发酵过程参数相关变化特性阿维菌素发酵过程参数相关变化特性OUR、CER、pH、RQ、Titer等变化趋势发酵过程中发酵过程中-酮戊二酸、乙酸积累和总糖消耗过程曲线酮戊二酸、乙酸积累和总糖消耗过程曲线（
43、Acetic acid;Total sugar；-ketoglutaric acid）溶氧对菌形及产素的影响溶氧对菌形及产素的影响 51小时：高DO时187g/ml；低DO时效价只有27g/ml，提前放罐DO1;DO2;Total sugar1;total sugar2)低DO高DO后期补糖策略对发酵单效价的影响后期补糖策略对发酵单效价的影响补糖较差时，效价仅补糖较差时，效价仅3600 u/ml3600 u/ml补糖较好时，效价可达补糖较好时，效价可达5000 u/ml5000 u/ml基于代谢参数基于代谢参数OUROUR的阿维菌素发酵补糖的阿维菌素发酵补糖新工艺新工艺 常规发酵过程中常规发酵
44、过程中OUROUR参数变化规律参数变化规律 以以OUROUR为依据控制补糖的为依据控制补糖的OUROUR变化图变化图 以以OUROUR为依据的补糖与对照效价对比图为依据的补糖与对照效价对比图 头孢菌素头孢菌素C C发酵过程放大发酵过程放大头孢菌素头孢菌素C C的生物合成途径的生物合成途径L-a-氨基己二酸 L-半胱氨酸 L-缬氨酸 三肽合成酶 LLD-三肽 环化酶 O2 异青霉素N 异构酶 青霉素N 扩环酶 O2 脱乙酰氧头孢菌素C(DAOC)DAC合成酶 O2 脱乙酰头孢菌素C(DAC)乙酰水解酶 乙酰转移酶 头孢菌素C 高耗氧是头高耗氧是头C C发酵特点之一发酵特点之一大型搅拌发酵罐设计制
45、造大型搅拌发酵罐设计制造180M180M3 3发酵罐车间发酵罐车间大型空气压缩机大型空气压缩机 5050升发酵罐（升发酵罐（FUS-50L(A)FUS-50L(A)）：）：平均平均4 4万万u/mlu/ml，最高达，最高达4.54.5万万u/m1u/m1，用油少，用油少 l80Ml80M3 3工业发酵罐：工业发酵罐：平均平均2.52.5万万u/m1u/m1，最高达，最高达3 3万万u/m1u/m1，用油增加，用油增加30%30%?试验结果试验结果 大罐与小罐比较（大罐与小罐比较（307-149307-149与与50L2-1050L2-10）大罐：大罐：100h100h后后DODO水平是限制产素
46、速率的关键因素水平是限制产素速率的关键因素搅拌功率：搅拌功率：560kw/180M560kw/180M3 3 3.2kw/M3.2kw/M3 3 RQRQ值差异值差异 3232小时前，大罐与小罐的小时前，大罐与小罐的RQRQ值接近值接近3232小时大罐小时大罐RQRQ值升高值升高7070小时左右，大小罐小时左右，大小罐RQRQ值下降，值下降，但小罐更低但小罐更低。初步结论初步结论小罐用油情况优于生产大罐，原因分析：小罐用油情况优于生产大罐，原因分析：加油量加油量(单位发酵液体积单位发酵液体积)：大罐大于小罐？大罐大于小罐？脂肪酶诱导：脂肪酶诱导：小罐优于大罐？小罐优于大罐？混和情况：混和情况：
47、大罐搅拌功率：大罐搅拌功率：560kw/180M560kw/180M3 3 3.2kw/M3.2kw/M3 3？考虑到考虑到100h100h后后DODO水平变化情况水平变化情况混和传递是放混和传递是放大时的主要矛盾大时的主要矛盾 桨型的计算流体力学仿真桨型的计算流体力学仿真通气量从通气量从0.50.5提高到提高到1.2vvm1.2vvm时，发现桨间流型干扰时，发现桨间流型干扰l气含量分层现象严重气含量分层现象严重l通气短路现象通气短路现象结论结论搅拌系统设计不合理引起工业生产罐混和不均的搅拌系统设计不合理引起工业生产罐混和不均的严重问题严重问题出现发酵出现发酵100100小时高耗氧时的供氧不足
48、小时高耗氧时的供氧不足出现顶部加油区到发酵底部的出现顶部加油区到发酵底部的含油浓度梯度含油浓度梯度，虽，虽然生产大罐加油量大，但实际耗油量减少然生产大罐加油量大，但实际耗油量减少也引起也引起脂肪酶的诱导不均一性脂肪酶的诱导不均一性发酵单位下降，用油成本增加，含油发酵液提取发酵单位下降，用油成本增加，含油发酵液提取困难，影响产品质量困难，影响产品质量改造后搅拌桨模型改造后搅拌桨模型初步改造结果初步改造结果 2.5-3.0万u/m1 3.5万u/m1红霉素发酵过程的优化与放大红霉素发酵过程的优化与放大项项 目目 背背 景景u红霉素及其衍生物市场需求大红霉素及其衍生物市场需求大年销售额已超过年销售额
49、已超过3535亿美元，位居抗生素销售额第三亿美元，位居抗生素销售额第三位位u限制我国参加国际市场竞争的关键因素限制我国参加国际市场竞争的关键因素红霉素组分要求红霉素组分要求 组分不合格的红霉素产品将严重影响后续衍生物的合成组分不合格的红霉素产品将严重影响后续衍生物的合成 降低生产成本降低生产成本 必须实现高效节能和绿色规模化生产必须实现高效节能和绿色规模化生产关键技术与难点关键技术与难点u工业生产菌有效组分基因工程改造困难工业生产菌有效组分基因工程改造困难 国际上也未有文献报道国际上也未有文献报道 u全局优化的全局优化的发酵过程调控有难度发酵过程调控有难度 u规模化生产中规模化生产中需要有效过
50、程放大理论与方法需要有效过程放大理论与方法u分离纯化过程中需要分离纯化过程中需要节能减排先进分离技术节能减排先进分离技术1.1.首次成功应用代谢工程改造红霉素工业首次成功应用代谢工程改造红霉素工业生产菌提高发酵有效组分生产菌提高发酵有效组分E1 E2重组菌重组菌E1中红霉素组分得到了改善中红霉素组分得到了改善 外源外源SAMs基因的表达基因的表达 抑制了孢子的形成抑制了孢子的形成 u克服工业生产菌株遗传操作的重大障碍克服工业生产菌株遗传操作的重大障碍u成功实现异源表达成功实现异源表达S-S-腺苷甲硫氨酸合成酶腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMs)(SAMs)基因提基因提高红霉素高红霉素A A产量产量调
