1、第四章第四章 聚合酶链式反应 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。4.1 PCR技术简史4.1 PCR技术简史4.1 PCR技术简史PCR反应双链双链DNA在受热后，配对碱基的氢键在受热后，配对碱基的氢键断裂，断裂，DNA两条链分开成为单链。两条链分开成为单链。TGCATGCATATCTTGAACTAGAACTTGACGTACGTATGCATGCATATCTTGAAC3 5 5 3 3 5 5 3 TAGAACTTGACGTACGTA95oC模板模
2、板模板（模板（template）95oCTGCATGCATATCTTGAAC3 5 5 TAGAACTTGACGTACGTA3 人工合成的单链人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板所要扩增的模板DNA双链的双链的5端相同。端相同。模板模板模板模板ATCTTGAAC5 3 ACGTACGTA5 3 引物引物引物引物引物（引物（primer）:40-65oCDNA聚合酶按碱基配对原则延伸聚合酶按碱基配对原则延伸DNA链。链。TGCATGCATATCTTGAAC3 5 5 TAGAACTTGACGTACGTA3 模板模板模板模板ATCTTGAAC5 ACGTA
3、CGTA5 TaqTaq72oC理论上理论上25-30次循环就可以合成次循环就可以合成225-230条条DNA。变性变性复性复性延伸。延伸。（5）1个循环的结果个循环的结果（1）第一步）第一步 变性（变性（denature）94-95 oC下下5分钟，模板分钟，模板DNA双链双链完全变性成单链。完全变性成单链。（2）第二步）第二步 复性（复性（anneal）50-60 oC下下1分钟，引物与模板复性。分钟，引物与模板复性。引物的浓度高，引物的浓度高，引物的链短。引物的链短。94 oC下下1分钟，新合成的分钟，新合成的DNA双双链又变性成单链模板。链又变性成单链模板。（4）第四步）第四步 变性（
4、变性（denature）72 oC下下1-2分钟，分钟，Taq DNA聚合酶聚合酶在引物的在引物的3端上加上核苷酸。端上加上核苷酸。第二步第二步第三步第三步第四步第四步复性复性延伸延伸变性变性95oC 5min50oC 1min72oC 2min94oC 1min需要的模板量极低。需要的模板量极低。（1）特异性强）特异性强 PCR使用专门合成的使用专门合成的DNA引物。引物。延伸过程是在高温下进行。延伸过程是在高温下进行。（2）敏感性高）敏感性高 这就避免了一般这就避免了一般DNA聚合酶污染和非引物延聚合酶污染和非引物延伸形成的伸形成的DNA。提高了反映的特异性。提高了反映的特异性。理论上只要
5、一条模板链，理论上只要一条模板链，32次循环就可合成约次循环就可合成约109条！条！RT-PCR：对模板的纯度要求低。对模板的纯度要求低。（5）可以扩增）可以扩增mRNA 先用逆转录酶将先用逆转录酶将mRNA合成合成cDNA，再以再以cDNA为模板进行扩增。为模板进行扩增。（3）快速）快速 整个整个PCR过程约过程约4小时即可完成。小时即可完成。不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定或包埋的组织切片也可以直接用于作模板。或包埋的组织切片也可以直接用于作模板。自从自从H.A.Erilish分离出耐高温的分离出耐高温的Taq DNA聚合聚合酶，代替大肠杆菌酶，
6、代替大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶Klenow片断片断（37 oC)，PCR技术才进入实用阶段。技术才进入实用阶段。（1）Taq DNA聚合酶聚合酶 Taq DNA聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高温，非常适合温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求。过程的反复高温变性要求。热稳定性热稳定性最适温度：最适温度：72-78 oC 延伸速度：延伸速度：约约1000nt/min酶分子酶分子 最长延伸长度：最长延伸长度：6.7kb Taq酶的功能缺点酶的功能缺点具有具有53聚合酶活性和聚合酶活性和53外切酶活外切酶活性，但没有性，但没有35外切酶活性。外切酶活性。合成超过合成
7、超过600bp长度的长度的DNA就有可能出现就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序。错配，用于克隆基因时必须测序。金属离子敏感（尤其是金属离子敏感（尤其是Mg2+）。）。当当dNTP（能结合（能结合Mg2+）的浓度为）的浓度为0.7-0.8mmol/L时，时，MgCl2的最佳浓度应是的最佳浓度应是2.0mmol/L。50mmol/L KCl也能激活也能激活Taq DNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。与待扩增的模板与待扩增的模板DNA区段的两区段的两3端端序列互补（序列互补（5端相同）的短端相同）的短DNA。位置位置3 3 即即2.75 1011 bp的基因组中有一次的基因组中有一次完全与完全与
8、19个核苷酸的序列相同的个核苷酸的序列相同的机会（或机会是约机会（或机会是约210-11）。）。理论计算：理论计算：419=2.75 1011。一般引物设计为长一般引物设计为长1530bp。5端根据需要可设计成某个内切酶的切点端根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序、顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位点或聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，方便与以后操作。生物素标记等，方便与以后操作。5ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3 3GCTAGCTACTTAAG5 3端必须与模板正确配对，端必须与模板正确配对，5端可以不配对。端可以不配对。templateprimer尽可能提高尽可
9、能提高G+C含量，以提高引物含量，以提高引物与模板的结合力与模板的结合力避免连续相同碱基排列或内部回文序列避免连续相同碱基排列或内部回文序列.5GGCAGTCTGCCAGTCTAC3 CTGCCAGTCTAC3 GACGG5 T发卡结构发卡结构1）2）两个引物之间不能有两个以上的两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。连续碱基序列互补。5GGTCTGCCAGTCTAC3 3CAGGACTTAGTCACT5 primer1primer2Upstream primer vs Downstream primerSense primer vs Antisense primerPrimer1 vs
10、 Primer2Forward primer vs Reverse primerTm=（G+C)4+(A+T)2当引物中的（当引物中的（G+C）含量低于）含量低于50%时，复性温度低于时，复性温度低于55 oC。适当提高复性温度可以提高引物与模板结适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现。合的特异性，减少非特异产物的出现。实际复性温度选择低于实际复性温度选择低于Tm值值5 oC。手工计算：手工计算：一般估计：一般估计：引物的浓度引物的浓度一般使用终浓度各一般使用终浓度各0.2 mol/L。简并引物简并引物如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸如果引物的序列是从基因
11、产物蛋白质的氨基酸序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物。几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物。设计多组引物，结合位点依次位于前一组设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。引物之间。增加扩增产物的特异性。引物设计现在多用专业软件引物设计现在多用专业软件 1324如如Primer5.0等等但不能有蛋白质变性剂、但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、酶、Mg2+的的螯合剂等影响螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。聚合酶的
12、活性。模板的量：模板的量：不能太多，不能太多，100 l反应体系中反应体系中100ng足够。足够。纯度：纯度：PCR对模板对模板DNA的纯度要求不高。的纯度要求不高。一定范围内提高退火温度；缩短退火和延伸时间，可减少错误引发及 多余的DNA聚合酶参与酶促延伸的机会；降低引物和酶的浓度可以减少错误引发，尤其是能减少引物二聚体的引发；改变Mg2+的浓度；4.7 提高提高PCR扩增的特异性扩增的特异性 引物设计的特异性；减少循环次数；热启动（Hot Start）采用二对引物即外引物和内引物进行扩增来 提高扩增的特异性。典型的引物典型的引物1到到30个核苷酸长个核苷酸长；选择选择GC含量为含量为45到
13、到55碱基的分布是随机的；碱基的分布是随机的；避免引物间和引物内产生碱基以上互补；避免引物间和引物内产生碱基以上互补；避免避免3末端的错误配对末端的错误配对；设计设计5端和中间区为端和中间区为G或或C的引物；的引物；避免引物对避免引物对3末端存在互补序列末端存在互补序列；避免避免3末端富含末端富含GC，设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。避免存在可能会产生内部二级结构的序列避免存在可能会产生内部二级结构的序列。4.7 引物设计的基本原则：引物设计的基本原则：引物的特异性引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性它序列无明显同源性引物量引物量
14、：每条引物的浓度：每条引物的浓度0.1 1umol或或10 100 pmolRT-PCR 引物设计特别注意：跨越两引物设计特别注意：跨越两个外显子个外显子附加序列附加序列:目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列限制位点和启动子序列，可以加入到引物5端而不影响特异性。引物引物5 5端修饰技术端修饰技术 修修 饰饰 法法 用用 途途附加核酸序列：附加核酸序列：酶切位点酶切位点 克隆（如定向克隆）克隆（如定向克隆）噬菌体启动子噬菌体启动子 合成合成RNARNA探针、测序探针、测序蛋白质结合序列蛋白质结合序列 产物纯化、检测产物纯化、检测核糖体结合序列核糖体结合序列 高效表达高效表达其它
15、其它 构建载体、重组子等构建载体、重组子等巢式PCR：是为了增加扩增的灵敏度是为了增加扩增的灵敏度,对已知序列设计出对已知序列设计出第一对引物第一对引物,扩增扩增25个循环个循环,然后根据序列设然后根据序列设计第二对引物计第二对引物(在第一对引物内部在第一对引物内部),如此扩增如此扩增,不受平台效应限制不受平台效应限制,灵敏度高。灵敏度高。选定一个温度范围，如选定一个温度范围，如5035，每个温度，每个温度2循环，然后在循环，然后在35度度15循环。其原理是，随着退循环。其原理是，随着退火温度的降低，特异性逐步降低，但特异性条火温度的降低，特异性逐步降低，但特异性条带在温度较高时已经扩增出来，
16、其浓度远远超带在温度较高时已经扩增出来，其浓度远远超过非特异性条带，随着退火温度的降低，特异过非特异性条带，随着退火温度的降低，特异性条带优先被扩增。这种方法的退火温度范围性条带优先被扩增。这种方法的退火温度范围较大，在不知道最佳退火温度时比较适合。较大，在不知道最佳退火温度时比较适合。降落PCR竞争引物PCR：有一个碱基变化的两种引物在较宽松的复性条有一个碱基变化的两种引物在较宽松的复性条件下竞争件下竞争DNA模板，其中只有完全互补的引物模板，其中只有完全互补的引物才能大量配对。该法可用于测定某一才能大量配对。该法可用于测定某一DNA片段片段上是否带有某一已知碱基置换。上是否带有某一已知碱基
17、置换。准确配对引物 错配引物 共同引物 PCR oror模板 模板 or 不对称PCR 低浓度的引物（限制引物）首先被用完，随后低浓度的引物（限制引物）首先被用完，随后只有高浓度的引物，继续合成单链只有高浓度的引物，继续合成单链DNA。最后。最后产物中产物中99%是单链是单链DNA。3 5 5 3 引物少引物少用于扩增单链用于扩增单链DNA，单链，单链DNA更适于测序。更适于测序。技术关键：技术关键：两个引物的浓度相差两个引物的浓度相差100倍。倍。扩增两个引物外侧的未知序列扩增两个引物外侧的未知序列把线性把线性DNA模板转变成环形分子。模板转变成环形分子。templatetemplate3
18、5 5 3（传统（传统PCRPCR只扩增两个引物质之间的已知序列）。只扩增两个引物质之间的已知序列）。技术关键：技术关键：使引物的外侧序列使引物的外侧序列“转变转变”成内侧序列。成内侧序列。兼并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。兼并度越低，产物特异性越强。设计引物时应尽量选择兼并性小的氨基酸，并避免引物3末端兼并，因为3端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR；次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。兼并引物兼并引物PCRPCR（Degenerate PrimerDegenerate Primer）RT-PCR RT-PCR（reverse tran
19、scription-PCR）在逆转录酶的作用下、以在逆转录酶的作用下、以mRNAmRNA为模板合成互补为模板合成互补的的cDNAcDNA，再以，再以cDNAcDNA为模板进行为模板进行PCRPCR反应。反应。Temin,H.发现反转录酶，发现反转录酶，1975诺贝尔奖诺贝尔奖技术关键：技术关键：利用反转录酶，把利用反转录酶，把RNA反转录成反转录成cDNA，再以再以cDNA为模板进行为模板进行PCR扩增。扩增。RNA template3 5 下游引物下游引物cDNA first strand3 5 上游引物上游引物cDNA first strandcDNA second strand3 5 3
20、 5 反转录酶反转录酶Taq酶酶PCRReverse transcription(RT)下游引物下游引物上游引物上游引物Taq酶酶小牛肠磷脂酶 烟草酸性焦磷酸酶 实时荧光定量PCR常规定量PCR技术：对PCRPCR扩增反应的终产物进行定量 重复性差 半定量实时定量PCR技术：对PCRPCR扩增反应中每一个循环的产物进行 定量 Ct值的确定 相同模板在同一台PCR仪上进行96次扩增的扩增曲线图终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性荧光定量标准曲线 特异性强：具有引物和探针的双重特异性重复性好：同一标本的Ct值相同敏感性高：可检测百万分之一个感染细胞或10病毒 DNA分子线性范围广：定量的动态
21、范围达5-6个数量级，因而 相差较大的DNA起始拷贝数也不需稀释工作效率高：一次定量96个样品仅需1-2h 但仪器及 配套试剂极其昂贵利用引物的利用引物的5端序列不要求与模板严端序列不要求与模板严格配对，设计引物时引入突变序列。格配对，设计引物时引入突变序列。基因的体外诱变基因的体外诱变利用利用6bp长度的随机序列引物扩增细胞中的长度的随机序列引物扩增细胞中的总总DNA，将会得到许多非特异性产物，反，将会得到许多非特异性产物，反映了该引物序列在基因组中的分布状况。映了该引物序列在基因组中的分布状况。比较不同物种之间的基因组特征和相似性。比较不同物种之间的基因组特征和相似性。RAPD(Random amplified polymorphism DNA)在医学上诊断的应用在医学上诊断的应用 现在无认是艾滋病、癌症等遗传性疾病遗传性疾病，还是传染性疾病传染性疾病，很多均已建立起了PCR检测技术平台，只需对病人的血液DNA进行一定的PCR反应，就可进行相应诊断，在严格操作条件的情况下比其它方法简便灵敏。
