1、微生物检测基础微生物检测基础 质量人质量人 一什么是微生物？一什么是微生物？微生物是指所有形体微小，具有单微生物是指所有形体微小，具有单细胞或简单的多细胞结构，或没有细胞细胞或简单的多细胞结构，或没有细胞结构的一群最低等的生物。结构的一群最低等的生物。整个微生物家族的主要成员有：病整个微生物家族的主要成员有：病毒、细菌、霉菌、酵母、蓝细菌毒、细菌、霉菌、酵母、蓝细菌 、支、支原体、立克次氏体、衣原体原体、立克次氏体、衣原体 、微细藻、微细藻类类 、原生动物、原生动物 。病毒病毒n 没有细胞结构的专性寄生的大分子没有细胞结构的专性寄生的大分子生物。生物。如流感病毒、肝炎病毒（人体病如流感病毒、肝
2、炎病毒（人体病毒），鸡瘟病毒、口蹄疫病毒（动物病毒），鸡瘟病毒、口蹄疫病毒（动物病毒），烟草花叶病毒、番茄丛矮病毒毒），烟草花叶病毒、番茄丛矮病毒（植物病毒），噬菌体（细菌和放线菌（植物病毒），噬菌体（细菌和放线菌病毒）等。病毒）等。细菌细菌n 单细胞原核生物单细胞原核生物，一般在普通光学，一般在普通光学显微镜（油镜）下放大一千倍以上并染显微镜（油镜）下放大一千倍以上并染色才能清楚看见其个体。如人体肠道内色才能清楚看见其个体。如人体肠道内的大肠杆菌、粪链球菌，用于酿醋的醋的大肠杆菌、粪链球菌，用于酿醋的醋酸杆菌，使牛奶变酸的乳酸杆菌，生产酸杆菌，使牛奶变酸的乳酸杆菌，生产味精的谷氨酸短杆菌，生
3、产淀粉酶的枯味精的谷氨酸短杆菌，生产淀粉酶的枯草杆菌等。草杆菌等。2022-12-95酵母菌酵母菌 n 单细胞真菌，最低等的真核生物。单细胞真菌，最低等的真核生物。一般用高倍镜（一般用高倍镜（401401600600倍）观察其个倍）观察其个体细胞形态。如面包酵母、酿酒酵母、体细胞形态。如面包酵母、酿酒酵母、红酵母等。红酵母等。霉菌霉菌 n真核生物，单细胞或多细胞丝状真菌真核生物，单细胞或多细胞丝状真菌n可用低倍或高倍镜观察其形态。如酿可用低倍或高倍镜观察其形态。如酿制小曲酒的根霉、制豆腐乳的毛霉、制小曲酒的根霉、制豆腐乳的毛霉、生产葡萄糖的曲霉菌、生产青霉素的生产葡萄糖的曲霉菌、生产青霉素的青
4、霉等。青霉等。蓝细菌（蓝绿藻）n原核微生物，单细胞或细胞聚合体。原核微生物，单细胞或细胞聚合体。n单细胞，介于细菌与病毒之间单细胞，介于细菌与病毒之间的一类原始而小型的原核微生的一类原始而小型的原核微生物。物。支原体、衣原体、立克次氏体支原体、衣原体、立克次氏体微细藻类微细藻类单细胞藻类。单细胞藻类。如红藻、绿藻、小球藻等。如红藻、绿藻、小球藻等。原生动物原生动物 n单细胞，无真正细胞壁。单细胞，无真正细胞壁。n如变形虫、吸管虫、草履虫等。如变形虫、吸管虫、草履虫等。二微生物的特性二微生物的特性 n主要有五个方面主要有五个方面1 1种类多种类多 n到目前为止，人们已认识的到目前为止，人们已认识
5、的微生物已有微生物已有1010多万种。多万种。2 2分布广分布广 n微生物因其形体微小，重量轻，故微生物因其形体微小，重量轻，故可以随着风和水流到处传播可以随着风和水流到处传播。3 3繁殖快繁殖快 n微生物惊人的生长繁殖速度是其他任微生物惊人的生长繁殖速度是其他任何生物都望尘莫及的。一般细菌的世何生物都望尘莫及的。一般细菌的世代时间为几十分钟到一百多分钟。在代时间为几十分钟到一百多分钟。在最适宜的条件下，人们最熟悉的大肠最适宜的条件下，人们最熟悉的大肠杆菌每杆菌每131320min20min就可分裂出新的一就可分裂出新的一代。代。4 4代谢强代谢强 n微生物的代谢强度比起高等生微生物的代谢强度
6、比起高等生物要高出几百到几万倍，主要物要高出几百到几万倍，主要表现在吸收多转化快。表现在吸收多转化快。5 5易变异易变异 n微生物容易发生变异的主要原因是个体多为微生物容易发生变异的主要原因是个体多为单细胞或结构简单的多细胞，甚至非细胞结单细胞或结构简单的多细胞，甚至非细胞结构，因而在受到外界物理或化学因素影响后，构，因而在受到外界物理或化学因素影响后，很容易引起细胞内的遗传物质发生突变，结很容易引起细胞内的遗传物质发生突变，结果导致遗传性状，包括形态或生理表型上的果导致遗传性状，包括形态或生理表型上的变异。微生物易变异的另一个原因是细胞增变异。微生物易变异的另一个原因是细胞增殖速度快，细胞数
7、量多，因而尽管其自发突殖速度快，细胞数量多，因而尽管其自发突变率很低，也会造成在短时间内产生较多的变率很低，也会造成在短时间内产生较多的变异后代。变异后代。三常见微生物的三常见微生物的 形态结构形态结构 四实验室微生物的培四实验室微生物的培养养 实验室中微生物生长（培养）在液实验室中微生物生长（培养）在液体或固体培养基中。细菌生长的培养基体或固体培养基中。细菌生长的培养基应含所有生长的基本需求：能量、碳源、应含所有生长的基本需求：能量、碳源、氮源以及基本的离子，磷、硫、钠、钙、氮源以及基本的离子，磷、硫、钠、钙、钾和铁及各种微量元素。钾和铁及各种微量元素。原养型不需要在培养基中添加另外的原养型
8、不需要在培养基中添加另外的成分，而营养缺陷型需要添加生长因子如成分，而营养缺陷型需要添加生长因子如氨基酸、维生素和含氮碱基。所用的培养氨基酸、维生素和含氮碱基。所用的培养基可以是所有成分及量均确切知道的限定基可以是所有成分及量均确切知道的限定培养基（合成培养基）和含有不确定营养培养基（合成培养基）和含有不确定营养物混合物的天然培养基。物混合物的天然培养基。琼脂（洋菜）是用来固化液体培琼脂（洋菜）是用来固化液体培养基的。选择培养基或鉴定培养基是养基的。选择培养基或鉴定培养基是用来检测特殊微生物类群的。用来检测特殊微生物类群的。生长培养基生长培养基 n实验室中细菌通常生长（培养，实验室中细菌通常生
9、长（培养，culturedcultured）在摇瓶、瓶子或称作发酵罐）在摇瓶、瓶子或称作发酵罐的大培养容器液体培养基中或在圆的、的大培养容器液体培养基中或在圆的、通常为塑料、灭菌碟子培养皿的固体培通常为塑料、灭菌碟子培养皿的固体培养基中。养基中。将微生物引种在这些培养基上称为将微生物引种在这些培养基上称为接种（接种（inoculationinoculation）。）。n培养基的性质取决于微生物的天然环境和培养基的性质取决于微生物的天然环境和微生物生长的营养要求。微生物生长的营养要求。n分离大量微生物或基产物用液体培养基，分离大量微生物或基产物用液体培养基，n固体培养基用于个别细菌的分离和保存。
10、固体培养基用于个别细菌的分离和保存。限定培养基或合成培养基限定培养基或合成培养基 含有通常为特殊微生物生长基本含有通常为特殊微生物生长基本要求的确定成分。通常是简单的（最要求的确定成分。通常是简单的（最低的）、含有最低生长要求的培养基。低的）、含有最低生长要求的培养基。n 天然培养基天然培养基 n天然培养基含有不确定的成分如蛋白胨天然培养基含有不确定的成分如蛋白胨（大豆粉酶消化液）和提供足够营养成（大豆粉酶消化液）和提供足够营养成分的酵母提取物（氨基酸、维生素、糖分的酵母提取物（氨基酸、维生素、糖和碱基），适合广泛范围微生物的生长。和碱基），适合广泛范围微生物的生长。n天然培养基如营养肉汤（天
11、然培养基如营养肉汤（NBNB）和胰胨、）和胰胨、豆胨肉汤（豆胨肉汤（TSBTSB）是实验室中常规用的）是实验室中常规用的细菌培养基，特别对生长要求还未确定细菌培养基，特别对生长要求还未确定的细菌生长使用。的细菌生长使用。n 常用血液作培养基的附加成分常用血液作培养基的附加成分分离人类病原菌，由于它提供许多分离人类病原菌，由于它提供许多难养的人类病原菌生长的基本营养，难养的人类病原菌生长的基本营养，如链球菌。特殊的选择培养基和监如链球菌。特殊的选择培养基和监别培养基经常用于分离特殊的微生别培养基经常用于分离特殊的微生物类群，尤其在医院的实验室中。物类群，尤其在医院的实验室中。n选择培养基与鉴别培
12、养基选择培养基与鉴别培养基n设计这些培养基是为设计这些培养基是为选择特殊类群的选择特殊类群的微生物或鉴别两种菌种时用。微生物或鉴别两种菌种时用。n选择培养基含有抑制非目的细菌生长选择培养基含有抑制非目的细菌生长的成分，鉴别培养基是添加某种营养的成分，鉴别培养基是添加某种营养物或和化学物质，促进所要的微生物或和化学物质，促进所要的微生物生长，使在鉴别培养基平板上两种物生长，使在鉴别培养基平板上两种不同的微生物的菌落可以区分开来。不同的微生物的菌落可以区分开来。生长的环境条件生长的环境条件 n温度温度 n氧浓度氧浓度 nPHPH n水活度水活度 温度温度 嗜冷微生物适合于嗜冷微生物适合于1010生
13、活的细生活的细菌，最适生长温度在菌，最适生长温度在2020左右。嗜左右。嗜温微生物生长温度在温微生物生长温度在15154545之间，之间，最适生长温度在最适生长温度在3737左右的细菌。左右的细菌。嗜热微生物生长温度在嗜热微生物生长温度在30307575之之间，最适生长温度在间，最适生长温度在5555，在，在100100以上温度生长，称为嗜高热以上温度生长，称为嗜高热微生物微生物。氧浓度氧浓度 n根据细菌对氧要求的不同分为好氧菌，根据细菌对氧要求的不同分为好氧菌，厌氧菌，包括专性厌氧菌、兼性厌氧厌氧菌，包括专性厌氧菌、兼性厌氧菌、耐氧菌菌、耐氧菌n微好氧在正常大气氧浓度微好氧在正常大气氧浓度2
14、020情况下情况下就受到损伤，只能在更低的氧浓度下就受到损伤，只能在更低的氧浓度下才能存活。才能存活。pHpH值值 n嗜碱菌（嗜碱菌（alkaliphilesalkaliphiles）：生长：生长在高在高pHpH（8 8.5 51111.5 5）的微生物。）的微生物。n嗜酸菌（嗜酸菌（acidophilesacidophiles）：生长在低：生长在低pHpH（0 05.55.5）中的微生物。）中的微生物。水活度水活度 n像所有生物一样，微生物对周像所有生物一样，微生物对周围环境的渗透压是敏感的。低围环境的渗透压是敏感的。低渗透压时，水将聚集于细胞内，渗透压时，水将聚集于细胞内，高渗透压时水逸出
15、。高渗透压时水逸出。五微生物的生长五微生物的生长 n1 1细菌以二等分裂方式细菌以二等分裂方式（1 12424）分裂，细菌的生长为）分裂，细菌的生长为指数生长。群体细胞数目加倍所指数生长。群体细胞数目加倍所需的时间为倍增时间（需的时间为倍增时间（t td d）。）。细菌典型生长曲线细菌典型生长曲线nloglog1010 稳定期（平衡期）稳定期（平衡期）活活 细细 对数期对数期 衰亡期（死亡期）衰亡期（死亡期）胞胞 延迟期延迟期 （指数期）（指数期）数（延滞期）数（延滞期）培养时间培养时间2 2真菌的生长真菌的生长 n真菌是丝状的、无光合作用真菌是丝状的、无光合作用的、营异养性营养的真核微的、营
16、异养性营养的真核微生物。生物。真菌生长的各个时期真菌生长的各个时期 n 稳定期n 细 减速期n 胞 直线期 自溶期n 数n 目n 延迟期n 指数期n n 培养时间3 3微生物生长的测定方法微生物生长的测定方法 n微生物的生长可用原生质的增加、微生物的生长可用原生质的增加、细胞数目的增加或以代谢活动情况细胞数目的增加或以代谢活动情况作指标。根据细胞作指标。根据细胞 的干重或某一的干重或某一化学成分如总氮含量数量很少，以化学成分如总氮含量数量很少，以至误差很大。最常采用的微生物生至误差很大。最常采用的微生物生长的方法是统计群休数目。长的方法是统计群休数目。(1)(1)活菌计数法活菌计数法 n有时一
17、个菌落并非绝对地都是由一个单细胞所有时一个菌落并非绝对地都是由一个单细胞所长成的，往往两个或两个以上相连结的细胞只长成的，往往两个或两个以上相连结的细胞只长成一个单菌落；有些细胞比其它细胞较早地长成一个单菌落；有些细胞比其它细胞较早地分裂，分裂的速度也快，于是它就首先出现可分裂，分裂的速度也快，于是它就首先出现可见的菌落，而其它的细胞较迟才出现菌落，所见的菌落，而其它的细胞较迟才出现菌落，所以，必须培养足够长的时间，才能使所有的菌以，必须培养足够长的时间，才能使所有的菌落增至足以肉眼看见的大小，一般至少需要落增至足以肉眼看见的大小，一般至少需要24-4824-48小时，有些生长较缓慢的微生物甚
18、至需小时，有些生长较缓慢的微生物甚至需要几天至一星期；此外，要控制培养皿内出现要几天至一星期；此外，要控制培养皿内出现的菌落数不宜过多。的菌落数不宜过多。（2 2）计算器法）计算器法n将待检菌液充分混匀，注入改良纽氏血球计数板，计将待检菌液充分混匀，注入改良纽氏血球计数板，计数一定量的菌液中所含菌数，计算出每毫升所含菌数。数一定量的菌液中所含菌数，计算出每毫升所含菌数。（3 3）比浊法）比浊法n据细菌悬浮液的透光量间接测定细菌据细菌悬浮液的透光量间接测定细菌的数量。的数量。n细菌悬浮液的浓度在一定范围内与光细菌悬浮液的浓度在一定范围内与光的穿透量成反比，与光密度成正比。的穿透量成反比，与光密度
19、成正比。对于丝状真菌的生长率，可以根据菌对于丝状真菌的生长率，可以根据菌丝的生长长度或菌丝增加的重量。丝的生长长度或菌丝增加的重量。六微生物生长的控制六微生物生长的控制 n使工作者免受他们所研究的微生物伤使工作者免受他们所研究的微生物伤害和所研究的微生物培养物不受环境害和所研究的微生物培养物不受环境中其他微生物污染的方法称作无菌中其他微生物污染的方法称作无菌（灭菌）技术。（灭菌）技术。1 1灭菌方法灭菌方法 方法方法 有效性有效性 应用应用 湿热灭菌法湿热灭菌法 煮沸煮沸/蒸气处理蒸气处理 杀死多数细菌、真菌杀死多数细菌、真菌的营养细胞和病毒的营养细胞和病毒对芽孢无效对芽孢无效 碟子、盆，对热
20、抗性碟子、盆，对热抗性的器具的器具 高压灭菌器高压灭菌器1515磅磅/英寸英寸2 2 121 121 杀死所有的营养细菌杀死所有的营养细菌和芽孢，灭菌时间长和芽孢，灭菌时间长短取决于大存在的微短取决于大存在的微生物数量生物数量 培养基、溶液、器具，培养基、溶液、器具，任何经受热和压力的任何经受热和压力的物品物品 巴斯德消毒法巴斯德消毒法71.771.7 15 15秒秒 液体热处理但不能杀液体热处理但不能杀灭所有细菌。风味改灭所有细菌。风味改变最少变最少 牛奶、果汗等牛奶、果汗等 方法方法 有效性有效性 应用应用 间隙灭菌法间隙灭菌法 三次用三次用9090100100煮沸煮沸1010分钟处理，每
21、分钟处理，每次处理间隔次处理间隔2424小时小时 第一天杀死营养细胞，第一天杀死营养细胞，在间隔期间任何孢芽在间隔期间任何孢芽萌发下一次加热处理萌发下一次加热处理时再杀死时再杀死 不能被高压灭菌的培不能被高压灭菌的培养基，但对热有相对养基，但对热有相对的抗性的抗性 干热灭菌法干热灭菌法 灼烧法热空气灭菌法灼烧法热空气灭菌法 炽热直接加热炽热直接加热200200（160160170170译译者注）者注）2 2小时，破坏小时，破坏细胞和芽孢细胞和芽孢 接种环接种环玻璃器具玻璃器具 方法方法 有效性有效性 应用应用 过滤除菌过滤除菌滤器滤器孔径大小孔径大小 0.220.220.450.45m m 不
22、能除去病毒不能除去病毒 不能加热处理的液体不能加热处理的液体 辐射辐射 UV UV线线非电离非电离 不能很好穿透材料不能很好穿透材料 物体表面和空气灭菌物体表面和空气灭菌 射线射线电离电离 穿透能力好穿透能力好 药物、塑料制品药物、塑料制品 2022-12-962自动高压蒸汽灭菌锅自动高压蒸汽灭菌锅2 2消毒剂与防腐剂消毒剂与防腐剂 n消毒剂是用于非生命体杀菌的化学物质消毒剂是用于非生命体杀菌的化学物质n防腐剂是能杀死微生物或抑制微生物生防腐剂是能杀死微生物或抑制微生物生长的化学物质，这类物质对活组织是无长的化学物质，这类物质对活组织是无毒性。毒性。防腐剂防腐剂 用于健康有关的方用于健康有关的
23、方面面 作用模型作用模型防腐剂防腐剂 有机汞有机汞 表皮表皮与蛋白质的与蛋白质的SHSH基团基团结合结合 硝酸银硝酸银 防止新生儿感染淋病防止新生儿感染淋病奈瑟氏菌引起的失明奈瑟氏菌引起的失明 蛋白质沉淀剂蛋白质沉淀剂 碘液碘液 表皮表皮 碘化蛋白质中的酪碘化蛋白质中的酪氨酸残基；氧化剂氨酸残基；氧化剂 酒精（酒精（7070乙醇）乙醇）表皮表皮 脂溶剂和蛋白变性脂溶剂和蛋白变性剂剂 双酚类（六氯酚）双酚类（六氯酚）肥皂、洗涤剂、除臭肥皂、洗涤剂、除臭剂剂 破坏细胞膜破坏细胞膜 防腐剂防腐剂 用于健康有关的方用于健康有关的方面面 作用模型作用模型阳离子去污剂阳离子去污剂（四胺基化合物）（四胺基化
24、合物）肥皂、洗涤剂肥皂、洗涤剂 与细胞膜中的磷脂与细胞膜中的磷脂相作用相作用 过氧化氢过氧化氢 表皮表皮 氧化剂氧化剂 消毒剂消毒剂 二氯化汞二氯化汞 桌子、台面、地板桌子、台面、地板 与巯基结合与巯基结合 游泳池和生活用水游泳池和生活用水的灭藻剂的灭藻剂 蛋白质沉淀剂蛋白质沉淀剂 蛋白质沉淀剂蛋白质沉淀剂 碘液碘液 医疗器械医疗器械 碘化酪氨酸残基碘化酪氨酸残基 防腐剂防腐剂 用于健康有关的方用于健康有关的方面面 作用模型作用模型氯气氯气 净化生活用水净化生活用水 氧化剂氧化剂 氯化物氯化物 牛奶厂、食品工业设牛奶厂、食品工业设备、生活用水备、生活用水 氧化剂氧化剂 阳离子去污剂阳离子去污剂
25、（四胺基化合物）（四胺基化合物）医疗器械、食品、制医疗器械、食品、制酪设备酪设备 与磷脂作用与磷脂作用 环氧乙烷（气体）环氧乙烷（气体）实验室中的热敏感材实验室中的热敏感材料如塑料料如塑料 烷基化试剂烷基化试剂 臭氧臭氧 饮用水饮用水 强氧化剂强氧化剂 七微生物的观察七微生物的观察 1 1细菌的染色细菌的染色 n原理：原理：n细菌是无色透明的。在光学显微镜下，菌体细菌是无色透明的。在光学显微镜下，菌体与其背景相差很小，不易看清细菌的形态和与其背景相差很小，不易看清细菌的形态和结构，故通常要对细菌用染料染色，以增加结构，故通常要对细菌用染料染色，以增加菌体与背景的反差，便于在光学显微镜下观菌体与
26、背景的反差，便于在光学显微镜下观察。察。n细菌染色所用的染料，按其所带电荷状态分，细菌染色所用的染料，按其所带电荷状态分，碱性染料和酸性染料。碱性染料和酸性染料。n碱性染料：结晶紫、龙胆紫、碱性品红（复碱性染料：结晶紫、龙胆紫、碱性品红（复红）、蕃红、美蓝、甲基紫、中性红、孔雀绿红）、蕃红、美蓝、甲基紫、中性红、孔雀绿等。等。n酸性染料：酸性品红、刚果红、曙红等。在通酸性染料：酸性品红、刚果红、曙红等。在通常的培养条件下细菌带负电，碱性染料带正电常的培养条件下细菌带负电，碱性染料带正电荷，易与菌体的酸性物质（带负电荷的细胞成荷，易与菌体的酸性物质（带负电荷的细胞成分有核酸和酸性多糖）牢固地结合
27、。所以，多分有核酸和酸性多糖）牢固地结合。所以，多采用碱性染料染色。采用碱性染料染色。n只有在分枝杆菌属（只有在分枝杆菌属（MyoobaoteriumMyoobaoterium）或诺卡）或诺卡氏菌属氏菌属(Macardia(Macardia)中的一些菌才能用酸性染料中的一些菌才能用酸性染料（石碳酸品红）染色（抗酸性染色）。（石碳酸品红）染色（抗酸性染色）。n方法方法n简单染色和复合染色法。简单染色和复合染色法。n简单（单）染色法只用一种染料染菌体，简单（单）染色法只用一种染料染菌体，目的仅为增加反差，便于观察。目的仅为增加反差，便于观察。n复合（杂）染色法是用两种染料染色，复合（杂）染色法是用
28、两种染料染色，以区别不同细菌的革兰氏染色反应或抗以区别不同细菌的革兰氏染色反应或抗酸性染色反应；或将菌体和某一结构染酸性染色反应；或将菌体和某一结构染成不同颜色，便于观察。成不同颜色，便于观察。革兰氏染色法革兰氏染色法 n革兰氏染色是最普通的细菌染色之一，根据它革兰氏染色是最普通的细菌染色之一，根据它们细胞壁的结构，把细菌分成两类。们细胞壁的结构，把细菌分成两类。n革兰氏阳性细菌细胞围绕原生质膜的外膜是由革兰氏阳性细菌细胞围绕原生质膜的外膜是由厚的肽聚糖层组成。厚的肽聚糖层组成。n革兰氏阴性细菌只有一个薄的外部的肽聚糖层，革兰氏阴性细菌只有一个薄的外部的肽聚糖层，但在其外面还有第二层胞壁外膜。
29、革兰氏阳性但在其外面还有第二层胞壁外膜。革兰氏阳性细菌用乙醇冲洗时保留了结晶紫和碘的复合物，细菌用乙醇冲洗时保留了结晶紫和碘的复合物，因此光学显微镜下呈现紫色。革兰氏阴性细菌因此光学显微镜下呈现紫色。革兰氏阴性细菌由于它们失去了结晶紫和碘的复合物，并且吸由于它们失去了结晶紫和碘的复合物，并且吸收了较浅的石炭酸复红，复染成粉红色。收了较浅的石炭酸复红，复染成粉红色。2022-12-972革兰氏染色法革兰氏染色法n（1 1）用接种环取少量细菌在干净的载玻片上涂布、固）用接种环取少量细菌在干净的载玻片上涂布、固定。定。n（2 2）用草酸铵结晶紫染色。）用草酸铵结晶紫染色。n（3 3）用弱酸性媒剂碘）
30、用弱酸性媒剂碘碘化钾溶液媒染。碘化钾溶液媒染。n（4 4）用中性脱色剂，如乙醇或丙酮脱色，能被脱色的）用中性脱色剂，如乙醇或丙酮脱色，能被脱色的叫革兰氏阴性菌，其菌体无色；不能被脱色的叫革兰氏叫革兰氏阴性菌，其菌体无色；不能被脱色的叫革兰氏阳性菌，其菌体呈紫色。阳性菌，其菌体呈紫色。n（5 5）以上四步已能区分两大类细菌，为了使革兰氏阴）以上四步已能区分两大类细菌，为了使革兰氏阴性菌易被观察，还需用与草酸铵结晶紫颜色鲜明对比的性菌易被观察，还需用与草酸铵结晶紫颜色鲜明对比的品红或蕃红复染。经脱色的革兰氏阴性菌被染上红色，品红或蕃红复染。经脱色的革兰氏阴性菌被染上红色，没有脱色的革兰氏阳性菌染不
31、上红色，仍呈紫色没有脱色的革兰氏阳性菌染不上红色，仍呈紫色。革兰氏染色法步骤革兰氏染色法步骤八微生物的分离八微生物的分离 细菌的纯培养细菌的纯培养 n实验室中通常需要细菌的纯培养，即所实验室中通常需要细菌的纯培养，即所有的细胞都来自同一个最初的细菌。有的细胞都来自同一个最初的细菌。n采用采用划线平板法和倾注平板法划线平板法和倾注平板法接种细菌接种细菌到琼脂平板以获得彼此分离的单个细菌到琼脂平板以获得彼此分离的单个细菌细胞。经合适温度培养后，每一个细菌细胞。经合适温度培养后，每一个细菌形成一个肉眼可见的菌落，含有相当于形成一个肉眼可见的菌落，含有相当于10109 9个细菌细胞。个细菌细胞。划线划
32、线 划线划线 烧接种环烧接种环 烧接种环烧接种环 灭菌通过本生煤气灯灭菌通过本生煤气灯 培养后的培养后的 单个单个 菌落菌落 烧接种环烧接种环 划线划线 划线分离细菌培养物为单菌落的示意图划线分离细菌培养物为单菌落的示意图 转移1ml 转移1ml 转移1ml加1ml菌液计数 10-1 10-2 10-3 10-40.1ml涂布平板 计数太多 62个菌落 计数太少 菌落数目稀释倍数细胞数（菌落形成单位，CFU）ml原菌液 6210310（吸取0.1ml到平板）6.2105CFU/ml2022-12-978微生物检验的质量控制微生物检验的质量控制 2022-12-979前言前言 n 在实际工作中存
33、在许多复杂因素影响微生物学在实际工作中存在许多复杂因素影响微生物学检验，可能给检验结果带来偏差甚至错误，因此必检验，可能给检验结果带来偏差甚至错误，因此必须对影响检验结果的诸多因素采取控制手段保证检须对影响检验结果的诸多因素采取控制手段保证检验结果的正确性，不断完善微生物检验的质量控制。验结果的正确性，不断完善微生物检验的质量控制。2022-12-980 主要内容主要内容n1 1 检验人员检验人员 n2 2 仪器、设备仪器、设备 n3 3 检验培养基、试剂检验培养基、试剂 n4 4 检验环境检验环境 n5 5 采样采样 n6 6 样品的接收和预处理样品的接收和预处理 n7 7 检验质量检验质量
34、 n8 8 校验的执行校验的执行 n9 9 参考菌株及其保存参考菌株及其保存 n10 10 实验室内外部质量控制实验室内外部质量控制 n11 11 检验报告及结果质量控制检验报告及结果质量控制2022-12-9811 1 检验人员检验人员 n（1 1）微生物检验不能完全依赖全自动鉴定仪器，检）微生物检验不能完全依赖全自动鉴定仪器，检验工作中每一步骤均需要有高度的主观分析和判断验工作中每一步骤均需要有高度的主观分析和判断能力，与个人的经验、技能和微生物检验基础知识能力，与个人的经验、技能和微生物检验基础知识水平密切相关。水平密切相关。n（2 2）除要求微生物检验人员必须具备严肃认真的工）除要求微
35、生物检验人员必须具备严肃认真的工作态度、精密细致的观察和操作习惯，注重个人卫作态度、精密细致的观察和操作习惯，注重个人卫生外，还必须熟练掌握微生物学检验技术。生外，还必须熟练掌握微生物学检验技术。2022-12-9821 1 检验人员检验人员 n（3 3）检验人员应执行上岗前培训制度，上岗）检验人员应执行上岗前培训制度，上岗前培训合格方能上岗操作，还要主动参加学前培训合格方能上岗操作，还要主动参加学习、培训、讲座，学习新技术，掌握微生物习、培训、讲座，学习新技术，掌握微生物学检验方法、标准及相关法律法规；学检验方法、标准及相关法律法规；n（4 4）参与编写测试程序及仪器操作程序，学）参与编写测
36、试程序及仪器操作程序，学习质量保证体系知识和计量学基本知识；习质量保证体系知识和计量学基本知识；2022-12-9831 1 检验人员检验人员 n（5 5）参加各类水平测试和盲样测试，提高检测水平）参加各类水平测试和盲样测试，提高检测水平和分析问题、解决问题的能力；和分析问题、解决问题的能力；n（6 6）微生物学检验室负责人应定期对检验人员进行）微生物学检验室负责人应定期对检验人员进行专业知识和操作熟练程度的考核，提高检验人员的专业知识和操作熟练程度的考核，提高检验人员的素质。素质。2022-12-9842 2 仪器、设备仪器、设备 n 大型微生物检验室的主要仪器及设备包括：大型微生物检验室的
37、主要仪器及设备包括：n 无菌室、微生物自动鉴定仪、微生物快速初筛仪、无菌室、微生物自动鉴定仪、微生物快速初筛仪、显微镜、菌落计数器、高压灭菌器、干热灭菌器、离显微镜、菌落计数器、高压灭菌器、干热灭菌器、离心机、蒸馏设备、培养箱、厌氧箱、水浴箱、冰箱、心机、蒸馏设备、培养箱、厌氧箱、水浴箱、冰箱、超净工作台、酶标仪、洗板机、超净工作台、酶标仪、洗板机、PCRPCR仪、电泳仪、凝仪、电泳仪、凝胶成像系统等。胶成像系统等。2022-12-9852 2 仪器、设备仪器、设备 n 要求所有的仪器和设备均应按照生产厂要求所有的仪器和设备均应按照生产厂家提供的方法和有关规定正确使用。家提供的方法和有关规定正
38、确使用。n 需要强制性定期检定的仪器和设备，经符需要强制性定期检定的仪器和设备，经符合资历的计量部门校准合格后方可使用。合资历的计量部门校准合格后方可使用。n 对于常用的贵重仪器和设备，在使用前应对于常用的贵重仪器和设备，在使用前应加以检查，使用后要登记，要做到定期维护，加以检查，使用后要登记，要做到定期维护，以保证仪器处于良好的工作状态。以保证仪器处于良好的工作状态。2022-12-9862.1 2.1 高压灭菌器高压灭菌器n（1 1）操作人员应了解蒸气灭菌的原理并遵守操作规）操作人员应了解蒸气灭菌的原理并遵守操作规则。则。n（2 2）放入的灭菌物品不宜放得过挤。）放入的灭菌物品不宜放得过挤
39、。n（3 3）使用时，放入必要的监视指标，可选用）使用时，放入必要的监视指标，可选用121121、15min 15min 或或121121、30min30min监视指标。监视指标。n（4 4）生物指标为嗜热脂肪芽胞杆菌的耐受性）生物指标为嗜热脂肪芽胞杆菌的耐受性（121121，15min15min）。）。n（5 5）灭菌后，再培养观察有无细菌生长）灭菌后，再培养观察有无细菌生长。n（6 6）也可采用水银留点温度计进行校准。）也可采用水银留点温度计进行校准。2022-12-9872.2 2.2 干热灭菌器干热灭菌器n（1 1）应遵守操作规则，放入箱内灭菌的器皿不宜）应遵守操作规则，放入箱内灭菌的
40、器皿不宜放得过挤，器皿与内层底板不能直接接触。放得过挤，器皿与内层底板不能直接接触。n（2 2）灭菌完毕，不能立即开门取物，须关闭电源，）灭菌完毕，不能立即开门取物，须关闭电源，待温度自动下降至待温度自动下降至5050以下再开门取物。以下再开门取物。n（3 3）带有纸包装的物品灭菌温度不能超过）带有纸包装的物品灭菌温度不能超过160160。2022-12-9882.3 2.3 培养箱培养箱n（1 1）箱内不应放入过热或过冷的物品，取放物品时，）箱内不应放入过热或过冷的物品，取放物品时，应随手关闭箱门，以维持恒温。应随手关闭箱门，以维持恒温。n（2 2）如培养物不慎泼洒到箱内，马上清洁，需消毒的
41、）如培养物不慎泼洒到箱内，马上清洁，需消毒的马上消毒。马上消毒。n（3 3）培养物不宜与培养箱最底层直接接触。）培养物不宜与培养箱最底层直接接触。n（4 4）必要时，可放入装水容器以维持箱内的湿度。）必要时，可放入装水容器以维持箱内的湿度。n（5 5）每天记录温度及湿度的变化，观察培养箱内温度）每天记录温度及湿度的变化，观察培养箱内温度与设定温度是否一致。在两次计量周期之间要进行内部与设定温度是否一致。在两次计量周期之间要进行内部校准。校准。2022-12-9892.5 2.5 显微镜显微镜n按说明进行操作。按说明进行操作。n使用油镜后先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用使用油镜后先用擦镜纸擦去镜头
42、上的油，再用沾上二甲苯的擦镜纸擦拭，最后用干净擦镜纸沾上二甲苯的擦镜纸擦拭，最后用干净擦镜纸擦干。擦干。n注意防尘，保持清洁、干燥。注意防尘，保持清洁、干燥。2022-12-9902 2 仪器、设备仪器、设备n 实验室需要使用的无菌器具应能正确实施灭实验室需要使用的无菌器具应能正确实施灭菌，无菌器具和器皿有明显标识，以便与非无菌，无菌器具和器皿有明显标识，以便与非无菌器具和器皿加以区别。菌器具和器皿加以区别。2022-12-9913 3 检验培养基、试剂检验培养基、试剂 n3.13.1培养基培养基n 微生物学检验所用干粉培养基，必须由专业微生物学检验所用干粉培养基，必须由专业厂家生产，产品质量
43、必须符合有关的质量标准，厂家生产，产品质量必须符合有关的质量标准，保存也应符合要求，防止潮解、结块等。保存也应符合要求，防止潮解、结块等。n 干粉培养基易受潮变性，需要重视。干粉培养基易受潮变性，需要重视。2022-12-9923.13.1培养基培养基n 为保证干粉培养基质量指标，在实际工作中应为保证干粉培养基质量指标，在实际工作中应注意：注意：n（1 1）加强包装的密封性能；）加强包装的密封性能；n（2 2）使用时尽量缩短开盖时间；）使用时尽量缩短开盖时间；n（3 3）一般干性培养基放在低温干燥的环境中保存，）一般干性培养基放在低温干燥的环境中保存，对于易受潮的品种，启用后宜放入干燥器中保存
44、；对于易受潮的品种，启用后宜放入干燥器中保存；n（4 4）由于配制水分不同、启用次数或时间增加，干）由于配制水分不同、启用次数或时间增加，干粉培养基的粉培养基的pHpH值可能会有所变化，应随时略加调整。值可能会有所变化，应随时略加调整。2022-12-9933.13.1培养基培养基n 干粉培养基所要求的理化指标，可以从下面几干粉培养基所要求的理化指标，可以从下面几个方面进行初步检查：个方面进行初步检查：n（1 1）干粉培养基应为疏松颗粒状或粉末状，颜色正）干粉培养基应为疏松颗粒状或粉末状，颜色正常、一致；常、一致；n（2 2）溶解后清彻透明，无沉淀；）溶解后清彻透明，无沉淀；n（3 3）454
45、5时时pHpH值为值为7.27.2士士0.20.2；熔化温度；熔化温度7070左右，左右，凝固温度为凝固温度为35-4035-40；n（4 4）水分含量符合标准。）水分含量符合标准。2022-12-9943.13.1培养基培养基n 商品化带培养基的平皿应对所用培养基商品化带培养基的平皿应对所用培养基作外观检查，如培养基是否开裂、平皿有无破作外观检查，如培养基是否开裂、平皿有无破碎、血平板有否溶血、有否冰冻、灌注是否均碎、血平板有否溶血、有否冰冻、灌注是否均匀、有否过多的气泡，清晰度和有无污染也需匀、有否过多的气泡，清晰度和有无污染也需要检查。要检查。n 培养基平皿的制备商必须按照标准随产品培养
46、基平皿的制备商必须按照标准随产品附上书面鉴定资料，实验室应将此鉴定书保存附上书面鉴定资料，实验室应将此鉴定书保存一定时期。一定时期。2022-12-9953.13.1培养基培养基n 实验室自制培养基应有质量控制，包括：实验室自制培养基应有质量控制，包括：n 制备数量制备数量 制备日期制备日期 n 有效日期有效日期 制备者姓名制备者姓名n还必须检查：还必须检查：n 培养基颜色培养基颜色 均匀度均匀度 厚度厚度 n 光洁度光洁度 溶血与否溶血与否 n 有否过多气泡有否过多气泡 是否污染是否污染 2022-12-9963.1 3.1 培养基培养基n 培养基的配制应严格按照标准规定的方法进行操培养基的
47、配制应严格按照标准规定的方法进行操作，并做好原始记录。作，并做好原始记录。为保证培养基质量，在配制时应注意：为保证培养基质量，在配制时应注意：n 制备培养基必须在玻璃容器、搪瓷缸或铝锅中进制备培养基必须在玻璃容器、搪瓷缸或铝锅中进行，如用铜、铁器皿，会对微生物生长有毒害作用；行，如用铜、铁器皿，会对微生物生长有毒害作用；n 配制培养基时应按检验项目规定的配方添加，不配制培养基时应按检验项目规定的配方添加，不得随意增减或更改培养基成分。得随意增减或更改培养基成分。2022-12-9973.13.1培养基培养基n 此外，要用专用的角匙取药品，避免交叉污染此外，要用专用的角匙取药品，避免交叉污染而影
48、响检验结果；而影响检验结果；n 培养基配制最好用蒸馏水或去离子水，避免使用培养基配制最好用蒸馏水或去离子水，避免使用自来水，因其中含有氯等抗菌物质；自来水，因其中含有氯等抗菌物质；n 不同类型的微生物对不同类型的微生物对pHpH值的要求不同，配制培养值的要求不同，配制培养基时应测调基时应测调pHpH值，如测定结果与所要求的值，如测定结果与所要求的pHpH值不符，值不符，则用则用lM NaOHlM NaOH或或lM HCllM HCl溶液进行调节。溶液进行调节。2022-12-9983.13.1培养基培养基n 制备好的培养基应及时使用，使用不完的，制备好的培养基应及时使用，使用不完的，如无特殊需
49、求，可室温或低温如无特殊需求，可室温或低温2-82-8保存。保存。n 如用塑料袋密封，保存期可延长，有产酸、如用塑料袋密封，保存期可延长，有产酸、产气等被污染迹象或干裂现象的则不能再使用。产气等被污染迹象或干裂现象的则不能再使用。2022-12-999表表1 1 培养基在培养基在2-82-8条件下保存的有效期条件下保存的有效期培养基种类培养基种类保存条件保存条件有效期有效期平板培养基平板培养基不装塑料袋不装塑料袋2周周塑料袋密封塑料袋密封8周周试管（棉塞）培养基试管（棉塞）培养基不装塑料袋不装塑料袋2周周-1个月个月塑料袋密封塑料袋密封2个月个月试管（螺旋盖）培养基试管（螺旋盖）培养基不装塑料
50、袋不装塑料袋2个月个月塑料袋密封塑料袋密封4个月个月2022-12-91003.13.1培养基培养基n 每批自制培养基必须做无菌试验和规定的质控每批自制培养基必须做无菌试验和规定的质控菌株测试，对各种不同培养基规定了专门的质控测试菌株测试，对各种不同培养基规定了专门的质控测试菌株。菌株。n 无菌培养试验可将无菌的培养基放入无菌培养试验可将无菌的培养基放入3737的培养的培养箱培养箱培养24244848小时小时(对于细菌培养基对于细菌培养基)或放入或放入2828的培的培养箱中培养养箱中培养5-75-7天天(对于细菌培养基以外的其它培养对于细菌培养基以外的其它培养基基)，以检查灭菌是否彻底。，以检
