1、第十一章第十一章 荧光分析法荧光分析法 Fluoreometry荧光荧光10/4/2022 3:29:21 AMhttp:/ 用荧光来进行定性定量的分析方法用荧光来进行定性定量的分析方法荧光分析法。荧光分析法。光照光照 分子基态分子基态 激发态激发态 辐射跃迁辐射跃迁 荧光荧光可见可见-紫外光源紫外光源 分子荧光分析分子荧光分析 由荧光波长可确定物质分子结构由荧光波长可确定物质分子结构 由荧光强度可测物质的含量由荧光强度可测物质的含量 一、分子荧光一、分子荧光（一）、分子荧光的产生（一）、分子荧光的产生 分子在辐射能的照射下，电子跃迁至分子在辐射能的照射下，电子跃迁至单重激发态单重激发态，并以
2、并以无辐射弛豫方式无辐射弛豫方式回到回到第一第一单重激发态的单重激发态的最低振动最低振动能级能级，由此再跃回，由此再跃回基态或基态中其它振动能级时基态或基态中其它振动能级时所发所发出的光。出的光。基态和激发态基态和激发态 单重态和三重态单重态和三重态 辐射跃迁（光）和无辐射跃迁（热）辐射跃迁（光）和无辐射跃迁（热）激发单重态：激发单重态：用用S表示，表示，受激电子的自旋方向不变，受激电子的自旋方向不变，与基态电子自旋方向相反。与基态电子自旋方向相反。激发三重态：激发三重态：用用T表示，表示，受激电子自旋反转，与基态受激电子自旋反转，与基态电子自旋方向平行。电子自旋方向平行。概概 念念单重基态单
3、重基态激发单重态激发单重态激发三重态激发三重态单线态与三线态12 Mg的基态与第一激发态的基态与第一激发态3s3p12121212122S+1=12S+1=12S+1=3单线态单线态S0 单线态单线态S1 三线态三线态T1 S1S0 荧光辐射荧光辐射 T1S0 磷光辐射磷光辐射禁阻跃迁，改变自旋后S1T1S0S0激发单重态激发单重态S与激发三重态与激发三重态T的不同点：的不同点：1.能量高能量高2.激发单重态激发单重态平均寿命短平均寿命短，tS=10-8s,3.基态单重态到激发单重态基态单重态到激发单重态的激发为的激发为允许允许跃迁跃迁1.能量低能量低2.激发三重态激发三重态平均寿命长平均寿命
4、长，tS=10-4-1s,3.基态单重态到激发三重态基态单重态到激发三重态的激发为的激发为禁阻禁阻跃迁跃迁激发单重态激发单重态S激发三重态激发三重态T去活化过程去活化过程辐射跃迁辐射跃迁无辐射跃迁无辐射跃迁振动弛豫振动弛豫内转换内转换体系间跨越体系间跨越猝灭猝灭荧光荧光磷光磷光荧荧 光光 形形 成成 机机 制制单重态单重态第二激发态第二激发态第一激发态第一激发态三重态三重态荧光荧光磷光磷光内转换内转换体系体系跨越跨越振动弛豫振动弛豫基态基态振振动动弛弛豫豫荧光产生荧光产生过程过程荧光的产生荧光的产生eeee荧光荧光磷光磷光处于处于第一电子激发第一电子激发单重态最低振动能单重态最低振动能级的分子
5、发射光量级的分子发射光量子回到基态各振动子回到基态各振动能级能级，这一过程为，这一过程为荧光发射荧光发射处于第一电子激发处于第一电子激发三重态三重态最低振动能最低振动能级的分子发射光量级的分子发射光量子回到基态各振动子回到基态各振动能级，这一过程为能级，这一过程为磷光发射。磷光发射。不同点不同点起源不同起源不同波长不同波长不同寿命不同寿命不同吸吸收收峰峰磷磷光光峰峰荧光峰荧光峰 激发激发 光源光源 单色器单色器 样品池样品池 It F 单色器单色器 检测器检测器 发射发射 记录记录I0透过光透过光(二二)、荧光的激发和发射光谱、荧光的激发和发射光谱荧光的检测荧光的检测荧光光谱固定发射波长固定发
6、射波长，改变激发波长，改变激发波长，测荧光强度和激测荧光强度和激发光波长的关系。发光波长的关系。固定激发波长，固定激发波长，（为最大激发波为最大激发波长），长），测不同测不同波长时的荧光强波长时的荧光强度。度。荧光的激发光谱和发射光谱荧光的激发光谱和发射光谱激发光谱200250300350400450500荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱200260320380440500560620荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱磷光光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱荧光光谱特征荧光光谱
7、特征Stokes位移：位移：荧光波长一般比激发波长要长荧光波长一般比激发波长要长(前者能量较低前者能量较低)荧光光谱形状与激发波长无关；荧光光谱形状与激发波长无关；荧光光谱与激发光谱形状相似，呈镜像对称。荧光光谱与激发光谱形状相似，呈镜像对称。镜像对称规则镜像对称规则 通常通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（激发光谱）荧光发射光谱与它的吸收光谱（激发光谱）成成镜像对称关系。镜像对称关系。荧光光谱特征荧光光谱特征 荧光产生的必要条件荧光产生的必要条件 有吸收结构有吸收结构有高的有高的荧光效率荧光效率二、二、荧光与分子结构荧光与分子结构（一）（一）、荧光效率（、荧光效率（fluorescence ef
8、ficiencyfluorescence efficiency）吸收激发光的量子数发出荧光的量子数F分子结构与荧光的关系长共轭结构长共轭结构分子的刚性取代基类型共轭高荧共轭高荧光效率高光效率高刚性平面使刚性平面使荧光效率高荧光效率高1、给电子基团使荧光增强-OH,-OCH3,-NH2,-CN,-NR2;2、吸电子基团使荧光减弱-COOH,-NO2,-SH,-C=O,-X;3、-R,-SO3H,-NH3+等基团对荧光影响不明显。三、影响荧光强度的外部因素 A A、温度影响、温度影响 温度上升，荧光减弱温度上升，荧光减弱 B B、溶剂的影响、溶剂的影响 增大溶剂的极性使荧光增强增大溶剂的极性使荧光
9、增强 含重原子的溶剂（含重原子的溶剂（e.g.CBre.g.CBr4 4）使荧光减弱）使荧光减弱溶剂粘度降低荧光强度减弱溶剂粘度降低荧光强度减弱 C C、酸度的影响、酸度的影响 D D、荧光熄灭剂、荧光熄灭剂 激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互 作用，使能量转移，荧光强度减弱甚至消失。作用，使能量转移，荧光强度减弱甚至消失。E E、散射光、散射光散射光：当一束平行光投射在液体试样上，大部分被吸收或透过，小部分由于光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向改变，而向不同方向散射形成的光。散射光包括瑞利散射光和拉曼光瑞利散射光：无能量的交换，散射激发拉曼光：有
10、能量转移，散射 激发干扰的消除干扰的消除1）改变激发光的波长；2）更换溶剂；CCL4的拉曼光与激发光波长相近，其拉曼光几乎不干扰荧光测定。荧光定量分析方法荧光定量分析方法一、荧光强度与物质浓度的关系一、荧光强度与物质浓度的关系 I0 I F 在在ECl0.05时时，F=K C,溶液的荧光强度与溶液中荧光溶液的荧光强度与溶液中荧光物质的浓度呈线性关系；物质的浓度呈线性关系；在在ECl0.05，溶液的荧光强度与溶液中荧光物质的浓，溶液的荧光强度与溶液中荧光物质的浓度不呈线性关系；度不呈线性关系；荧光分析法的测定灵敏度高。荧光分析法的测定灵敏度高。)101()(00AffaffIIIIIxxxxex
11、1.!3!2132泰勒级数展开002.302.30fffII AI kbcKc)lg(0IIA AII100即吸收的强度入射的出射的xex1A=kbc定量关系通常 A0.05000.10.20.3AIfIf与A 的关系A与c正比，低浓度KcIf泰勒级数展开，仅取一项，x越小越符合定量关系二、定量分析法二、定量分析法校正曲线法校正曲线法比例法比例法 0SSXOXFFCFFC00XXSSFFCCFF F=F=K K（I I0 0-I-I）=K=K（I I0 0-I-I）=K =K（1-101-10ECLECL）=K=K（1-e1-e2.3ECL2.3ECL）=2.3K =2.3KI I0 0ECL
12、ECL =KC =KC ECLECL0.050.050.05时，荧光强度同浓度的线性关系将向浓度轴偏离。荧光强度与物质浓度的关系分光法与荧光法定量比较 UV-VISUV-VIS分光法分光法 荧光法荧光法定量基础定量基础 A=lgI A=lgI0 0/I F/I F C C灵敏度灵敏度 与与 有关有关 与与 有关有关检测限检测限 10 10-6-6-10-10-9-9 10 10-9-9-10-10-12-12 灵敏度高选择性好灵敏度高选择性好光源单色器1样品池单色器2检测器放大与记录垂直方向 荧光光度计 与分光光度计的主要差别与分光光度计的主要差别 垂直测量方式垂直测量方式,消除透射光影响消除
13、透射光影响 两个单色器两个单色器，激发和发射，常用光栅，激发和发射，常用光栅荧光仪特点荧光仪特点 1 1 光源光源 A A、白炽灯：钨灯、卤钨灯、白炽灯：钨灯、卤钨灯 B B、气体放电灯：氢、氙、汞，、气体放电灯：氢、氙、汞，常用常用氙氙灯（波长：灯（波长：250-700nm 250-700nm）C C、激光光源、激光光源 2 2 单色器单色器 闪耀光栅闪耀光栅3 3 检测器检测器 光电倍增管光电倍增管 1.1.无机阳离子发生荧光的很少，但很多能与一些有机试无机阳离子发生荧光的很少，但很多能与一些有机试剂形成荧光络合物而被测定；剂形成荧光络合物而被测定；2.2.一些阴离子能使荧光减弱，可利用荧
14、光猝灭法测定；一些阴离子能使荧光减弱，可利用荧光猝灭法测定；3.3.脂肪族有机物分子能发生荧光的也不多，可与某些有脂肪族有机物分子能发生荧光的也不多，可与某些有机试剂反应后生成会发射荧光的衍生物加以测定；机试剂反应后生成会发射荧光的衍生物加以测定；4.4.芳香族化合物因有共轭结构，多数能发射荧光；芳香族化合物因有共轭结构，多数能发射荧光；5.5.弱荧光的芳香族化合物也可与荧光试剂作用生成弱荧光的芳香族化合物也可与荧光试剂作用生成强荧光衍生物以提高测量灵敏度。强荧光衍生物以提高测量灵敏度。故药物中的胺类、抗菌素、维生素、甾体类均可故药物中的胺类、抗菌素、维生素、甾体类均可用荧光法测定。该法在体内
15、药物定量分析中应用甚用荧光法测定。该法在体内药物定量分析中应用甚广。广。1.荧光和磷光在产生机制上有什么不同？荧光和磷光在产生机制上有什么不同？2.何谓荧光量子效率？哪些结构物质有较高荧光效率？何谓荧光量子效率？哪些结构物质有较高荧光效率？3.以下物质中可能有最强荧光的物质是（以下物质中可能有最强荧光的物质是（）。）。A CH3 CH2 CH2 CH3 BCH=CH2CDBr思思 考考 题题4.荧光光谱分析中的最主要光谱干扰是荧光光谱分析中的最主要光谱干扰是().A.激发光激发光;B.磷光磷光;C.拉曼光拉曼光;D.容器表面产生的散射光容器表面产生的散射光5 测量荧光强度时测量荧光强度时,要在
16、与入射光成直角的方向测量要在与入射光成直角的方向测量,这是因这是因为为().A.只有在与入射光成直角的方向上才有荧光只有在与入射光成直角的方向上才有荧光;B.在成直角方向测量可以避免散射光的影响在成直角方向测量可以避免散射光的影响;C.在成直角方向测量可免除透射光的影响在成直角方向测量可免除透射光的影响;D.荧光的强度比入射光强荧光的强度比入射光强6.（）荧光光谱形状与激发光的波长无关。（）荧光光谱形状与激发光的波长无关。7.荧光光谱的特征？荧光光谱的特征？1.所谓荧光，即指某些物质经入射光照射后，吸收了入射光的能量，从而辐射所谓荧光，即指某些物质经入射光照射后，吸收了入射光的能量，从而辐射出
17、比入射光出比入射光()。A.波长长的光线波长长的光线 B.波长短的光线波长短的光线 C.能量大的光线能量大的光线 D.频率高的光线频率高的光线2.下列说法正确的是下列说法正确的是()A 荧光发射波长永远大于激发波长荧光发射波长永远大于激发波长 B 荧光发射波长永远小于激发波长荧光发射波长永远小于激发波长 C 荧光光谱形状与激发波长无关荧光光谱形状与激发波长无关 D 荧光光谱形状与激发波长有关荧光光谱形状与激发波长有关3荧光物质的荧光强度与该物质的浓度成线性关系的条件是荧光物质的荧光强度与该物质的浓度成线性关系的条件是()A.单色光单色光 B.ECl0.05 C.入射光强度入射光强度I0一定一定
18、 D.样品池厚度一定样品池厚度一定判断题判断题1荧光光谱是荧光物质的特性，所以同一荧光物质在不同的溶剂中具有相荧光光谱是荧光物质的特性，所以同一荧光物质在不同的溶剂中具有相同的荧光光谱。同的荧光光谱。2荧光光谱的形状与激发光谱的形状常形成镜像对称。荧光光谱的形状与激发光谱的形状常形成镜像对称。3在一定条件下，物质的荧光强度与该物质的任何浓度成线性关系。即：在一定条件下，物质的荧光强度与该物质的任何浓度成线性关系。即：4.荧光光谱的形状与激发波长有关。选择最大激发波长，可以得到最佳荧光荧光光谱的形状与激发波长有关。选择最大激发波长，可以得到最佳荧光光谱。光谱。5荧光分光光度计中光源发出光到检测器检测荧光，其光荧光分光光度计中光源发出光到检测器检测荧光，其光 路为一条直线。路为一条直线。KcF 未经任何处理即可用于细胞标记未经任何处理即可用于细胞标记用量子点检测肿瘤细胞用量子点检测肿瘤细胞
