1、神经细胞体外培养神经细胞体外培养汕大医学院病理教研室汕大医学院病理教研室n神经组织的体外培养方法是由，于年首创的。神经组织的体外培养方法是由，于年首创的。n由于该方法具有简化细胞生化环境、明确生长条件、由于该方法具有简化细胞生化环境、明确生长条件、便于施加实验因素及容易获得活体直接观测结果等优便于施加实验因素及容易获得活体直接观测结果等优点，因而已成为研究神经系统结构和功能的有效手段。点，因而已成为研究神经系统结构和功能的有效手段。n九十余年来，这项技术已从组织块（或植块）培养九十余年来，这项技术已从组织块（或植块）培养（）发展到分离细胞培养）发展到分离细胞培养()()，并逐渐与多种现代，并逐
2、渐与多种现代技术结合起来，在神经科学各领域发挥了重大作用。技术结合起来，在神经科学各领域发挥了重大作用。n 组织块培养分离细胞培养甚至单一型细胞培养神经组织的植块培养法神经组织的植块培养法n悬滴培养方法悬滴培养方法n单盖玻方法单盖玻方法n双盖玻方法双盖玻方法 n改良双盖玻方法改良双盖玻方法n培养物：培养物：n 灰质、白质、外周神经节或神经小段灰质、白质、外周神经节或神经小段n n 突起突起 非神经元外伸非神经元外伸优点优点n 所需培养液量少，可反应组织代谢中n 微量生化改变n 保留了植块内组织特征不足不足n 培养空间小，供少n 培养空间湿度难以控制，水分会蒸发n 密封手续繁杂，不利更换培养液，
3、难n 以观察单个神经元生长。神经元的分离细胞培养方法神经元的分离细胞培养方法年，首创了神经组织的分离培养方法年，首创了神经组织的分离培养方法材料来源：胚胎动物神经组织材料来源：胚胎动物神经组织神经元增殖发生于胚胎期神经元增殖发生于胚胎期形态学分化和化学分化程度低，体外存活强，成熟形态学分化和化学分化程度低，体外存活强，成熟后则相反，且神经元会受到大的普遍损伤。后则相反，且神经元会受到大的普遍损伤。部位：灰质、神经节，神经元集中，密度大部位：灰质、神经节，神经元集中，密度大 神经元的体外培养液神经元的体外培养液n 天然合成成分 血清 血浆 胚胎撮液n 人工培养基n 无血清培养基 化学限定性培养基
4、n 常用的：添加剂n 葡萄糖 为神经元能量代谢主要来源 缓冲系统重要 耗量更高 神经元生理活动的重要离子，是神经元存活所必需的，能提高神经元存活，促分化非神经元成分的抑制 有 天 神经元无血清限定培养液神经元无血清限定培养液 人工合成的培养基虽然具备了细胞生长的基本营养物人工合成的培养基虽然具备了细胞生长的基本营养物质和无机盐类，但仍无法满足不同类型细胞的特殊需质和无机盐类，但仍无法满足不同类型细胞的特殊需要。大多数神经元在基础培养液中即使能够存活也为要。大多数神经元在基础培养液中即使能够存活也为期不长，更难以分裂。因此可根据神经元的特性，给期不长，更难以分裂。因此可根据神经元的特性，给基础培
5、养中再添加某些特殊物质。基础培养中再添加某些特殊物质。选择添加剂的基本过程选择添加剂的基本过程n 限定连续细胞系的体外生长条件。限定连续细胞系的体外生长条件。n 试定该细胞系来源的细胞的培养试定该细胞系来源的细胞的培养 n 液条件。液条件。实验室经过长期研究发现如下添实验室经过长期研究发现如下添加剂比较好加剂比较好 人转铁蛋白、牛胰岛素、硒酸钠、孕酮、腐人转铁蛋白、牛胰岛素、硒酸钠、孕酮、腐胺加入到与胺加入到与 混液中，可以代替血清添加物，混液中，可以代替血清添加物，用来培养大鼠的成神经细胞瘤细胞。删去其用来培养大鼠的成神经细胞瘤细胞。删去其中任何一种添加物都可导致成神经细胞瘤细中任何一种添加
6、物都可导致成神经细胞瘤细胞生长状况锐减。该实验室共列出了三种神胞生长状况锐减。该实验室共列出了三种神经元限定性培养添加物的配方，代号分别经元限定性培养添加物的配方，代号分别为、。为、。的配方为的配方为n 胰岛素胰岛素n 转铁蛋白转铁蛋白n 孕酮孕酮 n 腐胺腐胺n 硒硒神经体外培养的生长基质神经体外培养的生长基质 n胶胶 元元 n 多聚赖氨酸多聚赖氨酸 n 脊髓后根节 大脑皮质 孕天大鼠胚胎 新生天大鼠 在液中取出组织除去脑膜 与 液一起移至离心管 舍弃液，再加入 胰蛋白酶和滴液 ，舍弃胰蛋白酶，加入培养液和滴液用巴斯德吸管吹打次，再用套有微量加样器头的加样器吹打次若有组织残渣，将上清移至新试
7、管再加培养液反复吹打将细胞悬液收集于离心管，离心，舍去上清，向沉淀加培养液，离心，加入培养液调整悬液中的细胞浓度，神经节细胞为加入培养液调整悬液中的细胞浓度，神经节细胞为种入涂有的盖片上，每片种入涂有的盖片上，每片放入孵箱中过夜放入孵箱中过夜次日加培养液次日加培养液天后（培养的第三天）换入有合成阴断剂的培养液天后（培养的第三天）换入有合成阴断剂的培养液 神经元的分离培养过程神经元的分离培养过程大鼠大脑皮层神经组织细胞培养大鼠大脑皮层神经组织细胞培养组织来源组织来源新生大鼠日龄，碘新生大鼠日龄，碘 酒酒，洒精消毒。，洒精消毒。断头，取出大脑，分离脑断头，取出大脑，分离脑 膜膜，夹取两侧大脑皮，夹
8、取两侧大脑皮质放入接种培养液中，用质放入接种培养液中，用冲洗二遍。冲洗二遍。剪碎，剪碎，,用用充分洗去残血充分洗去残血加入倍量胰蛋白酶，移入离心管中放到水浴箱中加入倍量胰蛋白酶，移入离心管中放到水浴箱中消化分钟。消化分钟。终止消化离心洗涤终止消化离心洗涤 转分转分，分钟弃上清。吹打制，分钟弃上清。吹打制成细胞悬液。成细胞悬液。台盼兰染色计数后接种于事先涂好鼠尾胶的孔板台盼兰染色计数后接种于事先涂好鼠尾胶的孔板中。中。培养天后换生长培养液培养天后换生长培养液大鼠海马神经细胞培养方法大鼠海马神经细胞培养方法 神经元体外生长特征神经元体外生长特征接种密度与体外存活率接种密度与体外存活率 当孔当孔 每
9、孔个每孔个 或或 个几乎无神经元存活个几乎无神经元存活 当个孔当个孔 或或 万万个万万个 存活率最大。存活率最大。天后不到接种的一半，故研究某一生长因子前天天后不到接种的一半，故研究某一生长因子前天加药最好加药最好神经元的体外存活时间神经元的体外存活时间 短 长 个月体外分化标志体外分化标志n 破伤风毒素破伤风毒素 n n 神经细胞的特殊染色鉴定方法神经细胞的特殊染色鉴定方法 尼氏体染色 焦油紫 甲苯胺蓝 硫瑾等组化染色 镀银染色 特异性神经组织化学法.药物，细胞因子，对神经细胞的作药物，细胞因子，对神经细胞的作用，各种药物，如用，各种药物，如中药，脑活素，神经生长因子，成中药，脑活素，神经生
10、长因子，成纤维细胞生长因子纤维细胞生长因子（），神经营养因子（），神经营养因子.细胞间相互作用：巨噬细胞，雪旺细胞间相互作用：巨噬细胞，雪旺细胞等。细胞等。.各种生理病理状态下神经元状态改各种生理病理状态下神经元状态改变变研究手段及测量指标研究手段及测量指标.形态学观察：形态学观察：光镜，相差显微镜：细胞数目，形光镜，相差显微镜：细胞数目，形态，大体结构，突触态，大体结构，突触 电镜：超微结构。电镜：超微结构。.激光共聚焦扫描显微镜（激光共聚焦扫描显微镜（,)：研究：研究细胞内成分变化，离子改变等，三细胞内成分变化，离子改变等，三维重建维重建.膜片钳技术，细胞表面通道和离子流膜片钳技术，细胞表
11、面通道和离子流动，电变化。动，电变化。研究手段及测量指标研究手段及测量指标.聚丙烯酰胺凝胶电泳：细胞内蛋白，核酸变化聚丙烯酰胺凝胶电泳：细胞内蛋白，核酸变化.染色：苏木素伊红（）染色及尼氏（染色：苏木素伊红（）染色及尼氏（)染色，免染色，免疫组化染色。疫组化染色。.显微测量：胞体平均直径和胞体椭圆率，突起显微测量：胞体平均直径和胞体椭圆率，突起长度及胞径。长度及胞径。.荧光光度分析仪：法测定细胞的值荧光光度分析仪：法测定细胞的值.神经细胞培养存活的标志：种植小时后贴壁，神经细胞培养存活的标志：种植小时后贴壁，渐长出几十微米的突起，神经细胞大多都能渐长出几十微米的突起，神经细胞大多都能存活。存活
12、。.特殊培养阶段：培养的到天之间，有较多神经特殊培养阶段：培养的到天之间，有较多神经元死亡，以后存活下的细胞突起长而多，互元死亡，以后存活下的细胞突起长而多，互相形成网络，电镜下可见突触。相形成网络，电镜下可见突触。.形态学观察：神经细胞胞体大，饱满，核大，形态学观察：神经细胞胞体大，饱满，核大，有立体感，折光性强，周围有一圈光晕，轴有立体感，折光性强，周围有一圈光晕，轴突细长均匀，直径恒定。突细长均匀，直径恒定。n 细胞凋亡细胞凋亡n 细胞生长状态细胞生长状态n 存活率存活率n 膜流动性膜流动性n 基因产物表达基因产物表达n 细胞内酶活性细胞内酶活性n 细胞内离子含量变化细胞内离子含量变化n 细胞表面受体，等等细胞表面受体，等等
