1、Tests of thrombus and haemostasis,出凝血功能检查,南方医科大学南方医院检验医学科 郑磊 nfyyzl,广东省精品资源共享课程：实验诊断学（),Tests of thrombus and haemostasis,Tests of thrombus and haemostasis,Tests of thrombus and haemostasis,皇家病-血友病,1837-1901,提纲,Tests of thrombus and haemostasis,一.止凝血基础理论,二.实验室检验项目,三.检验项目的选择和应用,四.出凝血检查的全面质量管理,Tests o
2、f thrombus and haemostasis,Bleeding,Clotting,The Hemostatic Balance,出血,凝血,基础理论,基础理论,Tests of thrombus and haemostasis,基础理论,Tests of thrombus and haemostasis,血管壁,完整的血管内皮无血栓发生倾向 血管扩张剂的合成（前列环素） 有限的凝血酶生成 纤溶调节 与血小板或凝血因子无反应,血管壁受损时 暴露内皮下层 血小板粘附 凝血和纤溶启动,基础理论,Tests of thrombus and haemostasis,血小板,基础理论,Tests
3、of thrombus and haemostasis,血小板,血小板的止血作用(Hemostastic function of platelets) ：,基础理论,Tests of thrombus and haemostasis,凝血机制(Mechanism of coagulation),目前公认的凝血因子尚有高分子量激肽原(HMWK)，激肽释放酶原(PK) 大多数由肝脏产生，其中II、VII、IX、X合成依赖于Vitk，称Vitk依赖因子 正常情况下，所有因子都处于无活性状态,凝血因子( Coagulation factors)：,基础理论,Tests of thrombus and
4、haemostasis,凝血过程(Coagulation pathway),Tests of thrombus and haemostasis,基础理论,正常抗凝机制(Mechanism of anticoagulation),体液抗凝机制,血液中存在多种抗凝物质及抗凝系统,1抗凝血酶（antithrombin ，AT） 占体内总抗凝功能的50-67%,II IIa,Fibrinogen Fibrin,FVIIIa/Ca2+/Phospholipid,FVa/Ca2+/Phospholipid,Antithrombin inhibition,AT Pathway,X Xa,IX IXa,XIa
5、,Tests of thrombus and haemostasis,基础理论,正常抗凝机制(Mechanism of anticoagulation),体液抗凝机制,蛋白C（Protein C, PC） 蛋白S（Protein S, PS) 凝血酶调节蛋白（thrombomodulin, TM） 活化蛋白C抑制物(activated protein C inhibitor, APCI ),2蛋白C系统,Tests of thrombus and haemostasis,基础理论,正常抗凝机制(Mechanism of anticoagulation),蛋白 C 的抗凝途径,Thrombomo
6、dulin,EPCR,Tests of thrombus and haemostasis,基础理论,正常抗凝机制(Mechanism of anticoagulation),Vai,Tests of thrombus and haemostasis,基础理论,正常抗凝机制(Mechanism of anticoagulation),体液抗凝机制,3组织因子途径抑制物(tissue factor pathway inhibitor，TFPI),a,a,TFPI,灭活a、TF、a,a,TF,Tests of thrombus and haemostasis,基础理论,纤溶系统(Fibrinolyt
7、ic system),主要作用：分解纤维蛋白（原），清除血管内由于纤 维蛋白沉积引起的阻塞，保持血流通畅,Tests of thrombus and haemostasis,基础理论,纤溶系统(Fibrinolytic system),Tests of thrombus and haemostasis,基础理论,纤溶系统(Fibrinolytic system),Tests of thrombus and haemostasis,一. 血管壁检测,三. 凝血功能检测,四. 抗凝系统检测,二. 血小板检测,五. 纤溶活性检测,实验室检验项目,出血时间（Bleeding Time，BT）测定 原理
8、：皮肤毛细血管刺破，出血自然停止所需的时间。 主要受血小板数量和功能影响， 其次受血管壁完整性和收缩功能影响， 凝血因子影响较小 参考值：标准化出血时间测定器法（template bleeding time,TBT) 6.92.1min, 超过9min为异常,实验室检验项目,血管壁检测,筛检试验,Tests of thrombus and haemostasis,实验室检验项目,标准化出血时间测定器法测定（TBT）,血管性血友病因子抗原测定（vWF：Ag） 血管性血友病因子活性测定（vWF：A） 血浆凝血酶调节蛋白抗原测定（TM：Ag） 血浆内皮素-1测定(ET-1) 血浆 6-酮-前列腺素
9、F1测定 （PGI2的降解产物）,诊断试验,实验室检验项目,血管性血友病因子抗原测定（vWF：Ag） 血管性血友病因子活性测定（vWF：A）,实验室检验项目,血小板检测,血小板计数(platelet count,PC) 参考值： （100-300）109/L 检测方法： 显微镜计数 血细胞分析仪,筛检试验,实验室检验项目,血小板相关免疫球蛋白 血小板粘附试验 血小板聚集试验 血小板激活的分子标志物 1、-血小板球蛋白（ -TG） 血小板第4因子（PF4）测定 2、P-选择素 3、血浆血栓烷B2（TXB2）测定,诊断试验,实验室检验项目,（一）血小板相关免疫球蛋白测定 （platelet ass
10、ociated immunoglobulin, PAIg） PAIgG、PAIgM和PAIgA ELISA法测定 PAIg增高，见于ITP、同种免疫性血小板减少性紫 癫及药物免疫性血小板减少性紫癫等。,实验室检验项目,（二）血小板粘附试验,计算： 临床意义： 见于血管性血友病，巨PLT综合征，BM增生，抑制剂使用 见于高凝状态，血栓病,（platelet adhesion test, PAdT）,粘附前PLT,实验室检验项目,（三）血小板聚集试验,原理： 诱聚剂 PRP PAgT 临床意义： 见于血小板无力症，尿毒症，BM增生，plt抑制剂使用 见于高凝状态，血栓病,透光度,ADP，肾上腺素，
11、凝血酶，胶原，花生四烯酸，瑞斯托霉素,（platelet aggregation test, PAgT）,实验室检验项目,Tests of thrombus and haemostasis,（四） 血小板激活的分子标志物 1、-血小板球蛋白（ -TG） 血小板第4因子（PF4）测定 2、P-选择素(P- selectin, GMP-140) 3、血浆血栓烷B2（TXB2）测定,实验室检验项目,凝血功能检测,1.外源性凝血途径的综合检查 血浆凝血酶原时间（Prothrombin Time, PT） 2.内源性凝血途径的综合检查 活化部分凝血活酶时间 （Activated Partial Thro
12、mboplastin Time, APTT）,筛检试验,Sysmex CA7000,Tests of thrombus and haemostasis,实验室检验项目,全自动凝血分析仪,一、血浆凝血酶原时间 （prothrombin time, PT ）,PT延长常见于参与外源性凝血系统的凝血因子缺乏：遗传性因子缺乏、严重肝病、DIC等。,Tests of thrombus and haemostasis,实验室检验项目,全自动凝血分析仪,PT,Tests of thrombus and haemostasis,实验室检验项目,PT结果的报告方式,全自动凝血分析仪,Tests of throm
13、bus and haemostasis,实验室检验项目,国际标准化比值,口服抗凝剂的监测 （INR最好在2.0-2.5）,全自动凝血分析仪,Tests of thrombus and haemostasis,实验室检验项目,PT结果的临床应用,全自动凝血分析仪,Tests of thrombus and haemostasis,APTT延长常见于参与内源性凝血系统的凝血因子缺乏：血友病、DIC、严重肝病等,实验室检验项目,全自动凝血分析仪,二、活化的部分凝血活酶时间 （activated partial thromboplastin time, APTT）,Tests of thrombus
14、and haemostasis,实验室检验项目,全自动凝血分析仪,APTT,APTT结果的临床应用,实验室检验项目,全自动凝血分析仪,Tests of thrombus and haemostasis,纤维蛋白原浓度测定（Fbg) 凝血因子VIII、IX、XI、XII活性测定 凝血因子II、V、VII、X活性测定 凝血因子XIII定性试验 凝血酶生成分子标志物,诊断试验,实验室检验项目,凝血酶生成分子标志物检测原理,F1+2：反映凝血酶生成总量及凝血酶原酶活性 凝血酶原 凝血酶 F1+2 FPA：代表凝血酶生成后对纤维蛋白原水解能力 纤维蛋白原 非连接性纤维蛋白单体 FPA、FPB SFMC：
15、反映凝血酶作用后纤维蛋白单体的形成 TAT：反映凝血酶被抗凝血酶中和的程度,实验室检验项目,Tests of thrombus and haemostasis,凝血酶时间（thrombin time, TT) 甲苯胺蓝纠正试验,病理性抗凝物质的筛检试验,病理性抗凝物质的诊断试验,狼疮抗凝物质测定 抗心磷脂抗体测定,抗凝血酶活性测定( AT) 蛋白C活性测定 游离蛋白S抗原和总蛋白S抗原测定 凝血酶-抗凝血酶复合物测定,生理性抗凝因子检测,实验室检验项目,抗凝系统检测,Tests of thrombus and haemostasis,D-Dimer测定 纤维蛋白（原）降解产物 (FDP) 血浆
16、硫酸鱼精蛋白副凝固试验（3P试验） 优球蛋白溶解时间 组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）测定 纤溶酶原（PLG）活性测定 纤溶酶原激活抑制-1（PAI-1）活性测定 纤溶酶-抗纤溶酶复合物（PAP）测定,纤溶活性检测,实验室检验项目,参考值 小于5mg/L,？ 什麽是FDP,FDP阳性或增高见于,原发性纤溶、DIC、血栓形成及溶栓等。,实验室检验项目,正常值 阴性(乳胶凝集法) 0-256g/L（ELISA法）,？什麽是继发性纤溶 和原发性纤溶,实验室检验项目,D-D阴性是排除深静脉血栓（DVT）和肺血栓栓塞（PE）的重要试验,实验室检验项目,检测项目的选择和应用,Tests of thromb
17、us and haemostasis,一期止血缺陷的筛选试验 二期止血缺陷的筛选试验 纤溶活性亢进性出血筛选试验,常见出血性疾病的实验诊断,一期止血缺陷： 血管壁和血小板异常引起的止血功能缺陷 常见疾病： 血管性紫癜（过敏性紫癜、单纯性紫癜等） 血小板减少症（ITP、 TTP 等） 血小板功能异常（血小板无力症、 巨血小板症、贮存池病等）,检测项目的选择和应用,过敏性紫癜,检测项目的选择和应用,I T P,检测项目的选择和应用,肘关节广泛出血，大鱼际皮下出血,注射部位出血,血 小 板 无 力 症,检测项目的选择和应用,Tests of thrombus and haemostasis,?,原发
18、性血小板增多症 血小板数量增加 vWD 血小板功能异常， 凝血因子缺乏 过敏性紫癜 单纯血管通透性和脆性增加 所致的血管性紫癜 特发性血小板 血小板数量减少 减少性紫癜,TBT PLT TBT PLT TBT PLT TBT PLT,一期止血缺陷,检测项目的选择和应用,二期止血缺陷： 血液凝固和纤溶异常引起的止血功能缺陷 常见疾病： 遗传性血液凝固缺陷（VIII、IX缺陷； 血管性血友病等） 获得性血液凝固缺陷（VitK缺乏、肝病、 抗凝物质增多、DIC等）,检测项目的选择和应用,血 友 病,检测项目的选择和应用,Tests of thrombus and haemostasis,二期止血缺陷
19、,检测项目的选择和应用,XIII,XIII,Tests of thrombus and haemostasis,DIC 肝病 血友病（A、B、C) 遗传性因子缺乏,APTT PT APTT PT APTT PT,?,检测项目的选择和应用,二期止血缺陷,Tests of thrombus and haemostasis,?,FDPs D-D FDPs D-D FDPs D-D FDPs D-D,纤溶亢进筛检,检测项目的选择和应用,检测项目的选择和应用,出血症状,病史和体检,PT，APTT，TBT，PLT计数,PT和APTT正常，TBT和（或）PLT异常,PT和（或）APTT异常 TBT和PLT正
20、常,PT,APTT，TBT，PLT正常,二期止血缺陷,PT延长 APT正常,APTT延长 PT正常,PT,APTT 均延长,外源性凝血途径缺陷,内源性凝血途径缺陷,内源性凝血途径缺陷,提示因子缺陷症（遗传性，获得性）,有出血,无出血,提示缺陷症（遗传性，获得性）,一期止血缺陷,评价PLT数量,X定性试验阳性,提示X缺陷症（遗传性，获得性）,常见出血性疾病 实验室分析,提示因子VIII、IX、XI缺陷症（遗传性，获得性）,提示因子XII，PK,HMWK缺陷症（遗传性，获得性）,检测项目的选择和应用,常见出血性疾病实验室分析,评价PLT数量,PLT减少,PLT正常,PLT增多,提示血小板减少（原发
21、性，继发性）,某些凝血因子缺陷,提示血小板功能缺陷（遗传性，获得性）,提示血小板增多（原发性，反应性）,提示血管性血友病（遗传性，获得性）,提示低（无）纤维蛋白原症（遗传性，或获得性）,医学检验项目选择与临床应用.王兰兰 主编。-北京：人民卫生出版社。2010.3,普通肝素： APTT 首选，控制在正常对照值的 1.5-2.5倍 药物浓度维持 0.2-0.5 IU/ml 体外循环和透析时，用全血凝固时间（ACT） 维持 AT 活性在 80-120% 为宜 LMWH：较大剂量(2500-10000IU)需监测 抗因子Xa活性测定，维持在0.14-0.18单位/ml 二者均需监测血小板,抗凝和溶栓
22、治疗监测,检测项目的选择和应用,口服抗凝剂的监测 PTR 维持在1.5-2.0 INR WHO推荐使用 ，中国人维持在2.0-3.0,检测项目的选择和应用,溶栓治疗监测 1 提示溶栓治疗有效的指标 D-D 明显上升 FDP 明显上升(300mg/L) 2-AP30% Fbg 1.2-1.5g/L TT 正常对照值的 1.5-2.5倍,检测项目的选择和应用,2 提示会发生出血的指标,Fbg 1.0g/L PLT 50x109/L APTT 正常值的2.5倍以上,检测项目的选择和应用,检测项目的选择和应用,Tests of thrombus and haemostasis,血栓前状态 遗传性易栓症
23、：AT、PC、PS缺陷症 抗磷脂综合征 深静脉血栓形成(DVT)和肺栓塞(PE) DIC,常见血栓性疾病的实验诊断,Tests of thrombus and haemostasis,检测项目的选择和应用,血栓前状态（prethrombotic state),vWF增高：内皮细胞损伤； GPIIb/IIIa增高：血小板被激活； SFMC增高：凝血酶活性增强或形成增多； ATIII:A 、PC:A、PS:A减低：凝血酶活性增强； PAI-1和2-AP增高：纤溶酶活性减低,APTT、PT可能缩短； Fg测定可能增高； PAgT的聚集率可能增高； 活化蛋白C抵抗试验阳性。,TM、ET-1增高：血管内
24、皮细胞受损； P-selectin 、11-DH-TXB2增高：血小板被激活； F1+2、FPA增高：凝血酶活性增强或其形成增多； 抗磷脂抗体持续阳性：抗磷脂综合征； TAT增高：凝血酶活性增强；,筛选试验,常用试验,特殊试验,VTE diagnosis why consider D-dimer?,Utility of a diagnostic test in patient management To confirm / rule-in the diagnosis, OR To rule-out the diagnosis D-dimer has a high sensitivity for
25、 VTE D-dimer is raised in virtually all patients presenting with acute VTE Patient with normal D-dimer (I.e. below cut-off) is highly unlikely to have DVT or PE High NPV suitable for rule-out D-dimer has a moderate specificity for VTE Activation of coagulation and fibrinolysis also occurs in a varie
26、ty of other disorders Low PPV NOT suitable for rule-in,“To safely exclude PE, the sensitivity should approach 100% because for every 2% decrease in sensitivity, 1 per 1000 patients studied will die of recurrent PE as a result of inappropriately withholding anticoagulant therapy” Kruip, et al. Arch I
27、ntern Med 2002; 162: 1631-5.,实验室检验项目,Tests of thrombus and haemostasis,检测项目的选择和应用,DIC,disseminated intravascular coagulation 是一种发生在感染、外科手术或创伤、恶性肿瘤、产科意外等许多疾病基础上，由致病因素激活凝血系统，导致全身微血栓形成，凝血因子被大量消耗并继发纤溶亢进，引起全身出血的综合征。 发病早期凝血系统功能亢进，高凝状态/血小板聚集和血栓形成;其后消耗大量凝血因子；继发性纤溶亢进。 临床表现为出血、栓塞、微循环障碍及溶血等。 诊断根据病人的临床资料和实验室检查综
28、合判断。,检测项目的选择和应用,显性DIC的积分诊断,0,Plt(109/L）,1,2,3,100,100,50,sFMC/FDP,未增高,中度增高,重度增高,PT,未延长延长3s,延长6s,延长3-6s,Fg(g/L),1.0,1.0,易致DIC的原发疾病,无,有,积分,累计积分诊断,5，显性DIC, 5， 2，非显性DIC,检测项目的选择和应用,非显性DIC的积分诊断,0,Plt(109/L）,1,2,3,100,100,sFMC/FDP,正常,降低,PT,未延长或延长3s,缩短,延长3s,易致DIC的原发疾病,无,有,积分,累计积分诊断：,判断病情进展情况,进行性下降,稳定,上升,-1,
29、稳定,进行性延长,增高,稳定,进行性增高,AT,正常,降低,PC,正常,降低,TAT,正常,升高,F1+2、PAP,正常,异常,主要的易栓症,检测项目的选择和应用,检查项目及检测时机,1. 检测项目 抗凝血因子系列（包括抗凝血酶、蛋白C、蛋白S）、 活化蛋白C抵抗性、 因子V Leiden 突变和凝血酶原G20210A突变、 狼疮抗凝物和抗磷脂抗体。 同型半胱氨酸、因子VIII水平等。 2. 检测时机 血栓发作急性期和抗凝治疗（抗血栓治疗）期间不宜做化验检查， 病情稳定后6个月或者停止药物治疗后3周才可进行检查。,检测项目的选择和应用,分析前质量控制,患者准备,标本采集,医生申请,标本运送,止
30、凝血检查的分析前质量管理,1.根据病史、体格检查等，按照一定的临床思维，有步骤有顺序地选择 2.先筛查,再确诊;先易后难;力求简单、快速,切忌“大撒网”,止凝血检查的分析前质量管理,医生正确选择检验项目,(1)指导患者做好采集前准备 (2)凝血标本采集注意事项,护士正确采集标本,止凝血检查的分析前质量管理,注意事项 1. 正确的采血器具和采集顺序,（1）更能稳定V、VIII因子 （2）抗凝血对肝素敏感性高，适合APTT （3）推荐 3.2%（0.109M）浓度 （4）正常血细胞压积下，血液：抗凝剂 = 9：1 （5）与HEPES组成缓冲抗凝剂，适合冻存标本的分析，可有效保持pH值、V因子活性，
31、 89.25g/L HEPES+38.03g/L枸橼酸钠,枸橼酸钠：,止凝血检查的分析前质量管理,蝶翼针因为有延长胶软管的关系，血液要经过比双向直针相对长很多的时间和途径才能进入蓝头管，增加激活血小板的机会,止凝血检查的分析前质量管理,采血针 - 双向直针,- 可以避免类似蝶翼采血针延长软管发生的死腔问题,止凝血检查的分析前质量管理,CLSI 国际标准的采血顺序建议,细菌培养,凝血测试,血清管 （有/ 没有促凝剂）,肝素血浆管,EDTA管,血糖管,蝶翼采血针,蝶翼针延长胶软管的死腔,伪管 / 弃置管,止凝血检查的分析前质量管理,注意事项2：采集后要立即充分混匀,抗凝标本采集后需立即轻轻颠倒混匀
32、6-8次，保证标本与抗凝剂充分混匀,血液标本采集常见错误,1、混匀次数不足 2、未立即混匀 2、未充分混匀 3、用力过大导致细胞破坏,采血后处理不当 未充分摇匀 明显凝块， 小的纤维蛋白丝 血小板聚集 剧烈震荡 溶血 细胞破裂,止凝血检查的分析前质量管理,凝血四项 血球压积正常时，严格采血至刻度线！ 血液与抗凝剂按9：1比例混合，实际是指抗凝剂与正常压积血浆之间的比例而言 应根据患者红细胞比积(Hct)状况调整抗凝剂用量,注意事项3：按规定的采血量采血,止凝血检查的分析前质量管理,实例,抗凝剂与血液比例对结果的影响,标本采集常见错误: 未按规定的采血量采血,止凝血检查的分析前质量管理,抗凝剂的
33、校正方法,当血细胞压积（Hct）小于20%或大于50%时， 抗凝剂用量=0.00185血量(ml)(100-病人红细胞压积） 血量=抗凝剂用量/（100-病人红细胞比积) 0.00185,方法：公式计算,止凝血检查的分析前质量管理,注意事项3：注意采血位置问题,采血位置问题 在各种留置的通道内采血 稀释 抗凝剂污染 通道内液体干扰测定 静脉滴注至少 4h 后抽血， 8h 后再抽血更适宜 充分了解可能存在的污染，了解各预留口的作用及液体流向,止凝血检查的分析前质量管理,PT：14.2 s PT%：70.0 % INR：1.17 R Fbg ： 2.278 g/L APTT： 79.1 s TT：
34、 67.2 s ,患者凝血功能检查：,致电临床医生：喂，你好，请问患者是否在做抗凝或溶栓治疗，是否有出血表现？,患者是抗凝或溶栓患者吗？,核对既往，无凝血指标延长,复查,实例,止凝血检查的分析前质量管理,注意事项4 : 熟练的采血技术,穿刺技术及规范的问题 止血带捆绑时间过长,捆扎时间最好在1min内，不超过2min,标本采集常见错误:,止凝血检查的分析前质量管理,穿刺不顺利，反复进针出针 选择较粗静脉 21G 1.5或20G1.5针头，“一针见血” 反复拍打 激活血管内凝血，影响凝血结果 引起血管收缩，红细胞破坏，溶血，皮下血肿,止凝血检查的分析前质量管理,注意事项5 : 避免标本溶血,溶血
35、常见原因 原因1：由于真空管内负压较大，采血初始，血液流入管底速度快，红细胞相互撞击可致破裂，泡沫增多，临床偶见溶血。 原因2：由于普通真空管使用广泛，设定负压较大，如果采集标本量与试管内设定的压力差值较大，试管内仍然残留较大的负压，导致溶解在血液中的气体溢出，造成红细胞膨胀破裂，引起溶血 原因3：如果用碘伏消毒，在碘伏未干的情况下就进行穿刺，标本可能会发生溶血 原因4：使用注射器采血，采血后不去针头，不去试管盖，将血液打入试管，细胞受外力作用而溶血 原因5：针尖在静脉中或静脉内外探来探去，造成血肿和溶血 原因6：针头与针管连接不紧，采血时空气进入而产生气泡 原因7：混匀含添加剂的试管时用力过
36、猛，或运输时振动和摇晃 原因8：采血量不足，抗凝剂多而致细胞外渗透压增高。,止凝血检查的分析前质量管理,标本的正确保存和运送,加盖尽快送检。避免剧烈震荡和日光直射 一般情况下，室温保存不超过2h，2-4不超过4h，-20不超过2周， -70不超过6月 冻存标本 37 快速复溶，轻轻颠倒混匀备用,止凝血检查的分析前质量管理,不同条件下保存血浆对因子，的影响,止凝血检查的分析前质量管理,不同条件保存下对APTT的影响,4,20,32,止凝血检查的分析前质量管理,分析中检验质量控制,仪器 试剂 操作程序 溯源和校准 室内质控 室间质评 结果比对 参考范围验证,止凝血检查的分析中质量管理,分析后检验质量控制,检验结果的合理应用 检验结果的解释和咨询,止凝血检查的分析后质量管理,分析实验结果注意的问题,1.发挥检验医师职能，协助临床医生按照血栓性疾病的诊断思维合理选择的凝血检查试验组合 2.血栓试验的参考值均有较大的生理波动范围,个体之间差异亦较大, 试验项目最好动态监测，可能更早发现病情,尤其是对于DIC的早期诊断 3.加强实验室与临床沟通，结合病情充分利用好检验信息，开展临床血栓与止血领域科研合作,止凝血检查的分析后质量管理,Thanks!,
