1、 第一节第一节 免疫细胞的分类与分离免疫细胞的分类与分离一、免疫细胞的种类与特征二、免疫细胞的分离技术三、细胞的冻存与复苏一、免疫细胞的特征一、免疫细胞的特征1、免疫细胞的形态学特征 理化性状 生物学特性2、免疫细胞的膜分子特征 CD分子NK cells吞噬溶酶体1 1、密度梯度离心法、密度梯度离心法2 2、黏附分离法、黏附分离法3 3、荧光激活分离法、荧光激活分离法4 4、磁性分离法、磁性分离法5 5、其他分离法、其他分离法1、密度梯度离心法、密度梯度离心法聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F/H)分层液pFicollFicoll是蔗糖的多聚体，呈中性，亲水性高，平均分
2、子量为是蔗糖的多聚体，呈中性，亲水性高，平均分子量为400,000400,000，当密度为，当密度为1.2g/ml1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压，也不仍未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。穿过生物膜。p红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。液面的细胞，就可从外周血中分离到单
3、个核细胞。离心前离心前离心后离心后稀释抗凝血稀释抗凝血淋巴细胞分离液淋巴细胞分离液血浆血浆单个核细胞单个核细胞粒细胞粒细胞红细胞红细胞2 2、黏附分离法、黏附分离法-纯淋巴细胞群的分纯淋巴细胞群的分离离2、黏附分离法：淋巴细胞亚群的分离 T细胞得率为20-30%左右。3、荧光激活分离法（FACS）流式细胞仪流式细胞仪MACS(阳性选择法）阳性选择法）NSMACS(阴性选择法）阴性选择法）NS5、其他分离法、其他分离法花环沉降法：本法是将淋巴细胞与一定比例的绵羊红细胞混合，待淋巴细胞形成E花环后，继用淋巴细胞分层液分离细胞。浮悬在分层界面而不形成E花环的群则富含B细胞，而沉降在管底的形成E花环的
4、细胞用低渗法处理，使围绕细胞周围的绵羊红细胞快速裂解，则获得纯的T细胞。可溶性MHC-肽四聚体法：mhc-肽四聚体复合物的原理是通过增强t细胞受体与mhc-肽复合物亲和力，达到可直接特异性检测t细胞的目的。p作为临床诊断工具，定量检测外周血及组织中抗原特异性CTLs的比率，并进行表型及功能分析。p用于过继性肿瘤免疫治疗 p用于疫苗疗效的监测抗原肽抗原肽-MHC分子四聚体技术分子四聚体技术T三、细胞的冻存与复苏三、细胞的冻存与复苏细胞冻存罐细胞冻存罐1 1、免疫标记检测方法、免疫标记检测方法 荧光抗体法荧光抗体法 酶免疫检测法酶免疫检测法 免疫金银染色法免疫金银染色法2 2、补体依赖的细胞毒试验
5、（、补体依赖的细胞毒试验（CDCCDC）3 3、花环形成试验、花环形成试验SmIg的荧光抗体检测法的荧光抗体检测法SmIg的酶免疫检测法的酶免疫检测法补体依赖的细胞毒试验补体依赖的细胞毒试验（CDC）染料补体利用利用T细胞膜上的异种动物红细胞受体细胞膜上的异种动物红细胞受体T细胞B细胞花环形成细胞绵羊红细胞1、淋巴细胞转化试验：刺激物分为非特异性（如植物血凝素、刀豆素A等）和特异性刺激因子（如抗原）；检测方法为形态学检测法和3H-TdR掺入法及MTT法等。2、混合淋巴细胞培养：混合淋巴细胞培养(MLC)或称混合淋巴细胞反应(MLR)常用于器官移植前的组织配型，以测定受体和供体主要组织相容性抗原
6、(HLA抗原)相容的程度。由于MLC中淋巴细胞接受同种异型抗原的刺激而发生活化、增殖，产生种类众多的细胞因子，促进NK、LAK和CTL等杀伤细胞的分化，因此又是免疫调节研究中常用的实验模型。放射性测定放射性测定3H-TdR丝裂原（抗原）刺激淋淋巴巴细细胞胞转转化化试试验验原原理理示示意意小淋巴细胞在转化为原始母细胞过程中，合成小淋巴细胞在转化为原始母细胞过程中，合成DNADNA增加，能增加，能够吸收胸腺嘧啶核苷（够吸收胸腺嘧啶核苷（3H3H）放射性测定细胞毒试验原理示意靶细胞效应细胞分离上清2 2、K K细胞活性测定（细胞活性测定（ADCCADCC活性测定）活性测定）v动物机体有些免疫细胞，通
7、过抗体依赖细胞介导抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（的细胞毒作用（ADCCADCC）杀伤靶细胞，如NK细胞、活化的T细胞、吞噬细胞等，这类细胞统称为K细胞。vK细胞的活性不仅反映机体细胞免疫的能力，而且与体液免疫也有直接的关系。vK细胞活性检测的方法有同位素释放试验法，溶血空斑法，细胞剥离法和靶细胞接合试验。仅介绍同位素释放法。（1 1）原理）原理v将靶细胞用51Cr标记后，再与特异性的IgG抗体结合，加入K细胞后即可发生ADCC效应，引起靶细胞的溶解并释放51Cr。用计数仪分别检测上清和细胞沉淀中的cpm，根据上清中释放的51Cr的多少，可判断K细胞活性的高低。（2 2）方法）方法v 1、试验管
8、：效应细胞(淋巴细胞悬液)，标记的靶细胞(Cr51标记的鸡红细胞)和亚凝集单位的抗体(兔抗鸡红细胞抗体)各0.1ml，加RPMI 1640完全培养基1.7ml（ADCC）。v 2、效应细胞对照管：效应细胞和标记的靶细胞各0.1ml加上述完全培养基1.8ml（未加抗体）。v 3、抗体对照管：标记的靶细胞和亚凝集单位的抗体各0.1ml，加完全培养基1.8ml（未加效应细胞）。v 4、最大释放对照管：标记的靶细胞0.1ml 加蒸馏水 1.9ml（靶细胞会裂解，完全释放同位素）。v 5、自然释放管：标记的靶细胞0.1ml，加完全培养基1.9ml（靶细胞不裂解，但可自然释放一定量的同位素）。v 以上各管
9、均置37520h后，2500g离心10min，分别取各管上清夜1.0ml置于5支试管中，用计数仪测各管上清和沉淀中的cpm值。（3 3）结果判断和计算）结果判断和计算v 51Cr实验释放率（%）2(上清cpm本底cpm)100%(上清cpm-本底cpm)(沉淀cpm-本底cpm)v 51Cr 特异释放率（%）试验释放率自然释放率 100%最大释放率自然释放率 3 3、NKNK细胞活性测定细胞活性测定vNK细胞是具有天然杀伤靶细胞活性的淋巴样细胞，其杀伤作用不需要抗体、补体的参加，所杀伤靶细胞通常指肿瘤细胞和病毒感染或转化的细胞。这样，可以将来源于同种动物的肿瘤细胞系或病毒转化的细胞系，作为检测
10、NK细胞活性的指示细胞。vNK细胞活性测定多采用51Cr释放法试验，其原理同细胞毒性T细胞试验中所采用的51Cr释放法试验。在这里以检测小鼠脾脏NK细胞活性为例，说明本试验方法。用3H-TdR掺入法，靶细胞为YAC-1细胞株（小鼠淋巴瘤细胞系）。v（1）试剂 v小鼠脾细胞悬液:分离单个脾脏细胞-裂解红细胞-淋巴细胞洗涤配置悬液（1640完全培养基2106/ml）。v标记的靶细胞：活淋巴细胞（96%以上）加入H3-Tdr-孵育2小时/每30min振摇-洗3次-配成2106/ml悬液。v（2）方法 v 试验组孔：脾细胞悬液(淋巴细胞)：标记的靶细胞悬液100:1左右；v 对照组：单纯加标记的靶细胞
11、。v 37 5%CO2培养18小时（NK细胞杀伤靶细胞）；v 每孔加终浓度为0.15%的胰酶和0.0125%DNA酶37处理30min（消化细胞和处理掉死亡靶细胞释放出来的放射性DNA）。v 各孔细胞收集后依次通过生理盐水，5%三氯乙酸和无水乙醇（获得了存活的靶细胞的标记DNA）。v 待滤膜干燥后用液闪计数仪测定cpm值。v 三、结果计算 v NK细胞活性以特异性杀伤率表示：特异性杀伤率（%）（1试验组cpm/对照组cpm）100%1、直接溶血空斑试验2、间接溶血空斑试验3、SPA-SRBC溶血空斑试验三、抗体形成试验三、抗体形成试验1 1、直接溶血空斑试验、直接溶血空斑试验2 2、间接溶血空
12、斑试验、间接溶血空斑试验3 3、SPA-SRBCSPA-SRBC溶血空斑试验溶血空斑试验1、细胞吞噬功能试验2、细胞杀菌功能试验细胞吞噬与杀伤功能试验细胞吞噬与杀伤功能试验吞噬百分率 =吞有颗粒的吞噬细胞数计数的吞噬细胞数吞噬指数 =吞噬细胞吞噬的总颗粒数计数的吞噬细胞数NBT还原试验还原试验原理：N-N-C +H+N=N-R-N-NH2C N=NH四氮唑基（淡黄色）甲月簪基（紫黑色）NBT还原试验还原试验方法：1、抗凝血+硝基蓝四氮唑（NBT），37。C孵育25min。2、推片染色、镜检。正常值：NBT阳性细胞 7.5-15%第四节第四节 免疫细胞凋亡测定免疫细胞凋亡测定一、细胞凋亡的概念与
13、原理二、细胞凋亡的检测方法 1 1、细胞凋亡（、细胞凋亡（apoptosisapoptosis）细胞在内源性基因调控下发生的主动死亡过程，也称程序性死亡。v虽然凋亡与坏死的最终结果极为相似，但它们的过程与表现却有很大差别。v坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。表现为细胞 胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢，DNA降解不充分，引起局部严重的炎症反应。v凋亡是细胞对环境的生理性病理性刺激信号，环境条件的变化或缓和性损伤产生的应答有序变化的死亡过程。其细胞及组织的变化与坏死有明显的不同。凋亡凋亡坏死坏死机制机制基因调控的程序化细胞死亡，基
14、因调控的程序化细胞死亡，主动进行（自杀性）主动进行（自杀性）意外事故性细胞死亡，被动进行意外事故性细胞死亡，被动进行（他杀性）（他杀性）诱因诱因生理性或轻微病理性刺激因子生理性或轻微病理性刺激因子诱导发生，如生长因子缺乏诱导发生，如生长因子缺乏病理性刺激因子诱导发生，如缺氧、病理性刺激因子诱导发生，如缺氧、感染、中毒感染、中毒死亡范围死亡范围多为散在的单个细胞多为散在的单个细胞多为聚集的大片细胞多为聚集的大片细胞形态特征形态特征细胞固缩，核染色质边集，细细胞固缩，核染色质边集，细胞膜及各细胞器膜完整，膜可胞膜及各细胞器膜完整，膜可发泡成芽，形成凋亡小体发泡成芽，形成凋亡小体细胞肿胀，核染色质絮
15、状或边集，细胞肿胀，核染色质絮状或边集，细胞膜及各细胞器膜溶解破坏，溶细胞膜及各细胞器膜溶解破坏，溶酶体酶释放，细胞自溶酶体酶释放，细胞自溶生化特征生化特征耗能的主动过程，有新蛋白合耗能的主动过程，有新蛋白合成，成，DNADNA早期规律降解为早期规律降解为180-180-200bp200bp片段，琼脂凝胶电泳呈片段，琼脂凝胶电泳呈特征性梯带状特征性梯带状不耗能的被动过程，无新蛋白合成，不耗能的被动过程，无新蛋白合成，DNADNA降解不规律，片段大小不一，降解不规律，片段大小不一，琼脂凝胶电泳不呈梯带状琼脂凝胶电泳不呈梯带状周围反应周围反应不引起周围组织炎症反应和修不引起周围组织炎症反应和修复再
16、生，但凋亡小体可被邻近复再生，但凋亡小体可被邻近细胞吞噬细胞吞噬引起周围组织炎症反应和修复再生引起周围组织炎症反应和修复再生 2、细胞凋亡的原理、细胞凋亡的原理 细胞凋亡机制细胞凋亡机制（动画）（动画）细胞凋亡细胞凋亡1、形态观察法：2、生化检测法：3、流式细胞仪检测法 2、生化检测法、生化检测法（1）凝胶电泳法）凝胶电泳法 提取总DNA DNA凝胶电泳 观察DNA ladder现象v 凝胶电泳特点（2）原位末端标记法（）原位末端标记法（TUNEL）原理：利用标记的dUTP，在TdT作用下结合DNA断片的3末端羟基，显示断链DNA，提示凋亡方法：制备组织切片 标记物结合 标记物显色 镜检v TUNEL染色：（3）二苯胺分光光度法）二苯胺分光光度法凋亡百分率 =上清液OD值上清液OD值+沉淀OD值3 3、流式细胞仪法、流式细胞仪法原理：PI标记凋亡细胞，通过FACS可显示凋亡细胞的特征性亚二倍体峰。并可经计算分析得出凋亡百分率。方法：制备细胞悬液 PI染色 FACS检测 二、细胞凋亡的检测方法二、细胞凋亡的检测方法本章小结本章小结1、免疫细胞的类型与分离技术2、细胞的冻存与复苏3、免疫细胞膜分子的检测原理与方法4、免疫细胞功能测定的原理与方法
