1、植物组织培养培养基及操作技术优选植物组织培养培养基及操作技术ppt第一节第一节 培养基的培养基的成分成分和和种种类类一、培养基的成分1 1、无机营养元素、无机营养元素(inorganic element)(inorganic element)1)1)大量元素：指浓度大于大量元素：指浓度大于0.5mmol0.5mmolL L的元素。的元素。NN、P P、K K、MgMg、S S和和CaCa等等。2)2)微量元素：指小于微量元素：指小于0.5mmol0.5mmolL L的元素。的元素。FeFe，B B，MnMn，CuCu，MoMo，ClCl等等。在细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动。在细
2、胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动。种类：种类：VBl(盐酸硫胺素盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇)、Vpp(烟酸烟酸)、Vc（抗坏血酸）、（抗坏血酸）、VH(生物素生物素)、VB11(叶酸叶酸)、VB12（钴胺素（钴胺素)等。等。使用浓度：使用浓度：一般用量为一般用量为0.11.0mgL。又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。使用浓度：一般为使用浓度：一般为lOOmglOOmgL L，作用：适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状作用：适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作
3、用，体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。对细胞壁的形成也有作用。培养基及其配制培养基及其配制 作用：是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。作用：是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。种类：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，种类：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。使用浓度：为使用浓度：为1010200mg200mgL L。培养基及其配制培养基及其配制5、有机附加物（天然复合物）培养基及其配制培养基及其配制6 6、植物生长调节物质、植物生长调节物质(hormone)
4、(hormone)培养基及其配制培养基及其配制 *作用：作用：主要被用于诱导愈伤组织形成；促进主要被用于诱导愈伤组织形成；促进细胞脱分化；促进细胞伸长；促进生根。细胞脱分化；促进细胞伸长；促进生根。在促进生长方面，根对生长素最敏感。在在促进生长方面，根对生长素最敏感。在极低的浓度下，极低的浓度下，(10(10-5-51010-8-8mgmgL)L)就可促进生就可促进生长，其次是茎和芽。长，其次是茎和芽。培养基及其配制培养基及其配制吲哚乙酸：吲哚乙酸：IAA（indo acetic acid）萘乙酸：萘乙酸：NAA（naphthalene acetic acid）吲哚丁酸：吲哚丁酸：IBA（in
5、dolebutyric acid）2,4-二氯苯氧乙酸：二氯苯氧乙酸：2,4D (2,4-dichlorophenoxybutyric acid)培养基及其配制培养基及其配制生长素作用强弱顺序：生长素作用强弱顺序：IAA(吲哚乙酸吲哚乙酸)NAA(萘乙酸萘乙酸)IBA(吲哚丁酸吲哚丁酸)2,4D(2,4二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸)强强弱弱培养基及其配制培养基及其配制湿热灭菌法即将玻璃器皿包扎后置入蒸汽灭菌锅中进行高温高压灭菌，灭菌时间可延长达25min30min。特点：是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素。1-1N的NaOH和0.其中最主要的是光照、温度、湿度、氧气和培养基的pH值等。促
6、进细胞分裂与扩大。第一节 培养基的成分和种类所谓母液是欲配制液的浓缩液。2植物生长调节物质湿热灭菌(常压或高压蒸煮)在初代培养时，培养基中无机盐浓度过高，酚类物质将会大量外溢，导致外植体褐变。45m以下，可阻止细菌细胞和真菌的孢子通过。试管苗的生理状况是影响移栽成活率的内在因素。干热灭菌法即将玻璃器皿置入电热烘箱中进行灭菌。1、常用灭菌药剂的使用和效果组织培养中培育出来的苗通常称试管苗或组培苗。1、多数植物要求pH5.一年中要定期一、二次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。组织培养中的光强与太阳光相比一般很弱，故幼苗一般生长也较弱，经受不了太阳光的直接照射。1-1N的NaOH和0.浓度为：1-5mgml。操
7、作过程中引起的污染，主要由空气中的杂菌和工作人员本身引起的。种类：种类：6BA(6苄基腺嘌呤苄基腺嘌呤)Kt(kinetin 激动素激动素)Zt(zeatin 玉米素玉米素)培养基及其配制培养基及其配制细胞分裂素作用强弱顺序细胞分裂素作用强弱顺序Kt(激动素激动素)6BA(6苄基腺嘌呤苄基腺嘌呤)Zt(玉米素玉米素)强强弱弱培养基及其配制培养基及其配制GAGA3 3（赤霉酸）：（赤霉酸）：作用：促进幼芽伸长生长，促进不定胚发育成小作用：促进幼芽伸长生长，促进不定胚发育成小植株。植株。赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响：当有影响：当生长素赤霉素比值
8、高生长素赤霉素比值高时有利于木质时有利于木质部分化，部分化，比值低比值低时有利于韧皮部分化。时有利于韧皮部分化。培养基及其配制培养基及其配制7、培养材料的支持物-琼脂(agar)固体培养时最好的固体培养时最好的固化剂固化剂。用量：用量：6 610g10gL L。琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至养。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40 40 即凝固为固体状即凝固为固体状凝胶。凝胶。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还与琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方
9、式有关外，还与高压灭菌时高压灭菌时的温度、时间、的温度、时间、pHpH值值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力。时间过久，琼过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力。时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。培养基及其配制培养基及其配制固体培养基的特点（与液体培养基相比）:优点优点:操作简便，通气问题易解决，便于观察研究。操作简便，通气问题易解决，便于观察研究。缺点缺点:培养物与培养基的接触培养物与培养基的接触(即吸收即吸收)面积小，各种面积小，各种养分在琼脂中扩散
10、较慢，影响养分充分利用，同时养分在琼脂中扩散较慢，影响养分充分利用，同时培养物排出的代谢废物，聚集在吸收表面，对组织培养物排出的代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。产生毒害作用。固体培养固体培养液体培养液体培养培养基及其配制培养基及其配制8、抗生物质(antibiotic)种类：卡那霉素、头孢霉素、青霉素、链霉素、庆种类：卡那霉素、头孢霉素、青霉素、链霉素、庆大霉素等。大霉素等。浓度：浓度：520mg/L。作用：可作用：可防止菌类污染防止菌类污染。培养基及其配制培养基及其配制9 9、活性炭、活性炭(active carbon)(active carbon)目的：是目的：是利用其吸附能
11、力，减少一些有毒物质利用其吸附能力，减少一些有毒物质的影响的影响；利于生根。；利于生根。使用浓度：使用浓度：15gL。它的颗粒大小决定着吸附能力：粒度越小，吸它的颗粒大小决定着吸附能力：粒度越小，吸附能力越大；温度低吸附力强，温度高吸附力附能力越大；温度低吸附力强，温度高吸附力减弱，甚至不吸附。减弱，甚至不吸附。培养基及其配制培养基及其配制作用：作用：是植物原生质体的组成成分，也是一切是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。代谢过程的介质和溶媒。注意：注意：用蒸馏水，最好是重蒸馏水；以保持培用蒸馏水，最好是重蒸馏水；以保持培养基成分的精确性。大规模生产时可用自来养基成分的精确性
12、。大规模生产时可用自来水。水。培养基及其配制培养基及其配制二、培养基的二、培养基的PHPH值值 (pH value)(pH value)1、多数植物要求、多数植物要求pH5.6-5.82、用、用0.1-1N的的NaOH和和0.1-1N的的HCI调节调节.3、注意：、注意：p经高压灭菌后，培养基经高压灭菌后，培养基pHpH会下降会下降0.2-0.8,0.2-0.8,故故调整调整pHpH值时值时,应高于应高于0.50.5；ppHpH的大小会影响琼脂的凝固能力，当的大小会影响琼脂的凝固能力，当pH6.0pH6.0时，培养基将会变硬，时，培养基将会变硬，pH 5.0pH 5.0时，琼脂凝固时，琼脂凝固
13、不好。不好。培养基及其配制培养基及其配制种类种类最适最适pH值值种类种类最适最适pH值值杜鹃杜鹃4.0月季月季5.8越桔越桔4.5胡萝卜、石刁胡萝卜、石刁柏柏6.0蚕豆蚕豆5.5桃桃7.0番茄番茄5.7培养基及其配制培养基及其配制不同植物对培养基最适不同植物对培养基最适pH值的要求不同值的要求不同(见表见表)培养基培养基(culture medium)：是植物组织培养的重要基是植物组织培养的重要基质。在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不质。在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相
14、同。因此，没有一种培养基能够适合一切类型求也不相同。因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功。必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功。三、培养基的种类、配方及特点三、培养基的种类、配方及特点培养基及其配制培养基及其配制1、根据态相不同：固体培养基、液体培养基、根据态相不同：固体培养基、液体培养基2、根据培养物培养过程：初代培养基、继代培养基、根据培养物培养过程：初代培养基、继代培养基3、根据作用不同：诱导培养基、增殖培养基、根据作用不同：诱导培养基、增殖培养基、
15、生根培养基生根培养基4、根据营养水平：基本培养基、完全培养基、根据营养水平：基本培养基、完全培养基、改良培养基。改良培养基。培养基及其配制培养基及其配制F 若只含有大量元素与微量元素和碳水化合物若只含有大量元素与微量元素和碳水化合物的培养基，称为基本培养基。的培养基，称为基本培养基。F 在基本培养基的基础上，添加各种各样的生在基本培养基的基础上，添加各种各样的生长调节物质和其他有机附加物的培养基叫完全长调节物质和其他有机附加物的培养基叫完全培养基。培养基。初代培养基：初代培养基：指用来第一次接种外植体的培养基。指用来第一次接种外植体的培养基。继代培养基：继代培养基：指用来接种初代培养之后培养物
16、的培养基指用来接种初代培养之后培养物的培养基。培养基及其配制培养基及其配制1 1、MSMS培养基：它是培养基：它是19621962年由年由MurashigeMurashige和和SkoogSkoog为培养为培养烟草细胞而设计的。是目前应用最广泛的培养基。烟草细胞而设计的。是目前应用最广泛的培养基。特点：是无机盐离子浓度较高，有高含量的特点：是无机盐离子浓度较高，有高含量的N N、K K，硝，硝酸盐量大，营养丰富。酸盐量大，营养丰富。培养基及其配制培养基及其配制在灭菌剂里滴入数滴0.1%的Tween20（吐温）Chever报道，欧洲栗在3月15日-30日醌类物质形成少，而在5月-6月醌类物质明显
17、提高。诱导芽分化，促进侧芽萌发，使茎增粗，抑制茎伸长。但是，不同的植物有其适宜的生长素种类。45m以下，可阻止细菌细胞和真菌的孢子通过。第5，用无菌水冲洗5次。抽枝 以这种新抽的嫩枝条作为外植体常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.促进细胞分裂与扩大。第四，将材料封闭在无菌的培养皿中过夜，保持一定温度；四、影响试管苗移栽成活率的因素1、外植体的接种 2、培养条件05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。使用浓度：一般为lOOmgL，无论是离体培养繁殖种苗，或者是进行生物技术研究，选取性状优良的种质，或特殊的基因型。B5培养基的组成和配方灭菌锅有很多种，实验
18、室中常用手提式高压蒸汽灭菌锅，使用时要注意一下几点：Zt(zeatin 玉米素)对于移栽后成活比较困难的植物，第一次移栽时最好选用灭菌过的基质，以提高其移栽成活率。成分名称成分名称药品药品名称名称原配方量原配方量(mg)/L大量元素大量元素NH4NO31650KNO31900CaCl22H2O440MgSO47H2O370KH2PO4170微量元素微量元素MnSO4H2O22.3ZnSO47H2O8.6CoCl26H2O0.025CuSO45H2O0.02H3BO36.2Na2MoO42H2O0.25KI0.83铁盐铁盐FeSO47H2O28.7Na2-EDTA37.3有机物有机物烟酸烟酸(V
19、pp)0.5盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇0.5盐酸硫胺素盐酸硫胺素0.1肌醇肌醇100甘氨酸甘氨酸22 2、WhiteWhite培养基：培养基：19431943年由年由WhiteWhite为培养番茄根为培养番茄根尖而设计的。尖而设计的。特点：无机盐浓度较低，适于生根培养。特点：无机盐浓度较低，适于生根培养。培养基及其配制培养基及其配制(4)B(4)B5 5培养基培养基:是是19681968年由年由GalmborgGalmborg等为培养大豆等为培养大豆根细胞而设计的。根细胞而设计的。特点：是含有较低的铵盐，较高的硝酸盐和盐酸特点：是含有较低的铵盐，较高的硝酸盐和盐酸硫胺素。硫胺素。(5)KM(5)KM
20、8P8P培养基培养基:它是它是19741974年为原生质体培年为原生质体培养而设计的。养而设计的。特点：是有机成分较复杂，它包括了所有的特点：是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素。单糖和维生素。培养基及其配制培养基及其配制2 2、WhiteWhite培养基培养基 19431943年由年由WhiteWhite为培养番茄根尖而设计为培养番茄根尖而设计 19631963年作了改良，提高年作了改良，提高MgSOMgSO4 4的浓度和增加硼元素的浓度和增加硼元素 无机盐浓度较低无机盐浓度较低 使用广泛使用广泛 在生根培养、胚胎培养中有良好的效果在生根培养、胚胎培养中有良好的效果大量元素大量元素含
21、量含量(mg/L）微量元素微量元素含量含量铁盐铁盐含量含量有机物有机物含量含量(mg/L其他其他含量含量KNO380H3BO31.5Fe2(SO4)32.5肌醇肌醇100蔗糖蔗糖30000Ca(NO3)2 4H2O300MnSO4 4H2O7.0烟酸烟酸0.3琼脂琼脂8000MgSO4 7H2O720ZnSO4 7H2O3.0盐酸硫胺素盐酸硫胺素0.1NaH2PO4 4H2O16.5MoO30.0001盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇0.1KCl65CuSO4 5H2O0.001甘氨酸甘氨酸3Na2SO42003 3、B5B5培养基培养基 19681968年由年由GamborgGamborg等为培养大豆根
22、细胞而设计等为培养大豆根细胞而设计 含有较低的铵盐含有较低的铵盐 较高的硝酸盐和盐酸硫胺素较高的硝酸盐和盐酸硫胺素组成成分组成成分数量数量(mg/l）组成成分组成成分数量数量(mg/l)KNO32500FeSO47H2O27.8CaCl22H2O150CuSO45H2O0.025MgSO47H2O250蔗糖蔗糖40(NH4)2SO4134pH5.5KI0.75肌醇肌醇100H3BO43.0烟酸烟酸1.0MnSO44H2O10盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇1.0ZnSO47H2O2.0激动素激动素0.1Na2MoO42H2O0.252,4D0.11.0CoCl26H2O0.025盐酸硫铵素盐酸硫铵素10N
23、a2-EDTA37.3B5培养基的组成和配方4 4、N6N6培养基培养基 19741974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养设计年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养设计 KH2PO4和（和（NH4NH4）SO4SO4含量高，不含钼含量高，不含钼组成成分组成成分数量数量(mg/l)组成成分组成成分(mg/l)KNO32.3Na2EDTA37.3CaCl22H2O166FeSO47H2O27.8MgSO47H2O185蔗糖蔗糖50KH2PO4400pH5.8(NH4)2SO4463烟酸烟酸0.5KI0.8盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇0.5H3BO31.6甘氨酸甘氨酸2.0MnSO44H2O4.4盐酸硫铵
24、盐酸硫铵1.0ZnSO47H2O1.5N6培养基组成及配方第二节第二节 培养基的培养基的配制配制 一、一、培养基的配培养基的配制制 （一）、母液（一）、母液(stock solution)的配制和保存的配制和保存 所谓母液是欲配制液的所谓母液是欲配制液的浓缩液浓缩液。意义意义:保证各物质成分的准确性保证各物质成分的准确性 配制时的快速移取配制时的快速移取 便于低温保藏。便于低温保藏。一般母液配成比所需浓度高一般母液配成比所需浓度高10-10010-100倍。倍。母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等。盐、有机物和激素类等。培养基
25、及其配制培养基及其配制单配法：单配法：将培养基配方中的各种成分分别配成一定将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液。一般用浓度的母液。一般用mg/ml mg/ml 或或mg/Lmg/L表示。表示。混配法：混配法：将几类营养成分按配方中的用量扩大一定将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量，分别溶解后再混合成母液。倍数称量，分别溶解后再混合成母液。配制生长素类：配制生长素类：可先用少量可先用少量0.1N0.1N的的NaOHNaOH或或95%95%酒酒精助溶。浓度为：精助溶。浓度为：1-5mg1-5mgmlml。配制细胞分裂素类：配制细胞分裂素类：一般先用少量一般先用少量0.5-1N0.
26、5-1N盐酸加热盐酸加热溶解。浓度为：溶解。浓度为：1-5mg1-5mgmlml。培养基及其配制培养基及其配制母液的配制方法：母液的配制方法：一些生长调节剂(赤霉素、玉米素)、某些维生素是不耐热的，常用过滤灭菌-细菌过滤器方法。生长调节物质控制器官分化的模式3适当降低细胞分裂素和赤霉素的浓度配制时的快速移取一般母液配成比所需浓度高10-100倍。植物材料不同，褐变的程度有所不同。嫁接移栽法移栽棉花试管苗的效果植物生长需要一定的矿物质营养，但是，如果营养离子之间失去平衡，试管苗生长就会受到影响。干热灭菌法即将玻璃器皿置入电热烘箱中进行灭菌。促进细胞分裂与扩大。1适当控制培养基中无机营养成分完全排
27、除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。2温度 离体培养中对温度的调控要比光照显得更为突出。这是因为自然光中的紫外线能促进试管苗成熟，加快木质化。质发生聚合，进一步引起其他酶系统失活，从而导做好适当遮阴工作，避免太阳光直射造成试管苗迅速失水而死亡。一般用mg/ml 或mg/L表示。150-200mlLZnSO47H2O四、污染原因和预防措施工作人员在接种时，最好不要感冒咳嗽和说话。培培养养基基母母液液的的配配制制 母液名称母液名称药品药品名称名称原配方量原配方量(mg)/L扩大倍数扩大倍数 称取量称取量(mg)母液体积母液体积(ml)移取量移取量(ml)/L大量元素母液大量元素母液NH4
28、NO3165010165001000100KNO319001019000CaCl22H2O440104400MgSO47H2O370103700KH2PO4170101700微量元素母液微量元素母液MnSO4H2O22.31002230100010ZnSO47H2O8.6100860CoCl26H2O0.0251002.5CuSO45H2O0.0210025H3BO36.2100620Na2MoO42H2O0.2510025KI0.8310083铁盐母液铁盐母液FeSO47H2O28.71002870100010Na2-EDTA37.31003730有机物母液有机物母液烟酸烟酸(Vpp)0.5
29、502550010盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇0.55025盐酸硫胺素盐酸硫胺素0.1505肌醇肌醇100505000甘氨酸甘氨酸250100培养基及其配制培养基及其配制配制方法：配制方法：1 1）、将母液按顺序摆放）、将母液按顺序摆放2 2）、取适量的蒸馏水）、取适量的蒸馏水(所需培养基量的所需培养基量的2/3)2/3)入容器入容器3 3）、按需要量依次取母液及生长调节物质）、按需要量依次取母液及生长调节物质4 4）、加入蔗糖）、加入蔗糖(30g/L)(30g/L)溶解溶解5 5）、加琼脂）、加琼脂(6-10g/L)(6-10g/L)，煮沸，煮沸，2-3min2-3min5 5）、定容）、定容6)6
30、)、调、调PHPH值值(pH=5.8)(pH=5.8)7)7)、分装培养瓶，封口、分装培养瓶，封口8)8)、高压灭菌、高压灭菌培养基及其配制培养基及其配制第三节第三节 组培技术（组培技术（灭菌、接种、培养、移栽驯化灭菌、接种、培养、移栽驯化）消毒消毒:是指杀死、消除或充分抑制部分微生物，是指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用。使之不再发生危害作用。灭菌灭菌:是指用物理或化学的方法，杀死物是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的体表面和孔隙内的一切微生物或生物体一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。即把所有生命的物质全部杀死。培养基及其配制培养基及其配制一、培养
31、基的灭菌一、培养基的灭菌常用的灭菌方法常用的灭菌方法物理方法物理方法化学方法化学方法干热灭菌干热灭菌(烘烧和灼烧烘烧和灼烧)湿热灭菌湿热灭菌(常压或高压蒸煮常压或高压蒸煮)射线处理射线处理(紫外线、超声波、微波紫外线、超声波、微波)过滤除菌过滤除菌大量无菌水冲洗大量无菌水冲洗升汞升汞(氯化汞氯化汞)甲醛甲醛(福尔马林福尔马林)过氧化氢过氧化氢高锰酸钾高锰酸钾来苏儿来苏儿漂白粉漂白粉次氯酸钠次氯酸钠酒精酒精培养基及其配制培养基及其配制培养基的灭菌湿热灭菌法培养基的灭菌湿热灭菌法 培养基在制备后的培养基在制备后的24h内完成灭菌。内完成灭菌。高压灭菌的原理：高压灭菌的原理：在密闭的蒸锅内，其中的蒸
32、气不能外溢，压力不断上在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在108kPa108kPa的压力的压力下，锅内下，锅内温度达温度达121121。在此蒸气温度下，可以。在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。培养基及其配制培养基及其配制将锅内空气完全排除后，关闭将锅内空气完全排除后，关闭放气阀。放气阀。当压力表上升达当压力表上升达108kPa108kPa时，锅内温度达时，锅内温度达121121（在此蒸气温度下，可以很快（在此蒸气温度下，可以很快
33、杀死各种细菌及其高度耐热的杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢），维持芽孢），维持15-30min15-30min。培养基及其配制培养基及其配制灭菌方法：灭菌方法：灭菌锅有很多种，实验室中常用手提式高压蒸灭菌锅有很多种，实验室中常用手提式高压蒸汽灭菌锅，使用时要注意一下几点：汽灭菌锅，使用时要注意一下几点：1、锅中应放足量的水，以免造成空烧或干烧；、锅中应放足量的水，以免造成空烧或干烧；2、装锅时不要过度倾斜，可保持内部有一定的空、装锅时不要过度倾斜，可保持内部有一定的空 间，利于蒸汽流动；间，利于蒸汽流动；3、增压前高压锅内的空气必须排净，否则易影响、增压前高压锅内的空气必须排净，否则易影响 灭菌
34、效果；灭菌效果；体内含水量高，但干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低的现象。平吉成从山定子刚长成的实生苗上切取茎尖进行培养，接种后褐变很轻，随着苗龄增长，褐变逐渐加重，取自成龄树上的茎尖褐变就更严重。如脱毒培养的茎尖很小，操作时间长了就会使茎尖失水变干，或不慎感染杂菌。吸附在土壤粒子和细胞壁微纤维上的水，可分为（1）基于土壤粒子表面强有力的吸附力，主要是23层的水分子；6%次氯酸钠灭菌30min，然后用蒸馏水洗3-5次。1N的NaOH或95%酒精助溶。培养基的灭菌湿热灭菌法整个接种过程均须无菌操作：湿热灭菌(常压或高压蒸煮)无论是离体培养繁殖种苗，或者是进行生物技术研究，选取性状优良的
35、种质，或特殊的基因型。火焰灭菌法：即把金属器械放在95%的酒精中浸一下，然后放在火焰上燃烧灭菌。1MPa时,开始计时，维持压力0.试管苗的移栽往往和驯化同步。（3）植物生长调节物质湿热灭菌法即将玻璃器皿包扎后置入蒸汽灭菌锅中进行高温高压灭菌，灭菌时间可延长达25min30min。培养无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异。VB12（钴胺素)等。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。2采用适宜的培养基和光温条件 培养基的无机盐成分、蔗糖浓度、激素水平、温度适宜及在黑暗条件下培养，或在取外植体之前对母株进行遮光处理20d40d，可以显著减轻材料的褐变。接种后的外植体应送到培养
36、室去培养。胚状体形成过程-单细胞参与4、灭菌过程中，应尽量保持压力恒定，严格遵、灭菌过程中，应尽量保持压力恒定，严格遵守灭菌时间；守灭菌时间；5、排气降压时应缓慢进行；、排气降压时应缓慢进行；6、只有待高压锅内压力表指针恢复到零后，才、只有待高压锅内压力表指针恢复到零后，才能开启压力锅；能开启压力锅；7、高压锅工作时，应有专人看守。、高压锅工作时，应有专人看守。高压灭菌的原理 在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在增加。在0.1MPa的压力下，锅内温
37、度达的压力下，锅内温度达121。在。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。热的芽孢。注意事项注意事项 完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表时，打开放气阀，放出空气，待压力
38、表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到表上升达到0.1MPa时时,开始计时，维持压力开始计时，维持压力0.10.15MPa 20分钟。分钟。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热存在，每湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在克水在100时，由
39、时，由气态变为液态时可放出气态变为液态时可放出226kJ（千焦）的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌（千焦）的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。物体的温度，从而增加灭菌效力。在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。如果压力未降到如果压力未降到0时，打开排
40、气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，需逐渐减压。污染，需逐渐减压。过滤灭(除)菌（不耐热的物质）一些生长调节剂一些生长调节剂(赤霉素、玉米素赤霉素、玉米素)、某些维生素是不耐热的，常用某些维生素是不耐热的，常用过滤过滤灭菌灭菌-细菌过滤器细菌过滤器方法。方法。防细菌滤膜网孔的直径为防细菌滤膜网孔的直径为0.45m0.45m以以下，可阻止细菌细胞和真菌的孢子下，可阻止细菌细胞和真菌的孢子通过。通过。
41、培养基及其配制培养基及其配制空间及物体表面灭菌空间及物体表面灭菌培养基及其配制培养基及其配制l熏蒸剂熏蒸剂:甲醛甲醛和和高锰酸钾，高锰酸钾，1 1周后通风周后通风1 1天天。(1)紫外线灭菌紫外线灭菌(2)熏蒸灭菌熏蒸灭菌l10-2010-20分钟分钟 灭菌后的培养基经冷却和凝固后即可使用，检验灭菌效果。灭菌后的培养基经冷却和凝固后即可使用，检验灭菌效果。检验方法：检验方法：将培养基置于培养室中将培养基置于培养室中3 3天，若没有污染现象，说明灭菌可天，若没有污染现象，说明灭菌可靠，可以使用。靠，可以使用。保存在低温条件下。常温下保存时要进行防尘和避光处理。保存在低温条件下。常温下保存时要进行
42、防尘和避光处理。保存时间不可过长。保存时间不可过长。培养基的保存培养基的保存二、外植体的选择和灭菌二、外植体的选择和灭菌 1、外植体的选择外植体的选择 2、外植体的灭菌方法外植体的灭菌方法 3、污染原因和预防措施污染原因和预防措施 1 1、外植体的选择、外植体的选择 植物组织培养的主要过程大致包括：培养基的制备、外植体植物组织培养的主要过程大致包括：培养基的制备、外植体的选择、器具的消毒、无菌操作和环境条件的调控。的选择、器具的消毒、无菌操作和环境条件的调控。1 1）、选择优良的种质）、选择优良的种质 无论是离体培养繁殖种苗，或者是进行生物技术研究，选取无论是离体培养繁殖种苗，或者是进行生物技
43、术研究，选取性状优良的种质，或特殊的基因型。对材料的选择要有明确的目性状优良的种质，或特殊的基因型。对材料的选择要有明确的目的，具有一定的代表性，提高成功机率，增加其实用价值。的，具有一定的代表性，提高成功机率，增加其实用价值。2 2）、选择健壮的植株）、选择健壮的植株 组织培养用的材料，最好从生长健壮的无病虫的植株上，选取组织培养用的材料，最好从生长健壮的无病虫的植株上，选取发育正常的器官或组织。因为这些器官或组织代谢旺盛，再生能力强，发育正常的器官或组织。因为这些器官或组织代谢旺盛，再生能力强，比较容易培养成功。比较容易培养成功。3 3）、选择最适的时期）、选择最适的时期 组织培养选择材料
44、时，要注意植物的生长季节、植物的生长发组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节、植物的生长发育阶段。如快速繁殖时应在植株生长的最适时期取材，这样不仅成活率育阶段。如快速繁殖时应在植株生长的最适时期取材，这样不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高高，而且生长速度快，增殖率高。4 4）、选取适宜的大小）、选取适宜的大小 培养无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异。材料太培养无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异。材料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈伤组织，甚至难于成活大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈伤组织，甚至难于成活。一般选取培养材料的大小，在。一般选取培养材料的大小，在0
45、.5cm-1.0cm0.5cm-1.0cm。如果是胚胎培养或。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。脱毒培养的材料，则应更小。2采用适宜的培养基和光温条件 培养基的无机盐成分、蔗糖浓度、激素水平、温度适宜及在黑暗条件下培养，或在取外植体之前对母株进行遮光处理20d40d，可以显著减轻材料的褐变。在倒挂金钟茎尖培养中只加入0.45m以下，可阻止细菌细胞和真菌的孢子通过。灭菌时进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好由于培养基中琼脂的用量和pH值的高低不同，培养基可配成固体培养基、半固体培养基或液体培养基。MnSO44H2O培养瓶等器皿的口径过大。对材料的选择要有明确的目的，具有一定的代表性，提高成
46、功机率，增加其实用价值。在灭菌剂里滴入数滴0.一般在接种后12天即可发现。保存在低温条件下。影响试管苗移栽成活率的因素有许多种，包括内因与外因。时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。光照时间不宜太长，大多数植物以10h 14h为宜；灭菌锅有很多种，实验室中常用手提式高压蒸汽灭菌锅，使用时要注意一下几点：改良培养基。作用：可防止菌类污染。开始几天最好用烧杯罩住移栽苗，使其周围的相对湿度保持在85%以上。灭菌锅有很多种，实验室中常用手提式高压蒸汽灭菌锅，使用时要注意一下几点：或Tween80湿润剂，则灭菌效果更好。在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组
47、织对营养的要求也不相同。三、外植体的灭菌方法三、外植体的灭菌方法1、常用灭菌药剂的使用和效果、常用灭菌药剂的使用和效果2、外植体的灭菌方法、外植体的灭菌方法1、常用灭菌药剂的使用和效果、常用灭菌药剂的使用和效果灭菌剂灭菌剂使用浓度（使用浓度（%）清除的难易清除的难易消毒时间消毒时间效效 果果次氯酸钙次氯酸钙910910易易530530很好很好次氯酸钠次氯酸钠2 2易易530530很好很好漂漂 白白 粉粉饱和浓度饱和浓度易易530530很好很好氯氯 化化 汞汞0.110.11较难较难210210最好最好酒酒 精精70757075易易0.220.22好好过氧化氢过氧化氢10121012最易最易51
48、5515好好溴溴 水水1212易易210210很好很好硝硝 酸酸 银银1 1较难较难530530好好抗抗 菌菌 素素450mg/L450mg/L中中30603060较好较好2、外植体的灭菌方法、外植体的灭菌方法 外植体在接种前先要灭菌，在灭菌前，又先要进行预处外植体在接种前先要灭菌，在灭菌前，又先要进行预处理。植物材料一般采取的预处理方法是：理。植物材料一般采取的预处理方法是：先对植物组织进行先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中修整，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。经过预处理的植物材料，其表面仍有很多细菌和冲洗干净。经过预处理的植物材料，
49、其表面仍有很多细菌和真菌，因此还需进一步灭菌。真菌，因此还需进一步灭菌。常规的表面灭菌处理方法常规的表面灭菌处理方法把材料放进把材料放进70%的酒精中约的酒精中约30s。用用0.1%的升汞（的升汞（HgCl2）浸泡）浸泡510min。或用或用10%的的次氯酸钠溶液次氯酸钠溶液浸浸泡泡10 15min。无菌蒸馏水冲洗无菌蒸馏水冲洗35次。次。灭菌时进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好灭菌时进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好 的接触。的接触。在灭菌剂里滴入数滴在灭菌剂里滴入数滴0.1%的的Tween20（吐温）（吐温）或或Tween80湿润剂，则灭菌效果更好。湿润剂，则灭菌效果更好。这种循环就是培养
50、瓶内的水分循环，其循环的结果造成培养瓶内空气的相对湿度接近于100，远远大于培养瓶外的空气湿度，所以试管苗的蒸腾量极小。4氧气 植物组织培养中，外植体的呼吸需要氧气。第3，在1：500Roccal B（一种商品灭菌剂名）稀释液中浸5min；第2，将材料放入70%酒精中灭菌数秒钟；三、培养基的种类、配方及特点幼龄材料褐变较轻与其酚类化合物含量少有关。第四节、玻璃化现象及其预防措施枝条先进行预培养。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。热击处理，可防止玻璃化的发生。在灭菌剂里滴入数滴0.试验结果表明，降低无机盐的浓度对植物生根效果较好，有利于移栽成功。浓度为：1-5mgml。01
