1、第六章蛋白质和DNA技术【考纲考情【考纲考情】最新考纲及要求三年考情(以山东高考卷为例)20142014年20132013年20122012年蛋白质的提取和分离无无无PCRPCR技术的基本操作和应用T35T35非选择题无无【知识梳理【知识梳理】考点一考点一 血清蛋白的提取和分离血清蛋白的提取和分离1.1.方法及原理：方法及原理：(1)(1)方法：电泳法。方法：电泳法。(2)(2)原理：原理：各种蛋白质分子带电性质的差异；各种蛋白质分子带电性质的差异；分子本身大小、形状的不同。分子本身大小、形状的不同。2.2.实验操作程序：实验操作程序：(1)(1)点样：用微量加样器取新制血清，小心加到电泳样品
2、槽的胶面点样：用微量加样器取新制血清，小心加到电泳样品槽的胶面上。上。(2)(2)电泳：打开并调节稳压稳流电泳仪进行电泳。电泳：打开并调节稳压稳流电泳仪进行电泳。(3)(3)染色：用质量分数为染色：用质量分数为0.05%0.05%的考马斯亮蓝的考马斯亮蓝R R250250染色液对凝胶进行染色液对凝胶进行染色。染色。(4)(4)脱色：用体积分数为脱色：用体积分数为7%7%的醋酸溶液脱色。的醋酸溶液脱色。(5)(5)制干胶板：保存液浸泡凝胶板后，放在两层透气玻璃纸中间自制干胶板：保存液浸泡凝胶板后，放在两层透气玻璃纸中间自然干燥。然干燥。【高考警示【高考警示】(1)(1)电泳时，带电的颗粒向与其电
3、性相反的电极方向移动。电泳时，带电的颗粒向与其电性相反的电极方向移动。(2)(2)电泳时，蛋白质所带的电荷数越多，移动得越快；电荷数相同电泳时，蛋白质所带的电荷数越多，移动得越快；电荷数相同时，分子量越小，则移动越快。时，分子量越小，则移动越快。考点二考点二 DNADNA片段的扩增片段的扩增1.1.细胞内细胞内DNADNA复制与复制与PCRPCR技术的比较：技术的比较：项目DNADNA复制PCRPCR扩增不同点场所细胞内细胞外能量ATPATP提供能量不需ATPATP提供能量酶解旋酶、DNADNA聚合酶耐高温的TaqDNATaqDNA聚合酶是否有转录伴有转录，产生引物无转录，需加入两种引物特点边
4、解旋边复制，半保留复制体外迅速扩增循环次数受生物体自身控制3030多次缓冲液不需要需要人为控制设备无严格控制温度变化的温控设备项目DNADNA复制PCRPCR扩增相同点原料四种脱氧核苷酸复制原理严格遵循碱基互补配对原则模板DNADNA为模板引物都需要与模板相结合的引物2.PCR2.PCR技术反应过程中控制不同温度的意义：技术反应过程中控制不同温度的意义：(1)95(1)95变性，双链变性，双链DNADNA解旋为单链。解旋为单链。(2)55(2)55复性，引物与两条单链复性，引物与两条单链DNADNA结合。结合。(3)72(3)72延伸，耐高温的延伸，耐高温的DNADNA聚合酶有最大活性，使聚合
5、酶有最大活性，使DNADNA新链由新链由55端端向向33端延伸。端延伸。【高考警示【高考警示】PCRPCR技术的一个循环包括高温变性、低温复性和中温延伸三个步骤；技术的一个循环包括高温变性、低温复性和中温延伸三个步骤；每一循环中每一循环中DNADNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNADNA序列，序列，使这段固定长度的序列呈指数增长。使这段固定长度的序列呈指数增长。类型一类型一 蛋白质的提取和分离蛋白质的提取和分离【典例【典例1 1】(2015(2015济南模拟济南模拟)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成
6、分，负责血液中主要组成成分，负责血液中O O2 2和部分和部分COCO2 2的运输。请根据血红蛋白的的运输。请根据血红蛋白的提取和分离回答问题：提取和分离回答问题：(1)(1)凝胶色谱法的基本原理是根据凝胶色谱法的基本原理是根据_分离蛋白质的有效方法。分离蛋白质的有效方法。(2)(2)洗涤红细胞的目的是去除洗涤红细胞的目的是去除_，洗涤次数过少，无法除去，洗涤次数过少，无法除去_；离心速度过高和时间过长会使；离心速度过高和时间过长会使_等一同沉等一同沉淀，达不到分离的效果。洗涤干净的标志是淀，达不到分离的效果。洗涤干净的标志是_。释放血红蛋白的过程中起作用的是。释放血红蛋白的过程中起作用的是_
7、。(3)(3)洗脱的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体洗脱的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体_(_(填填“相同相同”或或“不同不同”)，洗脱时，对洗脱液的流速要求是，洗脱时，对洗脱液的流速要求是_。(4)(4)在洗脱过程中加入物质的量浓度为在洗脱过程中加入物质的量浓度为20 mmol20 mmol/L/L的磷酸缓冲液的磷酸缓冲液(pH(pH为为7.0)7.0)的目的是的目的是_，如果红色区带，如果红色区带_，说明色谱柱制作成功。，说明色谱柱制作成功。【解题指南【解题指南】(1)(1)关键词：关键词：“洗涤红细胞洗涤红细胞”“”“离心速度离心速度”“”“释放血红释放血红蛋白蛋白”。(2)(2)隐含信息
8、：红色区带为血红蛋白。隐含信息：红色区带为血红蛋白。【解析【解析】(1)(1)凝胶色谱法是根据蛋白质的相对分子质量大小分离蛋白凝胶色谱法是根据蛋白质的相对分子质量大小分离蛋白质的有效方法。质的有效方法。(2)(2)洗涤红细胞的目的是去除血浆蛋白等杂蛋白，如果洗涤次数过少，洗涤红细胞的目的是去除血浆蛋白等杂蛋白，如果洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白；离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，无法除去血浆蛋白；离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。洗涤干净的标志是离心后的上清液中没有黄色。达不到分离的效果。洗涤干净的标志是离心后的上清液中没有黄色。释放血红蛋白的过程中起作用
9、的是蒸馏水和甲苯，其中蒸馏水的作用释放血红蛋白的过程中起作用的是蒸馏水和甲苯，其中蒸馏水的作用是使红细胞吸水破裂，甲苯可溶解细胞膜，加入甲苯能加速红细胞破是使红细胞吸水破裂，甲苯可溶解细胞膜，加入甲苯能加速红细胞破裂并释放血红蛋白。裂并释放血红蛋白。(3)(3)洗脱的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体相同，否则会影响洗脱洗脱的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体相同，否则会影响洗脱液的液的pHpH，使蛋白质的结构受到破坏。洗脱时，洗脱液的流速要保持稳，使蛋白质的结构受到破坏。洗脱时，洗脱液的流速要保持稳定，否则将影响蛋白质的分离效果。定，否则将影响蛋白质的分离效果。(4)(4)在洗脱过程中加入物质的量浓
10、度为在洗脱过程中加入物质的量浓度为20 mmol20 mmol/L/L的磷酸缓冲液的磷酸缓冲液(pH(pH为为7.0)7.0)的目的是准确模拟生物体内的生理环境，保持体外的的目的是准确模拟生物体内的生理环境，保持体外的pHpH和体内的和体内的一致，进而保持蛋白质的正常形态结构；洗脱时，血红蛋白的颜色可一致，进而保持蛋白质的正常形态结构；洗脱时，血红蛋白的颜色可以指示血红蛋白的位置，因此当红色区带均匀一致地移动时，说明色以指示血红蛋白的位置，因此当红色区带均匀一致地移动时，说明色谱柱制作成功。谱柱制作成功。答案：答案：(1)(1)相对分子质量的大小相对分子质量的大小(2)(2)杂蛋白杂蛋白(血浆
11、蛋白血浆蛋白)血浆蛋白白细胞离心后的上清液中没有血浆蛋白白细胞离心后的上清液中没有黄色蒸馏水和甲苯黄色蒸馏水和甲苯(3)(3)相同保持稳定相同保持稳定(4)(4)准确模拟生物体内的生理环境，保持体外的准确模拟生物体内的生理环境，保持体外的pHpH和体内的一致均和体内的一致均匀一致地移动匀一致地移动【延伸探究【延伸探究】在血红蛋白的提取过程中，哪些过程能影响血红蛋白提在血红蛋白的提取过程中，哪些过程能影响血红蛋白提取的纯度？取的纯度？提示：提示：细胞的洗涤次数：次数少，不能除去血浆蛋白。细胞的洗涤次数：次数少，不能除去血浆蛋白。离心速度和时间：离心速度过高和时间过长，会使白细胞等一同沉离心速度和
12、时间：离心速度过高和时间过长，会使白细胞等一同沉淀，得不到纯净的红细胞。淀，得不到纯净的红细胞。透析：透析不彻底，会含有小分子杂质。透析：透析不彻底，会含有小分子杂质。色谱柱的装填：不能存在气泡，若存在气泡，则会降低分离效果。色谱柱的装填：不能存在气泡，若存在气泡，则会降低分离效果。洗脱：洗脱液的流速要保持稳定，否则将影响蛋白质的分离效果。洗脱：洗脱液的流速要保持稳定，否则将影响蛋白质的分离效果。【加固训练【加固训练】红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成的，血红蛋白的主要功能是携带红蛋白完成的，血红蛋白的主要功能是携带O O2
13、2或或COCO2 2，我们可以选用，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题：白，请回答下列有关问题：(1)(1)实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。加入柠檬酸钠的目的是加入柠檬酸钠的目的是_。以上所述的过程即是样品处理，它包括以上所述的过程即是样品处理，它包括_、_、收集血红蛋白溶液。、收集血红蛋白溶液。(2)(2)收集的血红
14、蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离。粗分离。透析的目的是透析的目的是_。透析的原理是透析的原理是_。【解析【解析】本题主要考查蛋白质分离与鉴定的基本原理及实验流程。本题主要考查蛋白质分离与鉴定的基本原理及实验流程。柠檬酸钠属于抗凝剂，血红蛋白是红色含铁的蛋白质。柠檬酸钠属于抗凝剂，血红蛋白是红色含铁的蛋白质。答案：答案：(1)(1)防止血液凝固防止血液凝固红细胞的洗涤血红蛋白的释放红细胞的洗涤血红蛋白的释放(2)(2)去除相对分子质量较小的杂质去除相对分子质量较小的杂质透析袋能使小分子自由进出，而大分子则保留在袋内透析袋能使
15、小分子自由进出，而大分子则保留在袋内类型二类型二 PCRPCR扩增扩增DNADNA技术技术【典例【典例2 2】(2011(2011江苏高考江苏高考)请回答基因工程方面的有关问题：请回答基因工程方面的有关问题：(1)(1)利用利用PCRPCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNADNA复制类似复制类似(如图所如图所示示)。图中引物为单链图中引物为单链DNADNA片段，它是子链合成延伸的基础。片段，它是子链合成延伸的基础。从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A A的的DNADNA片段所占的比片段所占的比例为例为_。在第在第_轮
16、循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNADNA片段。片段。(2)(2)设计引物是设计引物是PCRPCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标只标注了部分碱基序列注了部分碱基序列)都不合理都不合理(如图如图)，请分别说明理由。，请分别说明理由。第第1 1组：组：_；第第2 2组：组：_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _。(3)PCR(3)PCR反应体系中含有热稳定反应体系中含有热稳定DNADNA聚合酶，下面的表达式不能正确反聚合酶，下面的表达式不能正确反映映DNADNA聚合酶
17、的功能，这是因为聚合酶的功能，这是因为_。(4)(4)用限制酶用限制酶EcoRVEcoRV、MboMbo单独或联合切割同一种质粒，得到的单独或联合切割同一种质粒，得到的DNADNA片片段长度如下图段长度如下图(1 kb(1 kb即即1 0001 000个碱基对个碱基对)，请在质粒上画出，请在质粒上画出EcoRVEcoRV、MboMbo的切割位点。的切割位点。【解题指南【解题指南】解答本题应特别关注以下两个方面：解答本题应特别关注以下两个方面：(1)(1)明确明确PCRPCR技术中引物的设计原则。技术中引物的设计原则。(2)(2)明确不同限制性内切酶的切割位点不同。明确不同限制性内切酶的切割位点
18、不同。【解析【解析】(1)(1)从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A A的的DNADNA片片段所占的比例为段所占的比例为15/1615/16。在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的苷酸链等长的DNADNA片段。片段。(2)(2)某同学设计的两组引物某同学设计的两组引物(只标注了部分碱只标注了部分碱基序列基序列)都不合理，原因都不合理，原因引物引物和引物和引物局部发生碱基互补配对而局部发生碱基互补配对而失效。失效。引物引物 自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。(3)
19、DNA(3)DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNADNA片段的引物片段的引物链上。链上。答案：答案：(1)(1)15/1615/16三三(2)(2)引物引物和引物和引物局部发生碱基互补配对而失效局部发生碱基互补配对而失效引物引物自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效(3)DNA(3)DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNADNA片段的引物片段的引物链上链上(4)(4)见图见图【延伸探究【延伸探究】(1)(1)上题上题(1)(1)中变性、复性、延伸需要的
20、温度分别是多少？中变性、复性、延伸需要的温度分别是多少？提示：提示：9595、5555、7272。当温度上升到。当温度上升到9090以上时，双链以上时，双链DNADNA解聚解聚为单链，称之为变性；当温度下降到为单链，称之为变性；当温度下降到5050左右时，两种引物通过碱基左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链互补配对与两条单链DNADNA结合；当温度上升到结合；当温度上升到7272左右时，溶液中的左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸在四种脱氧核苷酸在TaqDNATaqDNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的成新的DNADNA链，称为延伸。链，称为延
21、伸。(2)PCR(2)PCR一般要经过三十多次循环，从第二轮循环开始，上一次循环的一般要经过三十多次循环，从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，由引物产物也作为模板参与反应，由引物A A延伸而成的延伸而成的DNADNA单链作为模板时将单链作为模板时将如何延伸？如何延伸？提示：提示：与引物与引物B B结合进行结合进行DNADNA子链的延伸。当引物子链的延伸。当引物A A延伸而成的单链作延伸而成的单链作模板时，此单链引物端为模板时，此单链引物端为55端，因此与它互补的子链应从另一端开始端，因此与它互补的子链应从另一端开始合成，即由引物合成，即由引物B B结合延伸的子链。结合延伸的子
22、链。【加固训练【加固训练】PCR(PCR(聚合酶链式反应聚合酶链式反应)技术是一项在生物体外复制特定技术是一项在生物体外复制特定的的DNADNA片段的核酸合成技术。请分析回答下列有关问题：片段的核酸合成技术。请分析回答下列有关问题：(1)PCR(1)PCR技术能把某一技术能把某一DNADNA片段进行扩增，依据的原理是片段进行扩增，依据的原理是_。(2)(2)通过分析得出新合成的通过分析得出新合成的DNADNA分子中，分子中，A=TA=T，C=GC=G，这个事实说明，这个事实说明DNADNA分子的复制遵循分子的复制遵循_原则。原则。(3)(3)若将若将1 1个个DNADNA分子拷贝分子拷贝101
23、0次，则需要在缓冲液中至少加入次，则需要在缓冲液中至少加入_个引物。个引物。(4)DNA(4)DNA子链复制的方向是子链复制的方向是_，这是由于，这是由于_。【解析【解析】(1)PCR(1)PCR技术又称聚合酶链式反应，扩增过程中遵循的原理就技术又称聚合酶链式反应，扩增过程中遵循的原理就是是DNADNA复制。复制。(2)(2)分析得出新合成的分析得出新合成的DNADNA分子中，分子中，A=TA=T，C=GC=G，这个事实说明，这个事实说明DNADNA分子分子的合成遵循碱基互补配对原则。的合成遵循碱基互补配对原则。(3)(3)在在DNADNA分子扩增时，需要两种引物，由于新合成的子链都需要引物分
24、子扩增时，需要两种引物，由于新合成的子链都需要引物作为复制的起点，故所需引物数目等于新合成的作为复制的起点，故所需引物数目等于新合成的DNADNA子链数目，即子链数目，即2 22 21010-2=2-2=21111-2-2个。个。(4)(4)引物是一种单链引物是一种单链DNADNA或或RNARNA分子，它能与解开的分子，它能与解开的DNADNA母链的母链的33端结端结合，为合，为DNADNA聚合酶提供吸附位点，使聚合酶提供吸附位点，使DNADNA聚合酶从引物的聚合酶从引物的33端开始连端开始连接脱氧核苷酸分子，从而决定了接脱氧核苷酸分子，从而决定了DNADNA子链复制的方向是从子链复制的方向是从55端到端到33端。端。答案：答案：(1)DNA(1)DNA复制复制(2)(2)碱基互补配对碱基互补配对(3)2(3)21111-2-2(4)(4)从从55端到端到33端端DNADNA聚合酶只能从引物的聚合酶只能从引物的33端连接单个脱氧核端连接单个脱氧核苷酸分子苷酸分子
