1、1,宫颈癌实验室诊断技术 新进展,郑州大学第三临床医学院 李肖甫 email:lixiaofu1964 Tel:13949110038,2,2014年中国肿瘤登记年报,中国每分钟都有6人被确诊为癌症 每年因癌症死亡病例达270万 每78人中就有一人因癌症死亡 如何寻找更有效的癌症早诊、早治方案成为关注焦点,3,4,宫颈癌的流行病学,宫颈癌仍然是全世界妇女中最常见的癌症之一 每年国内新发宫颈癌人数为13.15万（占全球新发宫颈癌人数24.5%），每年因宫颈癌死亡人数为5万余人 发达国家宫颈癌发病率和死亡率下降，主要归功于癌前普查项目的开展（美国下降了70%） 宫颈癌前病变并没有实质性的减少,5,
2、宫颈癌的流行病学,子宫颈癌是一个感染性疾病 它是可以预防，可以治疗、治愈和消灭的 致癌原因是HPV病毒 人类癌症发病中唯一可以完全确认致癌的病毒 预防HPV infection 即可预防CC 没有HPV infection 就不可能罹患CC,6,7,8,宫颈癌病因的研究,1977年laverty 在电镜下观察到宫颈癌组织中存在HPV颗粒 (ActaCytol)1977,21:114 1982年zur hausen 提出HPV病毒与宫颈癌发病有关 国内外学者就HPV与宫颈癌的关系进行了大量研究（zur hausen 1991） 1995年IARC (International Agency fo
3、r Research on Cancer)专题会议认为： HPV感染是宫颈癌的主要原因 1996年WHO: HPV感染是引起宫颈癌的首要因素（Turek 1996） HPV vaccine 研究（late 90s） HPV vaccine 有效（2002） HPV vaccine 获准（2006）,9,Nobel Prizewinner Herald zur Hausen，in Physiology and Medicine for his discovery that the human papilloma virus (HPV) causes cervical cancer in 2008
4、,宫颈癌筛查手段,细胞学筛查方法 巴氏涂片方法 液基细胞学方法 分子生物学方法 HPV DNA、mRNA检测 HPV L1蛋白检测 HPV E6/E7,其它 FISH技术检测3号染色体长臂扩增 测序技术、HRM技术检测HPV甲基化 宫颈细胞DNA定量分析 HPV病毒游离、整合,细胞学筛查,优点 简单、快捷、早期有效降低了宫颈癌的发生率和死亡率 检测出病变细胞 缺点 需要专业的细胞病理医生 我国细胞病理学医生相对缺乏，尤其在基层医院 细胞病理缺乏严格的准入制度,宫颈癌防治理念,宫颈癌的目标、方向：“精确筛查、风险管理” 相对于现有的筛查技术而言，细胞学筛查实际上是初级检查，不是疾病的最终诊断 筛
5、查是风险提示，不是风险确定 筛查是大人群概念，精确筛查是终极目标 细胞学筛查发现的是病人，分子筛查技术才能提示可能成为病人但还不是病人的人群 细胞学需要结合基因、分子诊断技术才可能做到精确筛查，风险分层,12,分子生物学方法,HPV DNA、mRNA检测,问题 ？,HPV型别不同感染结局是否相同？ HPV感染后发展为持续性感染时间如何界定？ HPV感染机体清除病毒与什么相关？ HPV感染后病变进展与机体、病毒差异间的关系？ HPV感染细胞学和组织学正常，感染者是否称病人？,14,15,HPV感染与宫颈上皮内瘤变（CIN）的关系,HPV感染（特别是高危型、持续性）感染引起CIN和CC CIN1
6、30% CIN2 50% CIN3 65% CC 99.8% HR-HPV16、18 RR 100-150 在宫颈癌细胞中检测到HPV基因片段的存在 动物实验模型中得到了证实 对E6、E7功能进行了研究,16,HPV感染与宫颈上皮内瘤变（CIN）的关系,连续两次HPV阳性 10年内CIN3的发生率为 20% 如果连续两次HPV阴性 10年内CIN3的发生率仅为 2.3% 5年内CIN3的发生率仅为 0.5% Kjaer S, Hogdal E, Frederiksen K et al. Cancer Res 2006; 66: 1063010636,17,HPV virus events,无临
7、床症状，检测不出病变 病毒携带 上皮细胞形态正常 清除 HPV（+） 迁延性（latent） 持续存在 VIA（+） Col（+） 。,亚临床感染无症状，肉眼无异常,获得性感染潜伏期,HPV outcome,临床型感染症状，肉眼可见，镜下病变,18,HPV virus events,正常细胞学妇女HPV感染率 （全球100万分标本，1995-2009） -2010年EUROGIN,19,HPV virus events,不同病变HPV阳性率 -from EUROGIN 2010,20,HPV virus events,One HPV virus, one lesion,21,HPV virus
8、 events,HPV类型 低危型：6、11、42、43、44（40、54、61、72、81) 高危型：16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、68（26、66、82） 各国、各地区致癌HPV种类具有差异,22,HPV virus events,HPV分型可区分持续感染或反复感染 HPV分型可区分单一感染和多重感染 不同型别患病风险不同；致病性存在差异 不同型别不同的处理方案 相同细胞及组织学类型 HPV阳性与阴性要区别对待 不同HPV感染型别要区别对待,23,HPV检测方法,细胞学 斑点印迹法 荧光原位杂交法 原位杂交法 southern杂交法 PCR
9、HC2（杂交捕获法）,24,25,HPV检测方法比较,26,27,HPV testing-proceed with cautions,美国和全球医学模式正在/已经改为 询证医学模式(evidence-based medicine) 意味着我们的医疗决策必须基于获得的新数据。因此，我们不断通过文献和各种学术会议或得新知识和发展 在美国，任何FDA批准的药品/食品在他们上市前必须经过严谨的临床试验，并且这些结果必须是验证,FDA approved,FDA批准了四种HPV检测方法 1999年 Qiagen/Digene的Hybrid Capture2 DNA 13 2009 年 Hologic的Ce
10、rvista DNA 14 2011年 Roche的Cobas HPV DNA 2+N 2013.11 Hologic Gen-Probe的Aptima E6/E7mRNA,28,29,30,31,32,33,专家合影,会议现场,ASCCP前任主席Dr.Daron Gale Ferris教授,郎景和院士,乔友林教授,魏丽惠教授,王建六教授主持开幕式,大会总结,需识别可能进展成为宫颈癌的癌前病变（最大化筛查的益处） 需避免对一过性的HPV感染及其相对应的良性病变的探查和不必要的治疗，因为它们不一定有恶性进展 (最小化筛查的潜在危害) 单纯检测病毒-DNA （HPV感染者） 发现病变-E6/E7R
11、NA (真正有高风险的人群 ),36,HPV检测方法比较,HC2(Hybrid capture) 当时称：HPV检测的最好方法-提高妇女健康和防止宫颈癌的一场革命 检测高度病变（HSIL）的敏感度88-100% 直接检出13种HR-HPV，测其全长（8.3Kb） 高阴性预测值（NPV）99%-100% 高度重复性 可报告病毒负荷量（virus loading）,37,对HPV Testing 的理解,HPV（+） HPV（+）不一定伴随CIN1或CIN2/3及CC HPV（+）指“high-risk” types of HPV 关注的要点是持续感染而非一过性感染 对30岁以前不必要HC2做筛查
12、 仅有HPV（+）不必作LEEP或CKC,38,对HPV Testing 的理解,病毒负荷量（virus loading） 表明感染的状态和致病的“危险性” 和CIN并不完全平衡 和年龄有关，年龄30岁的high VL常意味着高级别CIN 治疗后的VL应下降或消失，持续阳性或上升表明残留或重复感染,39,HPV感染、宫颈癌与年龄的关系,40,HPV检测的意义和用途,筛查 ASCUS、LSIL的分流 CIN、CC治疗后的追踪,41,42,43,44,HPV L1蛋白检测,45,L1 主要衣壳蛋白,L2次要衣壳蛋白,Adapted from Doorbar,JT. J Clin Virol 32:
13、7-15, 2005,HPV L1 Protein is Lost During Progression to CIN2+,CIN 1,CIN 2,CIN 3,Virus Producing,Less-productive,Non-productive,47,HPV L1 细胞定位,Cellular localization of L1 protein in CIN I,HPV L1 核内定位,DAB staining,AEC staining),临床的意义,细胞学,HPV L1,正常,异常,异常,正常,阴性,阴性,阳性,阳性,临床意义,无HPV感染或无临床意义,存在发展到CIN2+低风险,存
14、在发展到CIN2+高风险,HPV感染阶段，但无疾病,51,HPV E6/E7 mRNA检测,mRNA可代表病毒的转录活性，体现致癌风险 致癌作用使E2开放读码框损坏 癌基因E6/E7上游基因调节发生异常 E6/E7蛋白过表达 使p53、pRb等抑癌基因失活 检测癌基因表达可通过检测mRNA来实现,52,53,细胞DNA定量分析,异常细胞核酸异常增生（含量增加） 核酸改变早于细胞形态改变 定量分析细胞DNA改变可以直接、简单、判断细胞是否发生癌变 自动化、智能化、标准化、且能够进行大规模筛查的客观筛查技术,54,细胞DNA定量分析,55,宫颈脱落细胞hTERC基因检测-FISH,hTERC 基因
15、在肿瘤发生、发展中发挥了一定作用 hTERC 对端粒酶活性至关重要,而端粒酶活性与肿瘤发生密切相关 在宫颈癌潜伏期即可检测到 hTERC扩增 hTERC 检测可用于宫颈癌早期诊断,且hTERC 扩增水平与肿瘤恶性程度呈正相关,可用于预测病情进展,宫颈癌可能发病机制,图7 hTERC基因FISH结果图,扩增信号,对照信号,红绿信号比2 ：2（未扩增）,红绿信号比6 ：5（扩增）,FISH 非放射性原位杂交技术 结果,1040,红绿信号比6 ：2（扩增）,红绿信号比4 ：3（扩增）,hTERC基因FISH结果图,1040,HPV 甲基化,表观遗传是指非基因序列改变所致基因表达水平的变化,这种变化可
16、通过减数分裂或/和有丝分裂遗传 表观遗传修饰影响细胞生长、分化、凋亡、转化以及肿瘤发展相关基因的转录 发现HPV的L1、L2 、 LCR等的甲基化在不同级别宫颈涂片中存在差异,甲基化检测的未来,希望通过HPV特定位点的定量甲基化状态的检测寻求其与HPV致病性的相关性 众多的HPV感染者中识别可能发展为宫颈癌前疾患或宫颈癌的患者 对这部分患者密切追踪或给以相应的治疗,这样既节约了医疗资源又提高了宫颈癌的防治效果,In advanced diseases , high percentage of methylation in certain genes are observed.,62,基因甲基化
17、是造成癌症的主因,2020/4/7,Confidential,甲基化增加是宫颈癌重要警讯,SOURCE: NATURE REVIEWS | CANCER VOLUME 14 | JUNE 2014 | 397,检测甲基化方法,甲基化敏感性限制性内切酶一PCR/Southern法 甲基化特异性PCR法 甲基化敏感性单核苷酸引物延伸法 结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法 甲基化敏感性单链构象分析法 甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳 甲基化敏感性解链曲线分析HRM 直接测序法,HPV 游离、整合,HPV Genome Episomal & Intergratation,From Beutner, KR et
18、 al, “Human Papillomavirus and Human Disease.“ Am J Med 1997; 102(5A):9-15.,High-grade Precursor,Invasive Cancer,Genital warts,67,Immunosurgery & Immunoevasion in the HPV Infected Cervical Cells,CD8 Cell,Cytotoxic T Cell,APC,CD4 Cell,Helper T Cell,B Cell,Plasma Cell,Antibody,IL-2, IL-4, IL-5,IL-2,Cl
19、ass I MHC,Class II MHC + TCR,HPV Virus,HPV L1 Capsid Protein,MHC=major histocompatibility complex APC=Antigen presenting cells ( Macrophage,B cell, Dendritic cell) TCR=T-cell receptor,L1 Antigen Presenting Cervical Cell,Immunoevasioned Cancer Cell,Acanthosis nucleus Cause lost L1 antigen binding site,Ig M,Immunosurgery Cell,HPV Infected Cell,Th-2,Th-1,APC,Superficial cell,Basal cell,将来方向,HPV与宿主细胞DNA整合位点、方式 整合位点的位置、结构特点、数量 细胞DNA被HPV整合后结构和功能发生了什么变化等,70,谢谢！,思考题,宫颈癌病因和何种病毒相关？ 目前临床常用宫颈癌筛查项目（至少2种）？ HPV(+)患者一定会进展为宫颈癌么？为什么？,
