1、在逆转EGFR-TKIs获得性耐药中的作用研究表皮生长因子受体（表皮生长因子受体（EGFREGFR）是目前最为主要肺癌分子）是目前最为主要肺癌分子靶向治疗的靶点。靶向治疗的靶点。EGFR-TKIsEGFR-TKIs的耐药分原发性和获得性两类；的耐药分原发性和获得性两类；获得性耐药的获得性耐药的40-40-6 60 0主要是由于主要是由于EGFREGFR基因的二次突变基因的二次突变 (T790M)(T790M)和和c-Metc-Met基因的扩增所引起；基因的扩增所引起；此外，旁路信号通路的激活，激酶的转换（此外，旁路信号通路的激活，激酶的转换（Kinase Kinase SwitchSwitch
2、）机理：如）机理：如ERkERk，IGFIGF1R1R，PDGFRPDGFR等高表达；等高表达；本研究将主要集中在这本研究将主要集中在这40-50%40-50%无无EGFREGFR的二次突变（如的二次突变（如T790MT790M）和）和c-Metc-Met基因的扩增相关的获得性耐药机制上。基因的扩增相关的获得性耐药机制上。研究材料研究材料EGFR野生型细胞株：野生型细胞株：A549，H460等，对等，对TKI为原发性为原发性耐药；耐药；EGFR敏感突变细胞株：敏感突变细胞株：PC-9，HCC827等，对等，对TKI高度高度敏感；敏感；从从EGFR敏感突变细胞株建立的获得性耐药细胞株：敏感突变细
3、胞株建立的获得性耐药细胞株：PC-9/AB2，PC-9/AB11和和PC-9/BB4等（本实验用）等（本实验用）EGFR基因二次突变监测和分析（PCR+测序)细胞培养、筛选稳定细胞培养、筛选稳定的耐药株的耐药株全基因组基因芯片分析microRNA芯片分析蛋白组学分析（2D+质谱）EGFR突变基因的逆转实验EGFR基因突变与吉非替尼治疗患者临床疗效分析阳性基因和蛋白的验证、鉴定（Real-Time PCR、Western blot）评价靶基因在吉非替尼获得性耐药中的作用，探讨耐药机理，寻找新的治疗靶点并指导临床治疗阳性靶基因的表达情况与吉非替尼治疗患者临床特征分析（Real-Time PCR、免
4、疫组化）靶基因的逆转实验应用基因转染和siRNA干扰技术，对已确定的在敏感株和耐药细胞株之间的差异的阳性靶基因进行干预。细胞周期（FACS）增殖（MTT）凋亡(FACS、TUNEL)不同细胞株间生物学不同细胞株间生物学特性的研究特性的研究一、一、PC-9及其子系耐药株及其子系耐药株药物敏感度差异的研究药物敏感度差异的研究Cells inhibition ratios with IressaTypan Blue staining CountingMTT AssayCell linesIC50（mol/L）RIPC-90.00670.00341PC-9/AB21.560.28523342PC-9/
5、AB112.780.09941514PC-9/BB41.750.08226112P0.000.00IC50 for PC9 and its derived cell lines by MTT assay二、不同细胞株中二、不同细胞株中EGFR基因突变和基因扩增检测和分析基因突变和基因扩增检测和分析Sequencing result for the mutation of EGFR exons 18-21 in PC9 cellsExon18 Exon19 Exon20Exon21PC9Wild type15bp deletionWild typeWild typePC9/AB2Wild typ
6、e15bp deletionWild typeWild typePC9/AB11Wild type15bp deletionCAACAGWild typePC9/BB4Wild type15bp deletionWild typeWild typePC-9 PC-9/G PC9-AB2 PC9-BB4 PC9-AB11不同耐药细胞株中不存在不同耐药细胞株中不存在EGFR的二次突变和的二次突变和c-Met基因扩增基因扩增不同耐药细胞株中不同耐药细胞株中MET基因蛋白的表达无明显差异基因蛋白的表达无明显差异54675 probe sets on the Human genome U133 plus
7、 2 microarrayPC-9 vs PC-9/AB2PC-9 vs PC-9/BB4PC-9 vs PC-9/AB11Signal ratioSignal ratioSignal ratio2249 up-regulated genes725 down-regulated genes1364 up-regulated genes1807 down-regulated genes1469 up-regulated genes2289 down-regulated genes509 common probe setsGATHER gene ontology analysiscell migr
8、ation:7 genes(p0.0005)cell adhesion:25 genes(p0.0005)G-protein coupled receptor protein signaling pathway:8 genes（p=0.0007)High-level gene ontologyKEGG pathway analysisECM-receptor interaction：8 genes(p0.0005)Adherens junction：7 genes(p0.005)值得关注的两点差异变化：值得关注的两点差异变化：在其中的在其中的100余个变化的基因都包含有转录因子余个变化的基因都
9、包含有转录因子E2F1的假的假定的结合位点，提示在耐药发生的过程中可能存在定的结合位点，提示在耐药发生的过程中可能存在E2F1基因相关信号通路如基因相关信号通路如Rb-E2F1的变化；的变化；血小板衍生的生长因子受体血小板衍生的生长因子受体(PDGFR)成员在成员在PC-9子系耐子系耐药细胞株中的表达明显增高；药细胞株中的表达明显增高；pathwaysgenesP valueCell migrationFN1,HMGCR,IL8,JAG1,LAMA4,NRP2,VEGFC0.00127cell adhesionCD44 CDH2 COL4A6 COL6A1 COL6A2 COL8A1 ChGn
10、 FLRT2 FN1 IL8 ITGA2 ITGBL1 LAMA4 LAMC2 MLLT4 MSLN MUC4 NEDD9 NID2 NRP2 PROS1 SPOCK TNF TSPAN2 VCL0.00152G-protein coupled receptor protein signaling pathwayGNAL GPR GPR109B GPR110 GPR51 GPRC5B IL8 OXTR0.00737cholesterol biosynthesisFDFT1 FDPS HMGCR HMGCS10.008Cell motilityATP1A1 FN1 HMGCR IL8 JAG1
11、LAMA4 NRP2 SPOCK TM4SF6 TSPAN2 VEGFC0.008Cellular processABAT ABCC2 ACAA2 ADRBK2 ADSSL1 AGPAT4 AKR1C1 AKR1C2 ALDH3A1 ANK3 AQP3 ARL7 ARNTL2 ATP1A1 ATP2A3 B3GALT3 BF BHLHB3 BIRC3 C21orf66CCDC5 CD44 CDH2 CEACAM6 CHM CHURC1 COL4A6 COL6A1 COL6A2 COL8A1 CPM CPZ CRIP1 CTH CTSL2 CTSO CYB5 CYB561 ChGn DIAPH2
12、 DIO2 DNAH5 DPP4 DUSP13 E2F1 EHF EHMT1 EMP2 EPHA4 EXT1 EYA4 FBLN1 FBXO32 FDFT1 FDPS FGF18 FLRT2 FMO5 FN1 FNBP1 GALC GCNT2 GDA GGTL3 GLRB GLUL GNAL GPC4 GPR GPR109B GPR110 GPR51 GPRC5B GPX2 HECTD1 HMGA2 HMGCR HMGCS1 HOXC13 HSD3B1 ICK IFI16 IGFBP1 IGFBP5 IL8 ING5 INSIG1 IRX3 ITGA2 ITGBL1KYNU LAMA4 LAM
13、C2 LATS2 LEF1 LEPR LHX2 LOC115294 LRP3 LTB MAGI-3 MAN1A1 MAP3K1 MAP3K8 MAPK1 MAPT MCC MEIS1 MET METTL4 MGA MGC47816 MLLT4 MORF4L2 MSLN MUC4 NCOA7 NEDD4 NEDD9 NID2 NPEPL1 NPTX1 NRP2 OGT OXTR PAPOLA PEX6 PIP5K1B PLCB4 PLOD2 PROS1 PRSS11 PTHLH PTPRM RAC1 RARRES1 RBM25 RBM5 RECQL5 REST RFK RFX5 RREB1RRS
14、1 RTN2 SALL2 SATB1 SCD SFRP1 SLC12A8 SLC1A1 SLC1A4 SLC1A6 SLC22A1 SLC2A3 SLC2A4RG SLC4A7 SLC7A7 SLC8A1 SMARCD3 SNAG1 SOD2 SOX9 SPOCK SRM STMN3 STXBP6 SYBL1 TIMP3 TM4SF6 TMEM23 TNF TNFAIP3 TNFAIP9 TNFRSF11A TNFRSF9 TNFSF15 TNIK TNS TOP3A TPCN1 TRIB2TSPAN2 TUBB6 UBE2D1 UBE2J1 UBTF USP36 VAPB VCL VEGFC
15、0.01ECM-receptor interactionCD44 COL4A6 COL6A1 COL6A2 FN1 ITGA2 LAMA4 LAMC20.004Adherens junctionLEF1 MAPK1 MET MLLT4 PTPRM RAC1 VCL0.007四、四、Rb-E2F1Rb-E2F1相关的信号通路相关的信号通路在在EGFR-TKIsEGFR-TKIs耐药中的作用研究耐药中的作用研究E2F1 siRNA干扰干扰PC-9细胞后再用不同浓细胞后再用不同浓度的吉非替尼处理度的吉非替尼处理24h后细胞的增殖和凋亡后细胞的增殖和凋亡变化情况。变化情况。(A)细胞增殖分析细胞增殖分
16、析(MTT Assay)；（B）细胞凋亡检测。）细胞凋亡检测。E2F1沉默后明显增沉默后明显增加了加了PC9细胞对易瑞沙的耐药性。细胞对易瑞沙的耐药性。E2F1，MET和和Rb基因在基因在PC-9及其及其子系耐药细胞株中蛋白表达情况子系耐药细胞株中蛋白表达情况 Gefitinib treatment reduced the S phase entry and DNA synthesis in all cell linesEGF induced Rb Phosphorylation at Ser780/ser795 in PC9 cells-actinpRB780CDK6CDK4CYCLIND1
17、pRB795 0 1h 8h 24h 36h 48hE2F1Gefitinib Downregulated EGF induced Rb Phosphorylation and Reduced E2F1,Cyclin D1,cdk4 and cdk6 in PC-9 cells-actinpRB780CDK6CDK4CYCLIND1pRB795 0 1h 8h 24h 36h 48hE2F1EGF引起引起Rb磷酸化，同时磷酸化，同时E2F1表达水平升高；吉非替尼表达水平升高；吉非替尼抑制抑制EGF引起的引起的Rb磷酸化和磷酸化和E2F1水平的升高水平的升高 推论与假设 Rb-E2F信号通路在信
18、号通路在PC-9及其子系耐药细胞株中参与吉非替尼获得性及其子系耐药细胞株中参与吉非替尼获得性耐药发生；即吉非替尼耐药的信号通路可能与耐药发生；即吉非替尼耐药的信号通路可能与Rb-E2F信号通路之间信号通路之间有相互交叉作用；有相互交叉作用；由于吉非替尼的持续作用，可能导致由于吉非替尼的持续作用，可能导致Rb基因的磷酸化降低，基因的磷酸化降低，E2F分子分子不能释放，使细胞不能顺利通过限速点不能释放，使细胞不能顺利通过限速点R,进入进入S期，期，DNA复制不能顺复制不能顺利进行，从而导致进入利进行，从而导致进入G0期细胞的增多而发生对吉非替尼的获得性期细胞的增多而发生对吉非替尼的获得性耐药；此时
19、，可能旁路信号通路被激活，从而又导致了耐药细胞的增耐药；此时，可能旁路信号通路被激活，从而又导致了耐药细胞的增殖。殖。细胞进入S期并增殖CDK4CDK6cyclinD+RB E2F1E2F1Gefitinib假设示意图假设示意图五、五、PD 0332991(a cyclin D kinase 4/6 inhibitor)在在EGFR-TKIsEGFR-TKIs耐药中耐药中的作用研究的作用研究PD不同肺癌细胞株的生物学特性的影响细胞活性细胞增殖不同肺癌细胞株中PD对细胞周期相关蛋白的影响不同肺癌细胞株中PD对细胞周期的影响高通量信息分析PD在肺癌动物模型中的作用PD在肺癌动物模型中的作用Anti
20、-Ki67PD在肺癌动物模型中的作用Anti-CD34六、六、PD-0332991 在临床在临床EGFREGFR-TKIs-TKIs耐药患者中的耐药患者中的 应用应用时间时间描述描述2013-10-16右肺上叶切除术，侵润性腺癌pT2N2M0 IIIA；EGFR 19外显子缺失2013-12至2014-02力比泰+铂类，4个周期2014-03放疗5000Gry2014-08-12出现肺部和骨的多发转移，服用易瑞沙+唑来磷酸2015-04-11又出现脑部的多发病灶，易瑞沙耐药2015-05-02PD+易瑞沙，三天后骨疼痛好转2015-05-26复查脑部MRI，病灶基本消失病人治疗经过Take Home Message Rb-E2F信号通路参与EGFR-TKIs获得性耐药的发生；针对此信号通路的抑制剂如PD与TKIs联合可能逆转耐药；周清华教授周清华教授 刘红雨教授 王玉丽 李颖 王珉 李永文 刘明辉 天津市肺癌研究所其他人员 天津医科大学总医院肺部肿瘤外科全体
