1、核酸分子杂交：来源相同或不同的DNA甚至DNA与RNA分子变性后，在合适的条件下通过碱基互补形成双链杂交体的过程称核酸分子杂交(molecular hybridization)。核酸分子杂交技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之一，也是临床分子检验的重要技术。核酸探针的标记探针(probe)是指用放射性核素或其它标记物标记的核酸片段。标记物放射性标记非放射性标记生物素标记地高辛标记荧光素标记探针的种类 DNA探针：双链或单链DNA探针是最常用的核酸探针。长度在几百碱基对以上。DNA探针又分为：基因组DNA探针：有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针，多为某一基因的全
2、部或部分序列，或某一非编码序列。cDNA探针：以mRNA为模板经过逆转录酶催化产生的互补于mRNA的DNA链。探针的种类 DNA探针优点：1、一般克隆在质粒载体中，可以无限繁殖；2、DNA探针不易降解 3、DNA的标记方法比较成熟。探针的种类 RNA探针：可以是标记分离的RNA，也可以是重组质粒在RNA聚合酶作用下的转录产物。其优点是：RNA探针为单链，复杂性低，与靶序列杂交反应效率极高 因不存在重复序列，因此特异性高 本底低 缺点：探针的种类 寡核苷酸(oligo)探针：由1750mer组成的短探针。优点：可根据需要人工合成相应的序列；因片段短，只有一个核苷酸突变，其Tm值也有明显变化，特别
3、适用于点突变的检测 杂交速度快特异性强 缺点：所带标记物少灵敏度低；片段短杂交体不稳定探针的标记 切口平移法 标记原理：是目前实验室是最常用的一种脱氧核糖核酸探针标记法。利用大肠杆菌DNA聚合酶1的多种酶促活性将标记的dNTP掺入新合成DNA链中使探针被标记。带缺口(nick)的线状、超螺旋及环状双链DNA均可作为切口平移法的模板。DNase IDNA Pol I,-32P-dNTP标记步骤 1、取1gDNA溶于少量无菌蒸馏水中 2、加入l10 x切口平移缓冲液，混匀 10 x切口平移缓冲液 0.5mol/L Tris.Cl(pH7.2)0.1mol/L MgSO4 1mmol/L 二硫苏糖醇
4、(DTT)500g/ml 牛血清白蛋白标记步骤 3、加入除标记核苷酸外的其他三种脱氧核糖核苷酸溶液(也可以是多种标记核苷酸)，20mmol/L溶液各1l。以下操作要在同位素工作室中有防护措施的情况下进行操作 4、加入100Ci(10l)标记的核苷酸溶液。注：应贮存在20oC冰箱中，使用前在室温下放置1530分钟融化。要尽量减少冻融次数。标记步骤 5、加入无菌蒸馏水，至终体积为46.5l，混匀 6、加入0.5l稀释的DNase I溶液，混匀 7、加入1l(5U)DNA聚合酶I溶液，混匀 注：以上操作均在冰浴中进行 8、置1416oC水浴中保温12小时 9、加入2l 0.5mol/L EDTA终止
5、反应 10、纯化标记的DNA探针单链DNA探针的标记探针的标记 随机引物法 标记原理：随机引物是含有各种可能排列的寡聚核苷酸片段的混合物，可以与任何核酸序列杂交，起到聚合酶促反应的引物作用。将待标记的探针模板与随机引物一起退火，合成标记探针。标记步骤 1、冰浴中，在一微量离心管内顺序加入下列溶液，并混匀 20mmol/L DTT 1l 5mmol/L dATP、dGTP、dTTP 1l 10 x随机引物缓冲液 1l 标记dCTP 3l 水 1l标记步骤 2、取200ng双链DNA溶于1l蒸馏水中，在蜡膜上与1l随机引物充分混匀，吸入一毛细玻璃管中，用火封严两端。置沸水浴中30分钟并迅速置冰水浴
6、中1分钟。将DNA转入上述离心管中 3、加入1l(5U)DNA聚合酶Klenow片段，混匀并离心，室温反应3小时以上标记步骤 4、取10l终止缓冲液，置20oC保存备用 终止缓冲液 50mmol/L Tris.Cl(pH7.5)50mmol/L NaCl 5mmol/L EDTA 0.5%SDS随机引物标记法特点 1、除能进行双链DNA标记外，也可用于单链DNA或RNA探针的标记。当用RNA为模板是，操作方法同上，但必须采用反转录酶。2、标记活性高，只需25ng样品DNA，可在3小时内使4060以上甚至90的标记dNTP掺入到探针DNA链上 3、操作方便3末端标记末端标记属于部分标记。特点是可
7、得到全长DNA片段，但标记活性不高。3末端标记法包括限制酶切和聚合酶合成两个过程，3标记有两种方式：大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末端标记法T4DNA聚合酶标记法大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末端标记法：标记反应步骤：(1)在反应管中依次加入下列试剂并混匀 DNA 1g 10 xKlenow片段缓冲液 2l 2mmol/L3种dNTP(无dATP)1l -32PdATP 30Ci 加水至 25l 10 xKlenow片段缓冲液 2l 0.5mol/L Tris.Cl(pH7.2)0.1mmol/L MgSO4 1mmol/L DTT(二硫苏糖醇)500g 牛血清白蛋白(2)
8、加入1单位Klenow聚合酶片段，室温反应30min。(3)加入12l0.5mol/LEDTA以终止反应。酚/氯仿抽提1次。(4)Sephadex G50柱层析或乙醇沉淀法分离标记的DNA片段。大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末端标记法：注意事项：(1)要根据不同限制酶产生的不同粘性末端选择不同的标记核苷酸。(2)选择适当的限制酶及-32P-dNTP,利用DNA聚合酶I Klenow片段的末端填充活性，可以选择性地将DNA双链之中一条链特异地标记。(3)此方法不能直接用于3凸出末端DNA的标记。CCTAGGAATTCAATTCCCTAGG EcoR I BamH I加入DNA聚合酶，d
9、NTP(其中一种为标记核苷酸)AATTCCCTAGGT4DNA聚合酶标记法T4DNA聚合酶具有两种功能，53聚合活性 和35外切活性。当反应体系中缺乏dNTP时，T4DNA聚合酶主要表现为外切酶活性。利用这一特性可产生5凸出的DNA片段，然后加入dNTP，其中之一为标记核苷酸，在T4DNA聚合酶活性的作用下，合成出标记探针。T4DNA聚合酶，无dNTP加入dNTP,其中一种为标记核苷酸标记反应步骤：(1)在反应管中加入下列试剂并混匀 DNA 0.20.5g 1xT4DNA聚合酶缓冲液 2l 加水至 20l(2)加入所需的限制酶，并在适当条件下温育(3)加入适量T4DNA聚合酶。(4)当切除了所
10、需数量的核苷酸后，加入 1l2mmol/L四种核苷酸(其中一种为标记核苷酸)，37oC保温一小时。(5)Sephadex G50柱层析或乙醇沉淀法分离标记的DNA片段。5末端标记标记原理：在T4多核苷酸激酶的催化下，可使 ATP分子上的磷酸基团转移到DNA或RNA分子的5OH基团上。因此采用-32P-ATP为底物，即可将DNA样品5端标记。但核酸样品5端必需是去磷酸的。PP磷酸酶T4多核苷酸激酶ATPPP标记反应步骤：(1)碱性磷酸酶的预处理：碱性磷酸酶(CIP)硫酸铵悬液4oC下在Eppendorf离心管中离心1分钟。弃上清，沉淀重溶于少量水中。4oC下此溶液可保存一个月以上。(2)将DNA
11、样品溶解于少量10mmol/L tris.Cl(pH8.0)溶液中，然后加入：10 xCIP缓冲液 5l CIP缓冲液 适量 加水至 48l置37oC30分钟。加入第二份CIP，继续保温30分钟，即可脱去5端磷酸基团。0.01U的CIP，可脱去1pmol5磷酸基团(1.6g4kb线性DNA的5端数相当于1pmol)。10 xCIP缓冲液 Tris.Cl(pH9.0)10mmol/L MgCl2 1mmol/L ZnCl2 10mmol/L 亚精胺(3)加入40l H2O，10l 10 xSTE，5l 10SDS。加热至68oC，15分钟。10 xSTE 100mmol/L Tris.Cl(pH
12、8.0)1mol/L NaCl 10mmol/L EDTA酚/氯仿及氯仿各抽提两次除CIP，SephadexG50层析脱盐后乙醇沉淀。取脱盐后的脱5磷酸DNA150pmol溶于少量水中，然后加入下列试剂进行5末端标记：加水至50ul，混匀，37oC保温1小时。加入2ul0.5mol/LEDTAz终止反应，酚/氯仿抽提后乙沉淀。SephadexG50层析分离后得5标记的DNA探针。-32P-ATP 50pmol(150uCi)T4多核苷酸激酶 1020U10 x激酶缓冲液 10ul注意事项：(1)T4多核苷酸激酶对多种杂质非常敏感，要求必需达到一定的纯度；脱磷酸后要用SephadexG50层析除
13、去小分子及离子。(2)亚精胺即可促进-32P-ATP的掺入，又能抑制核酸酶的活性。(3)脱磷酸的DNA样品最好经电泳纯化以除去其中存在的低分子质量的核酸，否则会竞争性抑制目标DNA的标记。探针的线纯化凝胶过滤柱层析法利用凝胶的分子筛效应，将标记的DNA与小分子彼此分开。因标记的探针量很小，一般用离心柱层析法。乙醇沉淀法核酸分子杂交的种类和方法核酸分子杂交的基本原理：DNA分子由两条互补的单链形成的双螺旋结构。维持结构稳定的力有三：1、两条链间互补碱基的氢键；2、碱基间的堆积力(范德华力)；3、中和链内的负电荷。变性：在理化因素作用下，双螺旋结构间的氢键断裂，两条链解开形成单链的过程。变性温度(
14、Tm)：核酸分子热变性时，从开始变性到变性结束，是在一个很窄的温度范围内进行的，当变性进行到核酸分子解链一半时的温度，称变性温度，也称融解温度。影响变性的因素：1、碱基组成 DNA分子中GC含量越高Tm越高。在1SSC溶液中，两者之间的关系可以用经验公式表示：Tm(G+C)%0.41+69.3其中，69.3为无GC存在时的Tm值。(G+C)%每增加1，Tm约上升0.41oC。影响变性的因素：2、溶液的离子强度 DNA链骨架上的磷酸基团带有较多的负电荷，它们之间的静电相斥作用是其双链的不稳定因素之一。在无盐的水中，DNA在室温下就会变性，加入盐后，正离子可以封闭磷酸基团的负电荷，使DNA稳定性增
15、加，Tm值升高。影响变性的因素：3、pH值 pH值在59范围内，Tm值变化不明显。在高pH值下，可使碱基失去形成氢键的能力。当pH大于11.3时所有氢键均被破坏，DNA完全变性。4、变性剂 可以干扰碱基堆积力和氢键的形成，因此可以降低Tm值。常用的变性剂是甲酰胺和脲，通常用50的甲酰胺以使Tm值降低30 oC。复性：变性核酸分子在合适的条件下重新形成双螺旋结构的过程称复性。热变性的DNA溶液在低于Tm值25 oC的温度下维持相当长的一段时间，则可使之恢复到天然的双链结构状态。复性的速度受以下因素影响：1、DNA浓度 DNA浓度越大复性速度越快；2、DNA的分子质量 大分子质量的DNA扩散速度慢
16、，复性速度慢；3、温度 温度过高，有利于DNA变性而不利于复性；4、离子强度 5、DNA分子的复杂性 DNA总量一定时，基因组越复杂，其中特定顺序的拷贝数越少，互补顺序的浓度越低，复性反应速度越慢。分子杂交技术就是利用了核酸分子的变性与复性原理，使变性的核酸分子与检测核酸分子在碱基互补的条件下形成杂交双螺旋的过程。探针(probe)：在核酸变性实验中，为使杂交体与单链核酸分子区分开来所使用的带有标记的单链核酸分子。核酸分子杂交分类：以杂交分子分类：DNA与DNA杂交；DNA与RNA杂交；RNA与RNA杂交。以探针标记分类：以杂交介质分类：液相杂交与固相杂交。固相杂交：菌落杂交、Southern
17、印迹杂交、Northern印迹杂交、原位杂交及基因芯片等技术。液相杂交(solution hybridization)：是一种比较原始的分子杂交技术。待测分子与探针在杂交液中完成反应，利用层析方法将杂交分子与末杂交分子分开后用液闪仪进行计数或利用紫外吸收特性变化分析杂交结果的分子杂交类型。液相杂交又分为：RNA酶保护分析法、核酸酶S1保护分析法。RNA酶保护分析法(RPA)：利用RNase A和RNase T1能专一性降解单链RNA而双链RNA受到保护的特点，用体外转录合成的放射性标记的RNA探针与待检mRNA 进行液相杂交，使互补序列RNA探针和待测RNA形成杂交体，用RNase降解非杂交部
18、分RNA后分析杂交结果。RNA酶保护分析法的应用：mRNA定量mRNA未端定位内含子在相应基因中的位置RNA酶保护分析法的主要步骤：1、制备待测RNA 从细胞或组织中提取总RNA或mRNA；2、RNA探针标记 采用体外转录的方法制备和标记探针；3、分子杂交：将待测样品RNA和RNA探针在液相中杂交，杂交前将样品和探针变性，破坏二级结构；4、RNA酶消化单链RNA；5、电泳分析杂交分子。核酸酶S1保护分析法(nuclease S1 protection assay)：原理与RNA酶保护分析法的原理类似，核酸酶S1能专一性地降解单链DNA和RNA，而不能降解DNA/RNA杂交双链。采用M13体系克
19、隆和扩增特定基因的单链DNA片段，在合成过程中加入核素标记物，即可合成出高放射性的单链DNA探针。将探针与待测RNA样品在液相中进行杂交，形成DNA/RNA杂交双链。酶解后进行分析。核酸酶S1保护分析法可用于基因转录起始位点分析及内含子剪切位点分析。液相杂交的优点：设备简单、操作方便。液相杂交的缺点：过量未杂交探针难以除去，产生高背景；同源与异源核酸均可形成双螺旋结构使得杂交结果难以分析。固相杂交：将欲分析的样品先结合在固相支持物上，再与探针进行杂交反应。杂交结果可用仪器或放射自显影技术分析杂交结果。固相支持物的选择：可用于固相支持物的种类很多。一种良好的固相支持物应具备以下几个特性：1、具有
20、较强的结合核酸分子的能力；2、与核酸分子结合后不影响与探针的结合；3、与核酸分子的结合稳定牢固；4、非特异性吸附少；5、具有良好的机械性能便于操作。硝酸纤维素滤膜优点：具有较强的吸附单链DNA或RNA的能力，特别是在高盐浓度下，其结合能力可达80100 g/cm2。吸附的单链核经真空烘烤后，依靠疏水性相互作用而结合在硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜具有杂交信号本底低的特点广泛用于各种杂交实验。缺点：与单链核酸的结合能力不十分牢固，尤其是小于200bp的DNA片段，洗膜时(特别是在高温下)DNA会出现脱膜现象，硝酸纤维素膜质地较脆使操作不便。尼龙膜：是目前较理想的一种核酸固相支持物，它有多种类型，不
21、同类型的膜上网孔大小不同。经正电荷基团修饰后与核酸的结合力更强。尼龙膜与核酸的结合能力为350500 g/cm2。经烘烤或紫外线照射后，特别是紫外线照射，核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上带正电荷的基团相互交联，使结合更加牢固。Southern印迹杂交：Southern 印迹杂交过程1、DNA样品的酶切和电泳2、电泳胶的处理3、DNA的转移4、DNA的固定5、DNA膜的杂交杂交过程1、预杂交：为了减少非特异性杂交反应，在杂交前应进行预杂交，将非特异性DNA位点封闭。常用的封闭物有两类：其一是变性的非特异性DNA，大多采用鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA；其二是一些高分子化合物，其作用有二：封闭DNA上
22、的非特异位点；封闭膜上与非特异性DNA结合位点。预杂交液的配制6SSC（1SSC为0.15mol/L NaCl和 o.o15mol/L柠檬酸）5Denhardts溶液0.5SDS100g/ml变性的鲑鱼精子DNA50甲酰胺(可不用)50Denhardt：聚蔗糖(Ficoll 400)5g聚乙烯吡咯烷酮 5g牛血清白蛋白(组分V)5g加水至500ml，分装后保存于20oC10mg/ml鲑鱼精DNA：超声法或用注射器通过6号针头反复抽打将DNA打断。煮沸后置20oC保存，使用前置沸水浴中煮沸5分钟后速置冰浴中。甲酰胺：使用前用Dowex XG8混合床阴阳离子交换树脂处理1小时，小量分装后置70oC
23、保存。膜的处理：将结合了DNA(或RNA)的硝酸纤维素膜或尼龙膜浸泡于6SSC溶液中2分钟，使其充分湿润。预杂交：将湿润的滤膜放入一塑料袋中，按每平方厘米膜0.2ml量加入预杂交液，尽量排除其中的气泡后用封口机封口。温育：将杂交袋浸入适当温度的恒温水浴中(不加甲酰胺时用68oC；加入50甲酰胺时，恒温42oC)，温育12小时，也可延长至1216小时。保温过程中应不断摇动塑料袋，以赶走盖在滤膜表面的气泡，否则这些气泡将阻碍杂交液与滤膜的接触。(如果将预杂交液加热到适当温度后再加入塑料袋内，可以减少气泡产生)。2、杂交：杂交反应是单链核酸探针与待测核酸分子中的特异基因序列在一定的温度下杂交复性的过
24、程。杂交包括以下过程：1、杂交液配制：同预杂交液2、探针变性：放射性标记的探针为双链时，于100oC加热5分钟变性并迅速在冰水浴中将探针骤冷。单链探针无须变性3、打开预杂交袋弃去预杂交液，加入杂交液及变性的探针。排除气泡后重新封好口4、在与预杂交相同温度下，保温816小时洗膜：是将滤膜上未与DNA杂交的及非特异性杂交的探针分子从滤膜上洗去的过程，非特异性杂交体稳定性较低，解链温度较低，在一定温度下，非特异性杂交体解链而被洗掉，而特异性杂交体则保留在滤膜上。杂交体的解链温度主要取决于杂交体的同源性和溶液的离子强度两个要素，同源性越高离子强度越高，杂交体的稳定性越高。洗膜的操作如下：1、杂交完毕，
25、取出杂交袋，剪去一角，弃去所有的杂交液，取出膜并迅速浸泡于大量2SSC和0.5%SDS溶液中，室温下不断振荡。注意不要使滤膜干燥。2、5分钟后，将滤膜转移至一盛有大量2SSC和0.1%SDS溶液的容器中，室温振荡15分钟。3、将滤膜转移至一盛有大量0.1SSC和0.1%SDS溶液的容器中，37oC振荡漂洗30分钟至1小时。4、将滤膜转移至一盛有大量0.1SSC和0.1%SDS溶液的容器中，65oC振荡漂洗30分钟至1小时。直到用盖革计数器在无DNA区域检测不出放射信号为止。5、室温下，滤膜用0.1SSC稍稍漂洗。然后置滤纸上吸去溶液，置70oC放射自显影。杂交液组成：50甲酰胺5xSSC1xF
26、PG25mmol/L磷酸缓冲液25g/ml变性鲑鱼精DNA5硫酸葡聚糖0.2SDS50 xFPG1聚蔗糖 4001聚乙烯吡咯烷酮1甘氨酸过滤后分装，于20oC存放。菌落杂交：主要用于克隆筛选的固相杂交。影响杂交速率和杂化分子稳定性的因素1、核酸分子浓度与杂交速率：在探针和固定的核酸浓度都很低的情况下，杂交初始速度由探针和核酸浓度决定。当探针是单链而不存在自身互补的区域，杂交的速率随探针浓度的升高而升高。在杂交中可通过提高探针的扩散速率而提高杂交速率，如使小片段探针、减小反应体积提高反应温度和不断振摇等措施。2、高浓度双链探针的杂交：限制性内切酶标记的探针，在杂交过程中可能发生两种反应：(1)与
27、固定在膜上的靶序列杂交；(2)双链探针的自身退火。双链探针的自身退火可使探针有2030探针不能与靶序列发生杂交，因此尽量使用单链探针。3、碱基组成：GC的含量越高，杂交的速率越高，但对速率的影响不明显，可忽略不计。但GC含量越高杂交核酸的稳定性越高。4、盐溶液的浓度：对杂交速率的影响：对杂交稳定性的影响：5、温度6、甲醛7、错配的核酸序列：杂交后检测杂交信号的检测放射自显影直接放射自显影：在暗室中将含放射性杂化分子的滤膜与X线胶片紧密的贴在一起，放入不透光的盒子。同位素哀减所释放的射线使胶片感光显影、定影后产生可见的图像。间接放射自显影：在滤膜与X胶片外加两层增感屏，使感光强度增加以提高检测效率。间接放射自显影示意图真核细胞中的核酸原位杂交
