1、基因克隆PPT课件基因工程及体外表达体系基因工程及体外表达体系酶载体方法第一节第一节 概述概述 定义定义 基本步骤基本步骤 意义意义定义：定义：应用酶学的方法，在体外将目的 基因与载体DNA结合成一具有自 我复制能力的DNA分子（复制 子、重组体），继而通过转化或 转染宿主细胞、筛选出含有目的 基因的转化子细胞，再进行扩 增、提取获得大量同一DNA分子 拷贝，或其表达产物。Recombinant DNA technology Gene cloning Molecular cloning Gene engineering Genetic engineering二、基本步骤二、基本步骤目的基因的获
2、得；目的基因的获得；目的基因与载体的连接；目的基因与载体的连接；重组重组DNADNA分子导入受体细胞；分子导入受体细胞；筛选出含重组筛选出含重组DNADNA分子的受体细胞克隆；分子的受体细胞克隆；克隆基因的表达及表达产物的检测和分离纯化。克隆基因的表达及表达产物的检测和分离纯化。三、意义三、意义重组重组DNADNA技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟；技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟；重组重组DNADNA技术缩短了进化时间；技术缩短了进化时间；重组重组DNADNA技术使人能对生物进行定向改造。技术使人能对生物进行定向改造。Stanley N.CohenStanley N.CohenHerber
3、t BoyerHerbert Boyer“工程工程鲫”、“工程工程鲤鲤”多利和它的孩子 沃尔小组成功克隆两只恒河猴 吴明杰小组：5只克 隆猪隆猪第二节第二节 重要的工具酶重要的工具酶限制性核酸内切酶；限制性核酸内切酶；DNADNA聚合酶；聚合酶；DNADNA连接酶；连接酶；T4T4多核苷酸激酶；多核苷酸激酶；碱性磷酸酶。碱性磷酸酶。一、一、Restriction EndonucleasesRestriction Endonucleases1 1 定义定义 限制性核酸内切酶（限制酶），是一类能识别和切割双链限制性核酸内切酶（限制酶），是一类能识别和切割双链DNADNA分子内特分子内特定碱基顺序的
4、核酸水解酶定碱基顺序的核酸水解酶。Restriction Endonucleases Made by bacteria and viruses.Over 500500 Restriction endonucleases exist.These will cleave over 80 80 specific sequencesspecific sequences.2 2 分类分类限制酶可分为限制酶可分为3 3型。型。I I型和型和型限制酶同时具有限制与修型限制酶同时具有限制与修饰两种功能饰两种功能;I I型限制酶没有固定的切割位点，随型限制酶没有固定的切割位点，随机切割产生非专一切口；机切割产生
5、非专一切口；型限制酶在型限制酶在DNADNA链上有特异切割位点，但其切割位点在识别位点以外。链上有特异切割位点，但其切割位点在识别位点以外。I I型和型和型限制酶在分子克隆中用型限制酶在分子克隆中用途不大。通常所指的限制酶是途不大。通常所指的限制酶是型酶。型酶。型酶对型酶对DNADNA水解有很强的特异性，水解有很强的特异性，它要求严格的顺序作为切割点。切点顺它要求严格的顺序作为切割点。切点顺序中有一个碱基的变异、缺失或修饰，序中有一个碱基的变异、缺失或修饰，便不再被水解，因此在分子克隆中常用，便不再被水解，因此在分子克隆中常用，它被誉为分子生物学家的手术刀。它被誉为分子生物学家的手术刀。Aga
6、rose Gel Electrophoresis3 3 命名原则命名原则 H HO OSmithSmith和和D DNathams(1973)Nathams(1973)提提议的命名系统已被公众所接受，其命名议的命名系统已被公众所接受，其命名原则如下：原则如下：从大肠杆菌（从大肠杆菌（E.E.colicoli）R R菌株分离到的菌株分离到的几种限制酶，分别表示为几种限制酶，分别表示为EcoEcoRR、EcoEcoR R、EcoEcoRR等。等。限制酶第一个字母限制酶第一个字母(大写，斜体大写，斜体)代表该酶的微代表该酶的微生物生物(寄主菌寄主菌)属名；第属名；第2 2、3 3个字母个字母(小写，
7、斜小写，斜体体)代表微生物种名。代表微生物种名。接下来的字母代表寄主菌的株或型。接下来的字母代表寄主菌的株或型。如果从一种菌株中发现了几种限制酶，则根据如果从一种菌株中发现了几种限制酶，则根据发现和分离的顺序用罗马字母表示。发现和分离的顺序用罗马字母表示。Restriction EndonucleaseEnzymes4 4 型酶作用特点型酶作用特点 型酶有严格的识别、切割型酶有严格的识别、切割顺序，以内切方式水解双链顺序，以内切方式水解双链DNADNA中的磷酸二酯键，产生的中的磷酸二酯键，产生的DNADNA片片段段55端为端为P P，33端为端为OHOH。识别顺序一般为识别顺序一般为4646个
8、碱基，通常是反个碱基，通常是反转重复顺序，具有转重复顺序，具有180180的旋转对称性的旋转对称性,也也称回文结构，称回文结构，palindrome,palindrome,具有对称结构的具有对称结构的DNADNA片段。一条链上的碱基顺序（例如从片段。一条链上的碱基顺序（例如从5533）和另一条链上从）和另一条链上从55 3 3的顺的顺序完全相同。例如，序完全相同。例如，5 GAATTC 35 GAATTC 3 3 CTTAAC 5 3 CTTAAC 5RE recognition/cleavage site are RE recognition/cleavage site are palind
9、romic DNA sequences,not palindromic DNA sequences,not palidromic as in“ABBA”.palidromic as in“ABBA”.E.x.E.x.EcoEcoR 5 GAATTC 3R 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 3 CTTAAG 55These sites are DNA sequence that are These sites are DNA sequence that are identical on both DNA strands.identical on both DNA strands.Q:Whi
10、ch of the following 2 DNA sequences is Q:Which of the following 2 DNA sequences is a potentional RE recognition site?a potentional RE recognition site?.5 AGTTGA 3 .5 GCACGTGC.5 AGTTGA 3 .5 GCACGTGC 33 Q:If show below is of a RE site,what is Q:If show below is of a RE site,what is the DNA sequence fo
11、r the remaining?the DNA sequence for the remaining?5 TCA _ _ _ 3 5 TCA _ _ _ 3 从理论上讲，如果从理论上讲，如果DNADNA链上的链上的A A、T T、C C和和G G四种碱基随机分布，根据限制酶识四种碱基随机分布，根据限制酶识别碱基的个数可估算限制酶的切割几率，别碱基的个数可估算限制酶的切割几率，同时也决定了它切割同时也决定了它切割DNADNA后产生的后产生的DNADNA片片段的长度。实际上，限制酶对段的长度。实际上，限制酶对DNADNA的切的切割是割是“全全”或或“无无”。识别识别4 4个碱基个碱基 1/41/4
12、4 4=1/256=1/256识别识别6 6个碱基个碱基 1/41/46 6=1/4096=1/4096识别识别8 8个碱基个碱基 1/41/48 8=1/65536=1/655365 5 型酶切割双链型酶切割双链DNADNA产生的切口产生的切口(1)(1)在识别顺序的对称轴上，对双链在识别顺序的对称轴上，对双链DNADNA同时同时切割，产生平头末端切割，产生平头末端(blunt end).(blunt end).5-GGCC-3 5-GGCC-3 HaeHae 5-GG CC-5-GG CC-3 3 3-CCGG-5 3-CC GG-5 3-CCGG-5 3-CC GG-5(2)(2)在识别
13、顺序的两个对称点切开在识别顺序的两个对称点切开DNADNA双链，产生带双链，产生带单链尾巴的粘性末端单链尾巴的粘性末端(cohesive end)(cohesive end)；从从55端切割产生端切割产生55端突出的粘性末端。端突出的粘性末端。(3)(3)从从33端切割产生端切割产生3 3端突出的粘性末端。端突出的粘性末端。6 6 限制酶使用中的注意事项限制酶使用中的注意事项 酶的活性单位：酶的活性单位：l l小时内在小时内在50l50l容积中酶解容积中酶解l g DNAl g DNA所需要的酶量。所需要的酶量。一般都要求较纯的底物一般都要求较纯的底物DNADNA；都需要；都需要MgMg2 2
14、和和TrisTrisHClHCl缓冲体系；通常在缓冲体系；通常在37(37(有些酶需要在有些酶需要在5065)5065)反应；反应；对离子强度的要求分为对离子强度的要求分为3 3个级别，即高盐个级别，即高盐(100mmol/LNaCl)(100mmol/LNaCl)、中盐、中盐(50mmol/LNaCl)(50mmol/LNaCl)和低和低盐盐(0l0mmol/LNaCl)(0l0mmol/LNaCl)。星号活力：限制酶在非标准反应条件下，能切星号活力：限制酶在非标准反应条件下，能切割一些与其识别顺序类似的序列，降低酶切的割一些与其识别顺序类似的序列，降低酶切的特异性。特异性。EcoRI 5G
15、 EcoRI 5G AATTC3 AATTC3 EcoRI EcoRI*5N5N AATTN3AATTN3在实验操作中在实验操作中 ，限制酶从冰箱中取出后，应立即置于冰浴中，操作时一般是，限制酶从冰箱中取出后，应立即置于冰浴中，操作时一般是将其它试剂加完后，最后加酶，操作迅速。将其它试剂加完后，最后加酶，操作迅速。当反应体系中有两种限制酶时，如何处理。当反应体系中有两种限制酶时，如何处理。7 7 少数有特殊性质的少数有特殊性质的型酶型酶 异源同工酶（异源同工酶（isoschizomerisoschizomer）:是从不同生物中分离出来是从不同生物中分离出来的酶，但有相同的识别顺序，切割的酶，但
16、有相同的识别顺序，切割DNADNA的位点可以相同，的位点可以相同，也可以不同。也可以不同。5 TTTAAA 33 AAATTT 5Aha或Dra5-TTT3-AAA+AAA-3TTT-55 GGTACC 33 CCATGG 55 GGTACC 33 CCATGG 5Kpn5 GGTAC3 CC 3 CATGG 5+Asp7185 G3 CCATC+GTACC 3 G 5 同尾酶（同尾酶（isocaudarnerisocaudarner）：为识别与切割顺序相互有关的）：为识别与切割顺序相互有关的酶。有些限制酶的识别序列包含在另一些限制酶的识别顺酶。有些限制酶的识别序列包含在另一些限制酶的识别顺序
17、中。这些酶虽来源不同，但它们能产生相同的粘性末端序中。这些酶虽来源不同，但它们能产生相同的粘性末端。5 GATC 33 CTAG 55 GGATC 33 CATGG 55 AGATCT 33 TCTAGA 5MboBamHBgl远距离裂解酶（远距离裂解酶（distant cleavagedistant cleavage）:这类酶的识别位点与切割位点不一致，这类酶的识别位点与切割位点不一致，但其切割位点与识别位点的距离是一定的，一般为但其切割位点与识别位点的距离是一定的，一般为1010个碱基左右。它们在某个碱基左右。它们在某一核苷酸区域与识别序列结合，然后滑行到识别序列以外的另一个位点进行一核苷
18、酸区域与识别序列结合，然后滑行到识别序列以外的另一个位点进行切割。切割。5NNNGAAGAGAAGANNNNNNNN NNN3E.x.Mbo可变酶：这类酶是可变酶：这类酶是型酶中的一个特例，它们的识别序列中型酶中的一个特例，它们的识别序列中1 1个或几个核苷酸个或几个核苷酸是可变的，并且其识别序列一般大于是可变的，并且其识别序列一般大于6 6个碱基对。个碱基对。E.x.Dra CACNNNGTG二、二、DNADNA聚合酶聚合酶功能：在体外合成功能：在体外合成DNADNA1 1 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶及其大片及其大片段（段（klenowklenow片段）片段）NCC35kD76
19、kD76kD53外切酶35外切酶53聚合酶53聚合酶35外切酶大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶klenowklenowklenowklenow片段片段片段片段klenowklenowklenowklenow片段片段片段片段用枯草杆菌蛋白酶裂解全酶大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶的用途的用途 催化催化DNADNA切切口平移，制口平移，制备高比活探备高比活探针；针；对对DNADNA分子分子进行末端标进行末端标记。记。5355555553333333Mg2+DNA酶dATP、dCTPdGTP、-32PdTTP大肠杆菌聚合酶（全酶）*T*T*T*
20、T*T*T用大肠杆菌用大肠杆菌DNADNA聚合酶进行切口平移聚合酶进行切口平移klenowklenow片断的主要用途片断的主要用途 末端终止法末端终止法测序；测序；合成合成cDNAcDNA第第二链；二链；双链双链DNA3DNA3端标记。端标记。555555333333限制性内切酶限制性内切酶Klenow DNA聚合酶聚合酶-32PdNTP5末端突出末端突出的的DNA3末端标记末端标记的的DNA32P末端标记的单末端标记的单链链DNA探针探针32P标记的标记的DNA利用利用KlenowKlenow片段进行片段进行3 3端标记端标记2 Tag DNA聚合酶用途：用途：PCRPCR和测序和测序3 3
21、 反转录酶（依赖于反转录酶（依赖于RNARNA的的DNADNA聚合酶，聚合酶，RDDPRDDP）能以单链能以单链RNARNA或单链或单链DNADNA为模板，按为模板，按5353方向合成方向合成DNADNA；有有5 35 3和和3 5RNA3 5RNA外切酶活性（外切酶活性（3 53 5外切活性又称外切活性又称RNARNA酶酶H H活活性）。性）。主要用途：主要用途：转录转录mRNAmRNA成为成为cDNAcDNA。4 4 末端脱氧核糖核酸转移酶末端脱氧核糖核酸转移酶(末端转移末端转移酶酶)催化脱氧核苷酸一个个地依次催化脱氧核苷酸一个个地依次加到加到DNA3DNA3末端。末端。功能：功能：主要用
22、途：主要用途：给载体或给载体或cDNAcDNA加上互补的多聚体尾巴，造成便加上互补的多聚体尾巴，造成便于重组的人工粘性末端；于重组的人工粘性末端；也可用于也可用于DNADNA片段片段33端标记。端标记。三、三、DNADNA连接酶连接酶作用：催化两个独立作用：催化两个独立DNADNA片断片断55磷酸基与磷酸基与33羟羟基之间形成磷酸二酯键。基之间形成磷酸二酯键。作用底物：作用底物：两个不同片段双链两个不同片段双链DNADNA间存在的互补粘性末间存在的互补粘性末端；端；两个双链两个双链DNADNA分子间的分子间的平末端；平末端；一条带切口的双链一条带切口的双链DNADNA分子；分子；一条带切口的一
23、条带切口的RNA/DNARNA/DNA杂交体。杂交体。四、四、T4T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶作用：作用：催化将催化将ATPATP的的-磷酸转移到磷酸转移到DNADNA链的链的55末端上。末端上。用途：用途：放射性标记放射性标记DNADNA链的链的55端，用于端，用于DNADNA测序等实验中；测序等实验中；用于连接反应，使缺少用于连接反应，使缺少55端磷酸的端磷酸的DNADNA片段或合成接头磷酸化。片段或合成接头磷酸化。五、碱性磷酸酶五、碱性磷酸酶 催化切除催化切除DNADNA、RNARNA和和dNTPdNTP上的上的55磷酸基团。磷酸基团。作用：作用：用途：用途：从从DNADNA片段上除去片段上除去55磷酸以防自身连磷酸以防自身连接；接；在用在用T4T4多核苷酸激酶和多核苷酸激酶和32P32P标记标记55末末端前，从端前，从RNARNA或或DNADNA上除去上除去55磷酸。磷酸。感谢下感谢下载载
