1、第十一章第十一章 色谱分析概论色谱分析概论 分析化学分析化学(下下 第三版第三版) 物质的性质是选择分离方法的前提和基础物质的性质是选择分离方法的前提和基础 Molecular charge, size, mass; Bond polarities Redox potential Ionization constants Isomer structure or chirality 一、色谱法的起源一、色谱法的起源 二、色谱法的定义和用途二、色谱法的定义和用途 三、色谱法的特点三、色谱法的特点 四、色谱法的发展四、色谱法的发展 五、色谱法的分类五、色谱法的分类 第一节第一节 概述概述 一、色谱法
2、的起源一、色谱法的起源 1创立：创立：1906年年，俄国植物学家俄国植物学家Tsweet 植物色素分离植物色素分离见图示见图示 2现状：一种重要的分离现状：一种重要的分离、分析技术分析技术 分离混合物各组分并加以分析分离混合物各组分并加以分析,还可以进还可以进 行制备行制备 固定相固定相除了固体除了固体，还可以是液体还可以是液体 流动相流动相液体或气体液体或气体 色谱柱色谱柱各种材质和尺寸各种材质和尺寸 被分离组分被分离组分不再仅局限于有色物质不再仅局限于有色物质 calcium carbonate （solid phase; stationary phase ） 色素混合液色素混合液 Pet
3、roleum ether (eluent） 1906年，年，Tsweet 发现色谱分离现象发现色谱分离现象 Chromatogra phic column Colored zones chromatography 植物色素分离图示植物色素分离图示 fractions 二、色谱法的定义及用途二、色谱法的定义及用途 定义定义：色谱法色谱法 (chromatography)是利用物质在是利用物质在 固定相和流动相中的分配系数不同固定相和流动相中的分配系数不同，使混合物中使混合物中 各组分分离的一种物理或物理化学的分离分析方各组分分离的一种物理或物理化学的分离分析方 法法。 以前学过的分离方法有：以前
4、学过的分离方法有： 1. 沉淀法沉淀法 是利用物质是利用物质溶解度的不同溶解度的不同而进行分离而进行分离。 2. 蒸馏法蒸馏法 是利用有机物是利用有机物沸点的差异沸点的差异进行分离进行分离。 3. 萃取法萃取法 是利用组分在水相和有机相是利用组分在水相和有机相（互不相互不相 溶溶）中的中的分配系数不同进行分配系数不同进行而分离而分离。 色谱法的用途色谱法的用途 用途：用途：色谱法色谱法已广泛用于各个领域已广泛用于各个领域，是是多组多组 分混合物首选的分离分析方法分混合物首选的分离分析方法。以以中国药中国药 典典20052005版版为例为例，一部一部收载收载中药中药11461146个个品种品种，
5、 用薄层用薄层色谱进行鉴别或含量测定的有色谱进行鉴别或含量测定的有15231523项项， 用用高效液相色谱进行定量分析的有高效液相色谱进行定量分析的有479479种种518518 项项，用气相色谱进行检测的有用气相色谱进行检测的有4747种种。二部收二部收 载的有载的有19671967个品种个品种，采采用用高效液相色谱法的高效液相色谱法的 品种有品种有848848种种。现在色谱法现在色谱法已已形成一门专门形成一门专门 的科学的科学。 三、色谱法的特点三、色谱法的特点 优点优点：“三高三高”、“一快一快”、 “一广一广” 缺点：缺点： 高选择性、高效能高选择性、高效能 、高灵敏度、分析速度快、高
6、灵敏度、分析速度快、 应用范围广应用范围广 对未知物分析的定性专属性差对未知物分析的定性专属性差 需要与其他分析方法联用需要与其他分析方法联用(GC(GC- -MS,LCMS,LC- -MS)MS) 四、色谱法的发展四、色谱法的发展 1、历史历史 3030年代年代 -胡萝卜素异构体成功分离胡萝卜素异构体成功分离，产生固液吸附色谱产生固液吸附色谱 4040年代年代 液液液分配色谱法液分配色谱法 、TLCTLC、纸色谱纸色谱 5050年代年代 GCGC出现使色谱具备分离和在线分析功能出现使色谱具备分离和在线分析功能 6060年代年代 推出了色谱质谱联用技术推出了色谱质谱联用技术（GCGC- -MS
7、MS） 7070年代年代 HPLCHPLC出现使色谱分析范围进一步扩大出现使色谱分析范围进一步扩大 8080年代年代 出现了超临界流体色谱法出现了超临界流体色谱法、毛细管电泳法毛细管电泳法 9090年代年代 崛起的电色谱法，兼有毛细管电泳法与微填充柱崛起的电色谱法，兼有毛细管电泳法与微填充柱 色谱法的优点色谱法的优点 2121世纪世纪 色谱科学将在生命科学等的前沿发挥他不可替代色谱科学将在生命科学等的前沿发挥他不可替代 的重要作用的重要作用 毛细管气相色谱法毛细管气相色谱法 开创人开创人-Golay Golay 为电学和数学家 1955加盟PE 公司，同年PE推 出世界上首台气相色谱仪 195
8、7年，Golay 发表第一篇毛 细管气相色谱报告，在一根91 米长的毛细管柱上，获得了 12000的理论塔板数 1958年，提出了著名的Golay方 程 毛细管气相色谱仪示意图 毛细管气相色谱仪 2、展望、展望 新型固定相和检测器新型固定相和检测器 手性固定相手性固定相、浸透限制性固定相浸透限制性固定相、灌注色谱固定灌注色谱固定 相相、生物色谱固定相等；蒸发光散射检测器生物色谱固定相等；蒸发光散射检测器 色谱新方法的研究色谱新方法的研究 超临界流体色谱法超临界流体色谱法（SFC）、毛细管电泳法毛细管电泳法 （CECE）、毛细管电色谱法毛细管电色谱法 （CEC） 色谱联用技术色谱联用技术 GC-
9、MS、LC-MS、GC-FTIR 色谱专家系统色谱专家系统 是一种色谱计算机联用技术是一种色谱计算机联用技术 五、色谱法的分类五、色谱法的分类 1按两相分子的聚集状态分类按两相分子的聚集状态分类 流动相流动相 固定相固定相 类型类型 液相色谱液相色谱 液体液体 固体固体 液液-固色谱固色谱 液体液体 液体液体 液液-液色谱液色谱 气体气体 固体固体 气气-固色谱固色谱 气体气体 液体液体 气气-液色谱液色谱 气相色谱气相色谱 超临界流体色谱法超临界流体色谱法(SFC)流动相为超临界流体流动相为超临界流体 (supercritical fluid ) 2按固定相的固定方式分类按固定相的固定方式分
10、类 3按分离机制分类按分离机制分类 平面色谱平面色谱 纸色谱纸色谱（paper C ） 薄层色谱薄层色谱（thin layer C） 高分子薄膜色谱高分子薄膜色谱( (Film C) ) 柱色谱柱色谱 填充柱色谱填充柱色谱（packed column） 毛细管柱色谱毛细管柱色谱( (capillary column) ) 分配色谱分配色谱(partition C) 吸附色谱吸附色谱(adsorption C) 离子交换色谱离子交换色谱(ion exchange C) 空间排阻色谱空间排阻色谱(size exclusion C) 毛细管电泳法毛细管电泳法(capillary electropho
11、resis) 毛细管电色谱法毛细管电色谱法(CEC)(CEC) 毛细管电泳毛细管电泳(capillary electrophoresis) 液液- -固吸附色谱固吸附色谱 liquid-solid adsorption chromatography 固定相固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使 用的是510m的硅胶吸附剂； 流动相流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有 官能团的化合物和异构体有较高选择性； 缺点缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾； 液液- -液分配色谱液分配色谱 liq
12、uid- liquid partition chromatography 固定相与流动相均为液体固定相与流动相均为液体（互不相溶互不相溶）； 基本原理基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流 动相的极性小于固定液的极性（正相正相 normal phase），反之 ，流动相的极性大于固定液的极性（反相反相 reverse phase）。 正相与反相的出峰顺序相反； 固定相固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合 到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。 离子
13、交换色谱离子交换色谱 ion-exchange chromatography 固定相固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 流动相流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶 液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液； 基本原理基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应； 组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存 在形式等有关。亲和力大，保留时间长； 阳离子交换：RSO3H +M+ = RSO3 M + H + 阴离子交换：RNR4OH +X- = RNR4 X + OH- 应用 应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。 排阻色谱排阻色谱 size- e
14、xclusion chromatography 固定相固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)； 原理：原理：按分子大小分离。 小分子可以扩散到凝胶空隙， 由其中通过，出峰最慢；中等 分子只能通过部分凝胶空隙， 中速通过；而大分子被排斥在 外，出峰最快；溶剂分子小， 故在最后出峰。 全部在死体积前出峰； 可对相对分子质量在100- 105范围内的化合物按质量分离 亲和色谱亲和色谱(AC)(AC) Affinity chromatograph 原理原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性 亲和力，进行选择性分离。 先在载体表面键合上一 种具有一般反应性能的所 谓间隔臂(环氧、联胺等)， 再连
15、接上配基(酶、抗原等) ，这种固载化的配基将只 能和具有亲和力特性吸附 的生物大分子作用而被保 留。改变淋洗液后洗脱。 第二节 色谱基本概念 一、色谱过程、分离原理及特点一、色谱过程、分离原理及特点 二、色谱流出曲线和有关概念二、色谱流出曲线和有关概念 三、分配系数与色谱分离三、分配系数与色谱分离 一、色谱过程、分离原理及特点一、色谱过程、分离原理及特点 色谱过程色谱过程 动画动画 指被分离组分在两相中的指被分离组分在两相中的“分配分配”平衡过程平衡过程 以吸附色谱为例以吸附色谱为例见图示见图示 吸附吸附 解吸解吸再吸附再吸附 再解吸再解吸 反复多反复多 次洗脱次洗脱被测组分分配系数不同被测组
16、分分配系数不同 差速迁差速迁 移移 分离分离 next 慢慢 中等中等 快快 流动相流动相 色谱的一般过程色谱的一般过程 back 图示 分配系数的微小差异分配系数的微小差异吸附能力的微小差异吸附能力的微小差异 微小差异积累微小差异积累较大差异较大差异吸附能力弱的组分先吸附能力弱的组分先 流出；吸附能力强的组分后流出流出；吸附能力强的组分后流出 back 续前 色谱分离原理色谱分离原理 色谱分离基于各组分在两相之间平衡分配的差异色谱分离基于各组分在两相之间平衡分配的差异 平衡分配可以用分配系数和分配比来衡量平衡分配可以用分配系数和分配比来衡量 色谱分离特点色谱分离特点 1不同组分通过色谱柱时的
17、迁移速度不等不同组分通过色谱柱时的迁移速度不等 提供了分离的可能性提供了分离的可能性 2各组分沿柱子扩散分布各组分沿柱子扩散分布峰宽峰宽 不利于不同组分分离不利于不同组分分离 二、色谱法基本术语二、色谱法基本术语 色谱流出曲线和色谱峰色谱流出曲线和色谱峰 流出曲线流出曲线(chromatogram)：电信号强度随时间变化曲线：电信号强度随时间变化曲线 基线基线（baseline）： 无样品时的电信号无样品时的电信号，反映仪器噪音的情况反映仪器噪音的情况 色谱峰色谱峰（peak）：流出曲线上突起部分：流出曲线上突起部分 （二）保留值：色谱定性参数（二）保留值：色谱定性参数 1.保留时间保留时间（
18、 retention time, tR )：从进样开始到组分出从进样开始到组分出 现浓度极大点时所需时间现浓度极大点时所需时间，即组分通过色谱柱所需要的即组分通过色谱柱所需要的 时间时间 2.死时间死时间（dead time, t0）：不被固定相溶解或吸附的组不被固定相溶解或吸附的组 分的保留时间分的保留时间。即即，分配系数为零的组分分配系数为零的组分。 3.调整保留时间调整保留时间（adjusted retention time, tR）：组分的组分的 保留时间与死时间之差值保留时间与死时间之差值，即组分在固定相中滞留的时间即组分在固定相中滞留的时间 0 ttt RR 图片 4.保留体积保留
19、体积（retentionretention volume,volume, V VR R）：从进样开始到组从进样开始到组 分出现浓度极大点时所消耗的流动相的体积分出现浓度极大点时所消耗的流动相的体积 5.5.死体积死体积 (dead volume, V(dead volume, V0 0) ) ：由进样器至检测器的流路由进样器至检测器的流路 中未被固定相占有的空间。中未被固定相占有的空间。 cRR FtV C RcR F tFV 1 无关；无关；为定值，与为定值，与注：注： C FtV 00 C c F tFV 1 00 无关；无关；为定值，与为定值，与注：注： 6.调整保留体积调整保留体积VR
20、：保留体积与死体积之差保留体积与死体积之差，即组分停即组分停 留在固定相时所消耗流动相的体积留在固定相时所消耗流动相的体积 7.选择性系数选择性系数(separation factor , ) ：调整保留值之比调整保留值之比 CRRR FtVVV 0 c RcR F tFV 1 无关；无关；与与注：注： 1 2 1 2 1 2 12 k k V V t t r R R R R ， 1 2 1 2 12 k k K K r ， lglg lglg 100 )( )( )( )( zRnzR zRxR x tt tt nzI 8.保留指数保留指数Ix(自学自学) 指将待测物的保留行为换算成相当于正
21、构烷指将待测物的保留行为换算成相当于正构烷 烃的保留行为烃的保留行为( (已知范围内组分的定性参数已知范围内组分的定性参数) ) I Ix x: : 待测组分的保留指数，待测组分的保留指数，z z与与z+nz+n为一对正构烷烃为一对正构烷烃 的含的含C C数，一般数，一般n n为为1 1。t tR(X) R(X) 应介于 应介于t t R(Z) R(Z)和 和 t t R(Z+n) R(Z+n) 之间之间 （三）色谱峰高和峰面积（三）色谱峰高和峰面积 2.峰面积峰面积A (Area)：指色谱曲线与基线间包围指色谱曲线与基线间包围 的面积的面积 1 1. .峰高峰高h (height)：指组分在
22、柱后出现浓度极指组分在柱后出现浓度极 大时的检测信号大时的检测信号，即色谱峰顶至基线的距离即色谱峰顶至基线的距离 （四）色谱峰区域宽度：色谱柱效参数（四）色谱峰区域宽度：色谱柱效参数 3.峰宽峰宽W (peak width)：正态分布色谱曲线两拐点切线与正态分布色谱曲线两拐点切线与 基线相交的截距基线相交的截距 1.标准差标准差( standard deviation)：正态分布色谱曲线两正态分布色谱曲线两 拐点距离的一半拐点距离的一半. . 对应对应0.607h0.607h处峰宽的一半处峰宽的一半 注：注：小，峰小，峰窄，柱效窄，柱效高高 2.2.半峰宽半峰宽(peak width at h
23、alf high)W W1/2 1/2： ：峰高一半处所对峰高一半处所对 应的峰宽应的峰宽 355. 2 21 W 4W 21 699. 1WW 注：除了用于衡量柱效注：除了用于衡量柱效，还可以计算峰面积还可以计算峰面积 图示 对称因子对称因子(symmetry factor) 正常峰正常峰（对称对称） 非正常峰非正常峰 前沿峰前沿峰 拖尾峰拖尾峰 色谱峰色谱峰 ABAAWf hs 2)(2 05. 0 fs=0.951.05 fs1.05 ( (五五) ) 色谱峰的对称性色谱峰的对称性(symmetry of peak)(symmetry of peak) （六）分离度（六）分离度R (R
24、(resolution分辨率分辨率) ) 相邻两组分峰顶间距离是峰底宽平均值的几倍相邻两组分峰顶间距离是峰底宽平均值的几倍,衡量色衡量色 谱分离条件优劣的参数谱分离条件优劣的参数 2 21 12 WW tt R RR 峰宽和之半峰宽和之半 ）保留值之差（峰顶间距保留值之差（峰顶间距 21 12 )(2 WW tt R RR 完全未分开完全未分开 完全分离完全分离 基本分离基本分离 0 . 1 65 . 1 40 . 1 R tR tR R R 三、分配系数与色谱分离三、分配系数与色谱分离 分配系数和容量因子：相平衡参数分配系数和容量因子：相平衡参数 1.分配系数分配系数partition co
25、efficient (K平衡常数平衡常数)：指在一定指在一定 温度和压力下温度和压力下，组分在色谱柱中达分配平衡后组分在色谱柱中达分配平衡后，在固定在固定 相与流动相中的浓度比相与流动相中的浓度比（色谱过程的相平衡参数色谱过程的相平衡参数） m S C C K 注：注：K为热力学常数为热力学常数 与组分性质与组分性质、固定相性质固定相性质、流动相性质及温度有关流动相性质及温度有关 实验条件固定实验条件固定，K K仅与组分性质有关仅与组分性质有关 组分在流动相中的浓度 组分在固定相中的浓度 K 2.2.容量因子容量因子capacity factor (k(k容量比，分配比容量比，分配比) )：
26、指在一定温度和压力下，组分在色谱柱中达分配指在一定温度和压力下，组分在色谱柱中达分配 平衡时，在固定相与流动相中的质量比平衡时，在固定相与流动相中的质量比 mm ss m s VC VC m m k m s mm ss V V K VC VC k 3.分配系数与容量因子的关系分配系数与容量因子的关系 （二）分配系数和容量因子与保留时间的关系（二）分配系数和容量因子与保留时间的关系 保留比保留比R：衡量溶质分子在色谱柱上相对移行速度衡量溶质分子在色谱柱上相对移行速度 R R t t tL tL R 0 0 定距洗脱保留比定距洗脱保留比 ) 1(R R= 组分在色谱柱中迁移速度组分在色谱柱中迁移速
27、度 流动相的线速度流动相的线速度 v u = 续前 设设R为单位时间内一个分子在为单位时间内一个分子在流动相流动相中出现的几中出现的几 率率 m S mm SS V V K VC VC R R 1 m S V V K R 1 1 设设1R为单位时间内一个分子在为单位时间内一个分子在固定相固定相中出现中出现 的几率的几率 R t t R 0 m S R V V K t t 1 0 1 R 续前 讨论：讨论： 色谱条件一定时，色谱条件一定时，tR主要取决主要取决K的大小的大小 （色谱法基本的定性参数（色谱法基本的定性参数 ） )1( 0 m S R V V Ktt 色谱过程方程色谱过程方程 R t
28、K K，tR ，组分后出柱组分后出柱 K=0，组分不保留组分不保留 K ，组分完全保留组分完全保留 （三）色谱分离前提（三）色谱分离前提 结论：结论：各组分各组分分配系数分配系数K K或或容量因子容量因子k k不等是分离的前提。不等是分离的前提。 选择合适分离条件使得难分离的组分选择合适分离条件使得难分离的组分K K不等而分离不等而分离. .组分组分 一定时，改变一定时，改变流动相流动相、固定相固定相和和温度温度，可改变，可改变K K。 )1( 0 m s B B R V V Ktt )1( 0 m s A A R V V Ktt )( 0BA m sB R A RR KK V V tttt 0 RBA tKK 本章小结本章小结 1.了解色谱法的发展历史,掌握色谱法的分类 2.掌握色谱的基本概念,并学会灵活运用 3.掌握色谱过程的分配系数和容量因子 4.掌握以下公式: )1 ( 0 m S R V V Ktt m S C C K m s mm ss V V K VC VC k 21 12 )(2 WW tt R RR ABAAWf hs 2)(2 05. 0 21 699. 1WW 0 ttt RR 思考题及习题思考题及习题 1、思考题P244 110，关于色谱理论部分的 内容，气相色谱学完后再完成。 2、习题P244 1、2、3、5、6 。
