1、第四章 微生物的遗传与变异 4.1微生物的遗传 4.2微生物的变异 4.3微生物基因重组 4.4人工构建新菌株 4.5菌种的衰退、复壮与保藏4.1微生物的遗传 遗传的概念营养类型和环境条件传给后代。遗传的保守性：遗传不可改变的一面。遗传的变异性：环境迁移，产生适应新环境的酶，适应新环境 遗传的物质基础DNA 遗传物质在微生物中的存在染色体：所有微生物DNA的主要存在形式细胞器：真核微生物质粒4.2微生物的变异 微生物的变异与基因突变 变异：非遗传性变异 未改变微生物的DNA 变异可逆 遗传性变异 DNA发生改变 变异不可逆 相对稳定的遗传下来 基因突变：生物细胞遗传物质DNA分子结构突然发生了
2、稳定的可遗传的变化。发生随机性，结果无定向性 频率稀有性，可诱变性 可逆性 稳定性Luria等的变量试验等的变量试验 Newcombe的涂布试验的涂布试验 J.Lederberg等设计等设计的平板影印培养法的平板影印培养法 4.2微生物的变异 突变类型 按突变导致的表型改变分为：形态突变型、生化突变型、致死突变型和条件致死突变型 按突变的条件和原因划分 自发突变：在自然条件发生的。诱发突变：利用诱变剂引起的基因突变。物理诱变 利用物理因素 化学诱变 利用化学物质 复合处理及协同效应 物理化学诱发突变4.3微生物基因重组 4.3.1概念：两个不同性状的个体细胞的DNA融合，使基因重新组合，从而发
3、生遗传变异产生新品种。4.3.2原核微生物的基因重组 细菌接合 转导 转化 原生质体融合（4.4中介绍）接合接合（合作）（合作）接合：接合：是细菌通过性菌毛将遗传物质（主要是质粒DNA）从供体菌转移给受体菌。转导是转导是1951年辛德尔年辛德尔(Zinder)和莱德贝尔格和莱德贝尔格(1Jederberg)在研究鼠沙门氏伤寒杆菌重组时发在研究鼠沙门氏伤寒杆菌重组时发现的。现的。转导转导是以温和噬菌体为载体，将供体菌的一段DNA转移到受体菌内，使受体菌获得新的性状。LA-2A-B+LA-22A+B-LA-2是是能能合合成色氨酸成色氨酸（B+）但）但 不不能能合成组氨合成组氨酸酸（A-）的）的沙门
4、氏伤寒沙门氏伤寒杆菌杆菌 指导色氨指导色氨酸合成的基酸合成的基因因超微烧结玻璃板细菌不能通过，细菌不能通过，噬菌体可以通过LA-22 是是 合成合成色氨酸色氨酸（B-）但）但能能合成组氨酸合成组氨酸（A+）的的沙门氏伤寒杆菌沙门氏伤寒杆菌一些细胞中含有繁一些细胞中含有繁殖速度较慢的殖速度较慢的 温和温和噬菌体噬菌体P-22 不不 能能转化转化Transformation（引进）（引进）供体菌供体菌受体菌受体菌DNA片段片段老鼠体内老鼠体内提取物培提取物培养现象养现象活的活的S 肺炎双球菌肺炎双球菌活的活的R 肺炎双球菌肺炎双球菌 无毒无毒 杀死杀死 杀死杀死 加热杀死后加热杀死后的破碎细胞的破
5、碎细胞混合注射混合注射加热杀死后加热杀死后的破碎细胞的破碎细胞无毒无毒注射注射注射注射1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M。McCarty从热死S型S.pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分，在离体条件下进行了转化试验：只有S型细菌的DNA才能将S.Pneumoniae的R型转化为S型。且DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转移给R型菌株的，是遗传因子。v加S菌DNAv加S菌DNA及DNA酶以 外的酶v加S菌的DNA和DNA酶v加S菌的RNAv加S菌的蛋白质v加S菌的荚膜多糖活R菌长出S菌只有R菌转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）转化过程（革兰氏阳性
6、菌的转化模型）转化过程的特点：转化过程的特点：a）对核酸酶敏感；）对核酸酶敏感；b）不需要活的）不需要活的DNA供体细胞；供体细胞；c）转化效率取决于转化菌株之间的亲源关系；）转化效率取决于转化菌株之间的亲源关系；d）通常情况下质粒的自然转化效率要低得多）通常情况下质粒的自然转化效率要低得多4.3微生物基因重组 4.3.3真核微生物的基因重组 有性杂交 准性生殖 菌丝联结 形成异核体 核融合 体细胞交换 酵母菌染色体外的DNA重组有性杂交有性杂交细胞（细胞（）细胞（）细胞（）有性接合有性接合 染色体重组染色体重组 新遗传型新遗传型能产生有性孢子的酵母菌、霉菌和蕈菌都可以进行有性杂交能产生有性孢
7、子的酵母菌、霉菌和蕈菌都可以进行有性杂交准性杂交准性杂交细胞（细胞（）细胞（）细胞（）准性接合准性接合 基因重组基因重组 新遗传型新遗传型菌丝联结菌丝联结 质配质配 核配核配 有丝分裂交换有丝分裂交换 单倍体杂合子单倍体杂合子在半知菌类中最为常见在半知菌类中最为常见半半知知菌菌的的准准性性生生殖殖酵母菌染色体外的DNA重组 2m质粒 线粒体DNA4.4人工构建新菌株 4.4.1诱变育种-诱变育种的原则诱变育种的原则1.诱变育种的原则诱变育种的原则（1）使用简便有效的诱变剂）使用简便有效的诱变剂诱变剂诱变剂物理因素物理因素化学因素化学因素紫外线紫外线激光激光离子束离子束X射线射线r射线射线快中子
8、快中子烷化剂烷化剂碱基类似物碱基类似物吖啶化合物吖啶化合物（2）选用优良的出发菌株）选用优良的出发菌株（3）处理单细胞或单孢子悬浮液）处理单细胞或单孢子悬浮液（4）使用最佳诱变剂量）使用最佳诱变剂量 剂量剂量=强度（浓度）强度（浓度）作用时间作用时间 相对剂量相对剂量=杀菌率杀菌率（5）利用协同效应）利用协同效应（6）变异菌株的筛选）变异菌株的筛选 常用的诱变剂：紫外线、5溴尿嘧啶、烷化剂、亚硝酸、卟啶染料等。突变株的筛选方法突变株的筛选方法诱变诱变检出营养缺陷型检出营养缺陷型淘汰野生型淘汰野生型鉴定营养缺陷型鉴定营养缺陷型富集培养富集培养（抗生素法）（抗生素法）（菌丝过滤法）（菌丝过滤法）逐
9、个检出法逐个检出法影印平板法影印平板法生长谱法生长谱法诱变正变率正变率 多数未变多数未变少数突变少数突变多数负变多数负变少数正变少数正变多数幅度小多数幅度小少数幅度大少数幅度大“高产率高产率”多数不宜投产多数不宜投产少数适宜投产少数适宜投产“投产率投产率”可计算：可计算：出发菌株出发菌株 绝大多数个体死亡绝大多数个体死亡少数存活少数存活存活率存活率突变率突变率 通常生产上更多利用的是通常生产上更多利用的是诱导法。诱导法。通过驯化，能产生诱导酶的菌株被保留下来，且通过驯化，能产生诱导酶的菌株被保留下来，且能力逐步提高。能力逐步提高。4.4人工构建新菌株 4.4.2原生质体融合 概念：通过人为的方
10、法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的、遗传性稳定的融合子的过程，称为原生质体融合。原生质体融合的优点：可以提高重组率 遗传物质的传递更为完整 重组体种类较多重组体种类较多 有利于不同种间、属间微生物的杂交 通过原生质体融合提高产量 微生物原生质体融合的过程微生物原生质体融合的过程 标记菌株的筛选；标记菌株的筛选；原生质体的制备；原生质体的制备；原生质体的融合；原生质体的融合；融合子的选择；融合子的选择；原生质体的再生；原生质体的再生；实用性菌株的筛选实用性菌株的筛选。选择亲株选择亲株 选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株选择遗传性状稳定且
11、具有优势互补的两个亲株带有带有可可以以识别的遗传标记识别的遗传标记，如营养缺陷型或抗，如营养缺陷型或抗药性等药性等 原生质体制备原生质体制备 去除细胞壁去除细胞壁是制备原生质体的关键是制备原生质体的关键 原生质体融合原生质体融合 聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）能有效地促进原生质体融合）能有效地促进原生质体融合一般一般PEGPEG的使用浓度范围在的使用浓度范围在25-40%25-40%采用电融合仪：在高频电场下，用直流电穿孔来进行融合采用电融合仪：在高频电场下，用直流电穿孔来进行融合原生质体再生原生质体再生 使原生质体重新长出细胞壁使原生质体重新长出细胞壁 ，恢复完整的细胞形态结构，恢复完整
12、的细胞形态结构不同微生物的原生质体的最适再生条件不同，最重要的一个不同微生物的原生质体的最适再生条件不同，最重要的一个共同点是都需要高渗透压共同点是都需要高渗透压 再生率再生率 细菌为细菌为3-10%3-10%真菌在真菌在20-80%20-80%融合重组子的筛选融合重组子的筛选通过两亲株遗传标记的互补而得以识别通过两亲株遗传标记的互补而得以识别 两亲株的遗传标记分别为营养缺陷型两亲株的遗传标记分别为营养缺陷型A+B-A+B-和和A-B+A-B+，融合重组，融合重组子应是子应是A+B+A+B+或或A-B-A-B-重组子的检出方法有两种：重组子的检出方法有两种：直接法直接法 将融合液涂布在不补充亲
13、株生长需要的生长因子的将融合液涂布在不补充亲株生长需要的生长因子的高渗再生培养基平板上，直接筛选出原养型重组子高渗再生培养基平板上，直接筛选出原养型重组子 间接法间接法 把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板上，使亲株把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板上，使亲株和重组子都再生成菌落和重组子都再生成菌落 ，然后用影印法将它们复制到，然后用影印法将它们复制到选择培养基上检出重组子。选择培养基上检出重组子。4.4人工构建新菌株 基因工程概念：在基因水平上的遗传工程，供体DNA切割后，与载体连接，导入某一受体细胞中，获得新品种。体体 外外 切切 割割 导导 入入遗遗 传传 物物 质质 基基 因因 片片
14、 段段 受受 体体 细细 胞胞获得目的基因获得目的基因选择基因载体选择基因载体体外重组体外重组外源基因导入（细菌、外源基因导入（细菌、植物植物、动物动物、基因枪基因枪）筛选和鉴定筛选和鉴定应用应用基因工程的基本操作基因工程的基本操作在特殊培养基上在特殊培养基上（如含有青霉素如含有青霉素）筛选目的细菌筛选目的细菌质粒载质粒载体（具体（具有有抗性抗性基因基因）抵抗青霉素抵抗青霉素长出必然是长出必然是重组成功的重组成功的细菌细菌.降解石油的工程细菌降解石油的工程细菌 查氏将能降解脂查氏将能降解脂(含质粒含质粒A)的一种假单胞菌作受体细菌，分别将能降的一种假单胞菌作受体细菌，分别将能降解芳烃解芳烃(质
15、粒质粒B)、芳烃、芳烃(质粒质粒C)和多环芳烃和多环芳烃(质粒质粒D)的质粒，用遗传工的质粒，用遗传工程方法人工转入受体细菌，获得多质粒程方法人工转入受体细菌，获得多质粒“超级细菌超级细菌”，可除去原油，可除去原油中中23的烃。浮油在一般条件下降解需一年以上时间，用的烃。浮油在一般条件下降解需一年以上时间，用“超级细超级细菌菌”只需几小时即可把浮油去除，速度快效率高。只需几小时即可把浮油去除，速度快效率高。接接合合接接合合接接合合基因工程的应用基因工程的应用.耐汞工程菌耐汞工程菌 恶臭假单胞菌一般在超过恶臭假单胞菌一般在超过2ugml汞浓度中即将中汞浓度中即将中毒死，查克拉巴蒂用质粒转移技术，
16、把嗜油假单毒死，查克拉巴蒂用质粒转移技术，把嗜油假单胞菌的耐汞质粒胞菌的耐汞质粒(MER质粒质粒)转移到恶臭假单胞菌转移到恶臭假单胞菌中去，后者获得中去，后者获得MER质粒，可在质粒，可在5070ugml氯氯化汞中生长。化汞中生长。脱色工程菌的构建脱色工程菌的构建 将分别含有降解偶氮染料质粒的偏号将分别含有降解偶氮染料质粒的偏号Kx和和Kd两两株假单胞菌通过质粒转移技术培育出兼有分解两株假单胞菌通过质粒转移技术培育出兼有分解两种偶氮染料功能的脱色工程种偶氮染料功能的脱色工程 菌。菌。4.5菌种的衰退、复壮和保藏 菌种的衰退与复壮-衰退（degeneration）：在微生物的生长过程中，由于变异
17、的存在，使原有的优良性状发生负变，即菌种的衰退。复壮(rejuvenation)：从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；是指在菌种未衰退前就有意识进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。4.5 菌种的衰退、复壮和保藏 菌种的衰退与复壮菌种衰退的原因：大量群体中的自发突变菌种衰退的原因：大量群体中的自发突变纯菌种纯菌种不纯菌种不纯菌种突变个体突变个体原始个体原始个体衰退衰退菌种菌种4.5菌种的衰退、复壮和保藏 菌种的衰退与复壮 防止衰退的措施 减少传代次数；创造良好的培养条件；利用单核体传代 经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查；采用有效
18、的菌种保藏方法；4.5菌种的衰退、复壮和保藏 菌种的衰退与复壮 菌种的复壮 纯种分离纯种分离 通过寄主体进行复壮通过寄主体进行复壮 淘汰已衰退的个体淘汰已衰退的个体 4.5菌种的衰退、复壮和保藏 菌种保藏 目的：在一定时间内使菌种不死、不变、不乱，以供研究、生产、交换之用 基本原则：挑选典型菌种的优良纯种挑选典型菌种的优良纯种 尽量使用分生孢子、芽孢等休眠体尽量使用分生孢子、芽孢等休眠体 创造有利于休眠的保藏环境（如干燥、低温）创造有利于休眠的保藏环境（如干燥、低温）尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重要尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重要的微生物菌株的微生物菌株 4.5菌种的衰退、复壮
19、和保藏 菌种保藏基本方法基本方法培养基传代培养（斜面、平板）培养基传代培养（斜面、平板）寄主传代培养寄主传代培养真空冷冻干燥法真空冷冻干燥法 沙土管干燥沙土管干燥生活态生活态休眠态休眠态石蜡油封藏法石蜡油封藏法 低温（液氮、低温冰箱）低温（液氮、低温冰箱）几种常用菌种保藏方法的比较几种常用菌种保藏方法的比较思考题 基因突变的特点是什么？简述原核微生物基因重组的机理？人工构建新菌株的方法有哪些？菌种衰退和复壮的概念是什么？菌种的保存方法有哪些？冷冻干燥保藏法和液氮保藏法冷冻干燥保藏法和液氮保藏法影印试验影印试验(replica plating)（六）紫外线对（六）紫外线对DNA的损伤及其修复的损
20、伤及其修复嘧啶嘧啶嘧啶二聚体嘧啶二聚体UV1、光复活作用、光复活作用嘧啶二聚体嘧啶二聚体嘧啶嘧啶光解酶光解酶二、不同对象的细胞工程二、不同对象的细胞工程（一）微生物细胞工程（一）微生物细胞工程 1、定义：微生物细胞工程应用微生物进行定义：微生物细胞工程应用微生物进行细胞水平的研究与生产，具体内容包括各种微生细胞水平的研究与生产，具体内容包括各种微生物细胞的培养、遗传性状的改造、微生物细胞的物细胞的培养、遗传性状的改造、微生物细胞的直接利用或获得细胞代谢产物等。直接利用或获得细胞代谢产物等。2、细胞融合基本过程、细胞融合基本过程原生质体的制备原生质体的制备 融合重组融合重组 原生质体再原生质体再
21、生成细胞生成细胞 融合重组的测定融合重组的测定（1）原生质体的制备）原生质体的制备酶解法酶解法 质生质体的形成率原生质体数质生质体的形成率原生质体数/未经酶处未经酶处理的总菌数。理的总菌数。革兰氏阳性菌：溶菌酶，肽聚糖中革兰氏阳性菌：溶菌酶，肽聚糖中N乙乙酰胞壁酸与酰胞壁酸与N乙酰葡萄糖胺之间的乙酰葡萄糖胺之间的 1,4糖糖苷键苷键革兰氏阴性菌：溶菌酶革兰氏阴性菌：溶菌酶+(数分钟后）数分钟后）0.1mol/L的的EDTA共同作用共同作用1520min，则可使，则可使90%以上的革兰氏阴性菌转变为可供细胞融合用以上的革兰氏阴性菌转变为可供细胞融合用的球状体。的球状体。真核细胞：消解酶、蜗牛酶、
22、纤维素酶、真核细胞：消解酶、蜗牛酶、纤维素酶、几丁质酶等处理，原生质体得率在几丁质酶等处理，原生质体得率在90%以上。以上。二、不同对象的细胞工程二、不同对象的细胞工程 注意：原生质体制备后必须用渗透压稳定剂维注意：原生质体制备后必须用渗透压稳定剂维持其稳定性。持其稳定性。（2）融合重组）融合重组p146图图46注意：原生质体融合重组作为基因声称的一注意：原生质体融合重组作为基因声称的一种有效方法，需经历三个主要阶段：细胞融合形种有效方法，需经历三个主要阶段：细胞融合形成异核体、不同核融合产生二倍体、融合核交换成异核体、不同核融合产生二倍体、融合核交换和重组生成重组体和重组生成重组体（3）原生
23、质体再生成细胞）原生质体再生成细胞二、不同对象的细胞工程二、不同对象的细胞工程置于高渗再手固体培养基中。置于高渗再手固体培养基中。再生频率（原生质体再生细胞数再生频率（原生质体再生细胞数/总菌落数）总菌落数）100%(主要是利用原生质体对渗透压的敏感性）主要是利用原生质体对渗透压的敏感性）（4）融合重组的测定）融合重组的测定 直接法：不补充两亲株生长所需营养物直接法：不补充两亲株生长所需营养物或补充两种药物或补充两种药物 间接法间接法:亲株和重组子都再生，然后用影亲株和重组子都再生，然后用影印法复制到选择培养基上以检出重组子。印法复制到选择培养基上以检出重组子。融合频率融合子数融合频率融合子数/再生的原生质体数再生的原生质体数二、不同对象的细胞工程二、不同对象的细胞工程
