1、第十讲第十讲 分子免疫学技术分子免疫学技术内容摘要内容摘要1免疫学基本概况免疫学基本概况2 分子免疫的基本理论分子免疫的基本理论3 抗血清制备技术抗血清制备技术4免疫检测技术免疫检测技术5 酶联免疫吸附检测法酶联免疫吸附检测法6单克隆抗体技术单克隆抗体技术1免疫学基本概况免疫学基本概况1.1什么是免疫反应？什么是免疫反应？广义的说，凡是研究抗原物质在体内发生排异现象，刺激产生免疫答应产物的方法学称为免疫反应。刺激产生免疫反应的物质称之为抗原，产生免疫答应产物称之为抗体，产生免疫答应的过程称之为免疫周期。1.2免疫学的范畴免疫学的范畴在相当长的一段时期内，免疫学几乎是只是研究有关传染病预防问题，
2、但是随着人对疾病作斗争实践经验的积累，随着免疫化学和免疫生物学的深入研究，免疫学的研究越来越广泛，并与许多相关学科交织在一起，发展成了许多分支学科。目前划分的主要学科主要有：免疫生物学免疫生物学免疫遗传学免疫遗传学免疫细胞学免疫细胞学免疫生理学免疫生理学免疫药理学免疫药理学血液免疫学血液免疫学肿瘤免疫学肿瘤免疫学1.3肌体内的免疫系统肌体内的免疫系统在高等动物体内存在着具有免疫功能的组织主要有：淋巴组织(中枢淋巴组织的胸腺，外周淋巴组织的淋巴结，红骨髓，脾脏)免疫活性细胞（T淋巴细胞,B淋巴细胞）免疫活性介质（抗体，补体，淋巴因子）1.4外源抗原物质外源抗原物质组织、器官细菌、病毒红细胞蛋白质
3、、多糖抗生素类药物二价重金属离子1.5免疫动物免疫动物原则上说，行市对异体物质具有免疫反应的哺乳动物均可作为免疫动物，但是常用与免疫实验的动物主要有：马马羊羊兔兔鼠鼠2 分子免疫的基本理论分子免疫的基本理论2.1基本原理基本原理当抗原初次进入具有免疫答应能力的动物体内后，要经过一段较长的潜伏期才出现抗体，又经过一段高峰期后抗体量下降至消失。在这段时期内总抗体量较少，抗体的主要成分是IgM，这次机体对抗原产生的答应反应为“初次答应”。当抗原再次进入机体时，血液中抗体很快出现，含量明显高于初次答应反应，抗体的主要成分是IgG，这次机体对抗原产生的答应反应为“再次答应”。如此重复科获得较高的答应产物
4、。图1,动物机体的初次和再次免疫答应由于动物的遗传性不同，同一抗原对不同的的动物或同种不同品系的动物，甚至同一品系不同个体的动物，产生特异性免疫答应的强弱是不同的。对于动物个体的不同组织部位对抗原刺激的敏感性也是有差异的。淋巴结，脾脏，足掌，眼睫膜等是反映的敏感部位。近几十年来，在研究抗原抗体大分子的结构与功能关系方面取得了很大的进展。通过对合成抗原，人工抗原和天然抗原分子结构与免疫源性的研究，表明只有蛋白质，结合蛋白，和多糖类生物大分子诱导产生的免疫答应，在免疫学上称之为抗原。从抗原的化学结构上分析，决定产生免疫答应的不是抗原的整个分子二十分子上的一些特定的化学基团或结构，这些化学基团称为“
5、抗原决定族”。它们几十诱导机体产生抗体，有事抗原与抗体结合部位。因此，一个复杂的蛋白质大分子可以有多个抗原决定族，如：甲状腺球蛋白有个抗原决定族。具有多个抗原决定族的生物大分子可以诱导产生多种特性的不同类别的抗体。2.2抗体的分类抗体的分类抗血清是指含有某种特异抗体的动物血清，通过免疫学检测抗原与抗体反应具有高度的特异性，无需纯化可以进行直接检测。动物血清中的抗体有5类，即IgG，IgM，IgA，IgE和IgD。这些抗体中，IgG含量最高。3 抗血清制备技术抗血清制备技术3.1免疫动物的基本技术免疫动物的基本技术(1)抗原选择抗原选择以生物大分子作抗原，主要是蛋白类或多糖，如果要想得到多种混合
6、抗体可以用多种蛋白同时免疫动物，如用血清直接免疫动物。如果要想得到单一抗体可以用纯蛋白免疫动物，如用牛血清青蛋白免疫(2)佐剂的配制佐剂的配制a不完全福氏佐剂(Freundsadjuvant)：由羊毛脂和液体石蜡按一定比例混合而成，一般在夏季羊毛脂：液体石蜡=1：2，冬季羊毛脂：液体石蜡=1：3b完全福氏佐剂：由不完全福氏佐剂，抗原物质和卡介苗组成，混合的比例是不完全福氏佐剂：抗原物质：卡介苗=5：4：1c混合方式：取5份不完全福氏佐剂置于乳钵中，一边研磨一边滴加水溶性抗原和卡介苗，直到混合物完全乳化形成油包水的注射用佐剂。外观是乳白色的胶体。(3)动物的选择动物的选择根据不同实验目的和抗体的
7、用途，选择不同的免疫动物。如是用于大量制备抗体，可选用马或羊等大的哺乳动物，这些动物的免疫周期较长，通常要用3-6个月，如果是少量制备或科研分析可选用兔或鼠，这些动物的免疫周期较短，通常要用一个半月左右。选择年轻健康的动物。(4)注射部位和注射量注射部位和注射量a注射部位：注射部位：通常选择在免疫动物的活动部位为注射点，如足掌，肩胛骨，髋骨等。b注射方式：每次采用多点注射。对于大的哺乳动物将佐剂注射在皮下，小哺乳动物如鼠，可采用腹腔或肌肉注射,无需佐剂。C注射量：根据动物的不同，注射的量也有区别。以兔为实验动物，总注射量为2ml，0.5ml/注射点。静脉注射0.2ml,无需佐剂(5)采血技术采
8、血技术心脏采血耳沿静脉采血尾静脉采血眼窝采血颈动脉采血3.2抗体的纯化抗体的纯化(1)血清制备，血清的制备有两种方法。一种方法是将加入了抗凝剂的免疫动物血液，于2500rpm/min离心，除去血球获得到血浆或将未加抗凝剂的免疫动物血液，待血液凝聚后放置24小时，直接渗出血清。(2)盐析法粗提：在血清中加入饱和度为75%的硫酸铵盐析，放置24小时后，然后将沉淀物用生理盐水溶解，对蒸馏水透析，获得抗体粗提液。(3)离子交换分离：将抗体粗提液通过DEAE-Sepharose-4B阴离子交换柱层析分离，缓冲液：10mmol/LpH7.4磷酸缓冲液，洗脱液：0.5mol/LNaCl溶液，一般采用梯度洗脱
9、方式。(4)亲和层析法：将纯化好的抗原偶联到琼脂糖凝胶层介质(Sepharose4B)上，制成免疫亲合柱，利用抗原抗体的互补性进行分离。4免疫检测技术免疫检测技术4.1检测的基本原理检测的基本原理将可溶性抗原与相应的抗体混合，如果二者比例合适，并有电解质（如氯化钠）存在时，就会出现抗原-抗体沉淀反应。如果这免疫检测是在琼脂糖凝胶介质中进行，则可看到白色沉淀的抗原抗体复合物。根据沉淀线出现与否可以判断样品种抗原-抗体的存在根据稀释都梯度可以测定样品种抗原-抗体的效价。抗原-抗体的结合在沉淀反应中，呈现出一定的分子比例，不同抗原与相应的抗体之间的分子比例是不同的，只有在抗原-抗体比例合适时才能见到
10、沉淀线，所以抗原-抗体结合能否出现沉淀线，并不能完全反应抗原-抗体是否存在和发生结合。因为抗原可以结合多个抗体分子，所以称抗原是多价的；抗体只能结合两个抗原分子的抗原决定簇，故称抗体是二价的。因此，只有抗原抗体的结合价被饱和时，才能出现大量的抗原抗体复合物沉淀。ABC抗原、抗体的比例4/168/128/41/41/1.52/1当抗原为单价时（如某些有机小分子，多肽，小分子蛋白等）或抗体为单价，虽然抗原抗体能发生结合，但不会形成大分子复合物，不出现沉淀反应，所以单价的抗原或抗体不能用沉淀反应直接进行检测。4.2检测方法检测方法(1)双向免疫扩散双向免疫扩散双向扩散法(doublediffusio
11、n),又称琼脂扩散法。它是利用琼脂糖凝胶介质具有多孔的网状结构的特性，抗原抗体分子在琼脂糖凝胶介质中可以自由扩散。当具有一定间隔距离的抗原和相应的抗体，通过在琼脂糖凝胶介质中的扩散作用二者相遇，形成抗原抗体复合物，在比例合适时就会出现白色沉淀。由于琼脂糖凝胶是透明的，可以直接观察到抗原抗体复合物的沉淀线。沉淀线的特征和位置与抗原的相对分子量大小，分子结构，扩散系数和浓度等因素有关。当抗原抗体存在多种系统时，会出现多条沉淀线。根据沉淀线的形状，数量和相对位置可以定性抗原，诊断某些疾病。此法的优点是：操作简单，数据可靠。2.5cmm7.5cm(2)对流免疫电泳对流免疫电泳对流免疫电泳(counte
12、rimmunoelectrophoresis)是外加电场以限制抗原，抗体的扩散，提高抗原抗体的局部浓度，加快抗原抗体结合的速度。对流免疫电泳主要是利用血清抗原在pH8.6巴比妥缓冲液的离子琼脂糖凝胶中，带负电荷，在电场下向正极移动，而血清中的抗体在该溶液中处于电中性，在场下不移动，但受电渗的影响向负极渗动。由于抗原向正极移动，经过一段时间电泳，抗原就会与抗体相遇，在抗原抗体的比例合适的情况下会出现白色沉淀。采用此方法可以测定抗体效价或抗原效价。测定抗原的效价是：抗体为原浓度，抗原采用二倍稀释法，沉淀显出在最稀的一个稀释倍数就是该抗原的效价。此法的优点是：测定效价时间短，数据准确。抗抗抗抗抗抗原
13、体原体原体2.5cm7.5cm(3)微量免疫电泳微量免疫电泳微量免疫电泳(micro-immunoelecrophoresis)是将免疫双扩散和免疫电泳技术结合起来的一种检测方法，以此来提高免疫检测的分辨率和灵敏度。该方法是，首先将抗原通过琼脂糖凝胶电泳把抗原各个组分分开，并沿抗原分离的边线开一个小槽，然后在槽内加满抗体，抗体随琼脂糖凝胶介质的网状结构自由扩散，与抗原的相应组分相遇出现白色沉淀线。微量免疫电泳不仅可以用于抗原抗体的定性和纯度鉴定，而且可以用于临床诊断。此法的优点是：检测灵敏度高，方法简便7.5cm2.5cm(4)火箭免疫电泳火箭免疫电泳火箭免疫电泳(rocketimmunoel
14、ectrophoresis)又称单向定量免疫电泳。抗原抗体出现的沉淀线的形状类是于子弹头，故火箭电泳也因此而得名。检测的方法是先在融化的琼脂糖凝胶中加入一定量的抗体，混匀后铺成琼脂糖抗体板（也称抗体板），在抗体板的一端打一排小孔，依次加入不同浓度的抗原。在电场作用下，不同浓度的抗原向前泳动，当遇到琼脂板中的抗体时，就会形成抗原抗体复合物，出现沉淀线。由于抗原的加样孔中的抗原不断的进入凝胶向前移动，新增的抗原造成了抗原的过剩。使已形成的抗原抗体复合物又被溶解。过剩的抗原在电场的作用下继续往前走，又遇到琼脂板中未被结合的抗体，再次形成新的抗原抗体复合物，出现新的沉淀线。因此，在电泳过程中抗原不断的
15、发生沉淀溶解沉淀。只有在加样孔内的抗原完全进入凝胶并与抗体形成复合物时，才出现稳定的沉淀线。若抗原的浓度越大，形成火箭峰越高，浓度越小形成峰越低。8cm8cm(5)双向免疫电泳双向免疫电泳双 向 免 疫 电 泳 也 称 之 为 交 叉 免 疫 电 泳(c r o s s e delectrophoresis)。首先在一块离子琼脂板上，像微量电泳一样将抗原各组分分开，称之为第一相。然后将其转移到玻璃板的一端并在另一侧铺上抗体琼脂板，正好与第一相凝胶衔接。由于第一相已经将抗原的蛋白组分分开了，在进行第二相时只有单一组分的各个抗原向前泳动。当各种组分的抗原与抗体板中的相应抗体相遇时，就会出现各个组分
16、的抗原抗体复合物沉定。第一向电泳第二向电泳5 酶联免疫吸附检测法酶联免疫吸附检测法酶联免疫吸附测定技术是在1971年由瑞典科学家Engvall等人提出来的。它们采用纤维素和聚苯乙烯是管作为固定相载体来吸附抗原或抗体，并建立了酶联免疫吸附测定法(EnzymeLinkedImmunoserbentAssay，简称ELISA)。1974年，因Voller等人改用聚苯乙烯微量反应板为固定相作为免疫吸附载体，才使酶联免疫吸附法得到了广泛的应用。ELISA检测由于采用了酶标法，被标记酶的酶促与相应的底物反应具有放大作用。它除了能保留抗原抗体的高度特异性结合外，还提高了检测灵敏度，使检测量达到ng甚至pg级
17、的水平，接近放射免疫测定。ELISA检测法在临床和生物学研究中广泛应用，在抗原，半抗原和抗体的测定方面起到重要作用，尤其在单克隆抗体的研究中，为杂交瘤细胞株的筛选，提供了简单快捷，灵敏，快速的测定方法。免疫酶技术是将酶标记在抗体或抗原分子上，形成酶标抗原或抗体，称之为酶结合物。该结合物中的酶分子，在免疫反应后作用于相应的底物生成颜色。根据反应是否产生颜色可判断抗原或抗体是否存在，作定性鉴定；根据反应产生颜色的深浅来测定抗原或抗体含量。ELISA检测法是免疫酶技术中一种，它是利用聚苯乙烯微量反应板具有吸附蛋白质能力的特性，将待测抗原或抗体吸附在聚苯乙烯酶标反应板上，使其固相化，然后进行免疫结合和
18、酶反应。根据ELISA检测法的吸附方法不同，免疫吸附反应的类型也不同，归纳起来主要有四类。5.1直接法测定抗体直接法测定抗体该法是将待测抗体吸附在聚苯乙烯酶标板的凹槽内，经保温吸附后，洗去游离的未被吸附的抗体。然后再加酶标抗抗体，保温一段时间，加入底物显色，反应30分钟，终止酶反应，进行定量测定。A将抗体吸附在固定相载体表面，洗去游离的抗体B加入酶标抗抗体，保温，洗去未被结合的酶标抗体C加入底物显色，测定底物的降解量。底物的降解量就等于抗体的量。5.2间接法测定抗体间接法测定抗体间接法测定抗体，也称测定抗体间接法。该法是将已知浓度的抗原吸附在聚苯乙烯酶标板的凹槽内，经保温吸附后，洗去游离的未被
19、吸附的抗原。再加入待测抗体保温一定的时间，使抗体与抗原充分结合，洗去未被结合的抗体，然后再加酶标抗抗体，保温一段时间，加入底物显色，反应30分钟，终止酶反应，进行定量测定。ABCDA将抗原吸附在固定相载体表面，洗去游离的抗原B加入抗体与吸附在固定相载体表面抗原结合,洗去游离的抗体C加入酶标抗抗体，保温，洗去未被结合的酶标抗体D加入底物显色，测定底物的降解量。底物的降解量就等于抗体量5.3 双抗夹心法测定抗原双抗夹心法测定抗原双抗夹心法测定抗原，是首先将抗原免疫第一种动物获得的特异性抗体（第一抗体），即免疫球蛋白吸附在酶标板的凹槽内，洗去未被吸附的多余抗体；加入待测抗原，保温，使其形成抗体-抗原
20、复合物，洗去未被结合的抗原；再加入抗原免疫第二种动物获得的特异性抗体（第二抗体），保温，使其形成抗原-抗体复合物，洗去未被结合的抗体；然或加入酶标抗抗体（抗第二种动物抗体的抗体）；保温，使其形成抗体抗抗体复合物，洗去未被结合的酶标抗体；加入底物显色，终止酶反应，比色测定抗原量ABCDEA将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附在固定相载体表面，洗去游离的抗体B加入抗原，保温，形成抗原-抗体复合物，洗去未被结合的抗原和杂蛋白C加入抗原免疫第二种动物获得的抗体，保温，形成抗原-抗体复合物，洗去多余的抗原和杂蛋白D加入酶标抗抗体（抗第二种动物抗体的抗体），保温，洗去未被结合的酶标抗抗体E加入底物显色，测定
21、底物的降解量。底物的降解量就等于抗原的量。5.4竞争法测定抗原竞争法测定抗原竞争法测定抗原，首先将特异性抗体分成两份（B1和B2），分别加入到聚苯乙烯酶标板的凹槽内，使抗体吸附在酶标板上，然后在B1板中加入酶标抗原和待测抗原的混合物；在B2板中只加入与B1相同浓度的酶标抗原，分别洗去未被吸附的抗原，加入底物显色，比色测定。待测液中未知抗原量越多酶标抗原被竞争结合的量就越少，降解底物就越少，与底物反应生成的颜色就越浅。利用B1和B2酶标抗原的底物降解凉的差值便可计算出未抗原的量。ABCA将抗体吸附于固相载体表面；B甲加入酶标抗原和待测抗原，乙加入酶标抗原，温育；C加入底物生成有色产物，分别测定光
22、吸收值6单克隆抗体技术单克隆抗体技术单克隆抗体(monoclonalantibody，简称McAb)是免疫学领域一个重要的分支，在生物学核医学等方面具有广泛的应用价值。1975年Kohler&Milstein等人报道了采用细胞融合技术将绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，建立了能产生抗绵羊红细胞的单克隆抗体。单克隆抗体与常规的血清抗体不同，单克隆抗体是针对抗原某一个决定簇，而血清抗体是针对许多抗原决定簇的混合体。因此单克隆是一种高特异性的抗体。单克隆抗体主要是通过细胞融合而获得杂交瘤细胞，利用B淋巴细胞杂交瘤技术，分离出产生某种预定性质单克隆抗体的杂交瘤细胞，这种选择性制备抗单克隆抗体技术称之为抗体工程，其中包括两种亲本细胞（骨髓瘤细胞和预先免疫过的小鼠脾细胞）的选择性和制备，细胞融合，杂交瘤细胞的筛选和克隆化，单克隆抗体的制备和特性鉴定及单克隆抗体的纯化步骤。6.1单克隆抗体基本技术单克隆抗体基本技术制备融合细胞细胞融合杂交瘤细胞的筛选和培养特异性抗体的检测杂交瘤细胞的克隆杂交瘤细胞的冻存杂交细胞株染色体检测单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的分离纯化单抗产品.6.2单抗制备流程图单抗制备流程图
