1、1.掌握原代培养的一般方法和步骤以及培养过程中的无菌操作技术。2.熟悉原代培养细胞的观察方法。u直接从生物体内获取组织细胞进行的首次培养称为原代培养。u原代培养是建立各种细胞系的第一步，是从事培养工作人员应熟悉和掌握的最基本的技术。u根据培养方法不同原代培养分为组织块培养法和单层细胞培养法。u仪器：培养箱（调整至37）、培养皿、解剖器械、倒置相差显微镜。u材料：胎鼠或新生小鼠。u试剂：DMEM培养基（含血清10%）、0.25%胰蛋白酶、75%消毒酒精。1.实验前将无血清培养基和含血清培养基分装并进行温育（37）。以温度计实际显示温度为准！2.将胎鼠或新生小鼠引颈处死，置于75%消毒酒精浸泡23
2、s，带入超净工作台。3.将小鼠腹面朝上，置于灭菌的大培养皿中。4.取出灭菌的解剖器械，解剖小鼠，取出肝脏。5.将小鼠肝脏置于灭菌的大培养皿皿盖上，剔除脂肪和结缔组织，并用无血清培养基反复冲洗3次，每次2-3ml。6.用手术剪将肝脏剪成小块（1mm3）,无血清培养基冲洗三次。7.将组织转移到一次性培养皿中，排列贴附于皿底。组织块间间隔约0.5-1cm,静置数分钟。8.待组织粘附后，缓缓加入含血清的培养基，切勿将组织块冲起，做好标记，转入培养箱培养，镜检观察。取出的剩余肝组织充分剪碎后，用剪过的蓝枪头将其转入离心管，1000rpm离心5min，弃上清，根据组织量的多少加入0.25%胰蛋白酶1-1.
3、5ml。37水浴消化约10-15min，每间隔5min，振荡一次，促使细胞分离。待组织变得疏松，略发白时，加入1ml含血清的DMEM培养基，终止胰蛋白酶的消化作用。1000rpm离心10min,加入含血清DMEM培养基3ml，充分吹打，混匀。细胞悬液过细胞筛网(100um孔径)到一次性培养皿中(中皿)，标记并转入二氧化碳培养箱培养，2-3天后镜检观察。实验完毕，将培养基瓶口迅速过酒精灯火焰消毒，拧紧后，封口膜密封。拿出超净台，放入冰箱。实验后，请将解剖器械、离心管冲洗干净（自来水-去离子水-三蒸水），放入烘箱烘干，超净工作台内擦拭干净，酒精喷洒消毒，并将酒精擦干净，打开紫外灯灭菌。各个实验小组的同学负责将垃圾带走，值日生打扫实验室卫生。电源开关光亮度调节目镜光源物镜粗/细准焦螺旋环状光阑1.总结原代培养的实验步骤以及在操作过程中需要注意的问题。2.绘图表示所观察到的实验结果，并对其予以分析。1.你认为原代培养中最关键的步骤是什么？为什么？2.在毒理实验的检测中，原代培养细胞具有什么样的优势？
