1、实验专题模块五实验专题模块五 RNA的提取及定量的提取及定量PCR检测技术检测技术总总RNARNA的提取的提取反转录反转录实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRp RNA是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。对RNA进行操作在分子生物学中占有重要地位。p 获得高纯度和完整的RNA是很多分子生物学实验所必需的，如cDNA合成、定量PCR、Northern杂交及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取决于RNA的质量。p RNA中rRNA的数量最多，占总量的80%85%；tRNA及核内小分子RNA占15%20%；mRNA仅占1%5%。从基因克隆、表达与诊断的目的出发，目前对RNA的分离与纯化，主要集
2、中在总RNA与mRNA上。在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响后续RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度相对较大。在实验中，一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶；另一方面要严格控制外源性RNA酶的污染。注意与要求：注意与要求：RNA操作应在专门的区域进行，离心机、移液枪、试剂等均应专用。操作过程中应自始至终佩戴一次性橡胶或乳胶手套，以避免将手
3、、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带入试管或污染用具。实验使用枪头、离心管等塑料制品需均经由0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡过夜，然后灭菌，烘干。所有玻璃制品都必须在180烘烤2小时。尽量避免与其它实验共享器具，以防止交叉污染。配制溶液用的酒精，异丙醇等应使用RNA实验专用的试剂。提取获得的组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物，即可以利用逆转录酶进一步反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，从而获得目的基因或检测目的基因的表达。鉴于基因表达差异分析在临床实践中的广泛应用，本模块主要以食管癌细胞中目标基因如LCN2(
4、lipocalin 2)转录表达水平的定量检测为例，旨在使学生能够系统地理解RNA提取、反转录和实时荧光定量PCR检测过程，熟练使用有关仪器和软件，掌握基本操作和分析过程，并学会运用相关的实验技术与方法，利用网上的分子生物学信息资源，独立设计出相关解决方案，并能够评价与实施这一方案。实验一实验一 总总RNA的提取的提取一、实验目的一、实验目的1.了解并掌握总RNA提取的基本原理。2.熟悉TRIzol法提取细胞总RNA的具体操作过程。二、实验原理二、实验原理 总RNA的提取围绕着一条主线，即保护RNA的完整性，使RNA免受RNase的酶解。围绕这条主线，要关注RNase-Free工作环境的建立、
5、反应中RNase-Free条件的保持、RNA的保存等一系列细节问题。所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即1）样品细胞或组织的有效破碎；2）有效地使核蛋白复合体变性；3）对内源RNA酶的有效抑制；4）有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；5）对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。TRIzol试剂提取总试剂提取总RNA该法是(异)硫氰酸胍-酚氯仿一步法的改进方法，其产率与(异)硫氰酸胍-酚氯仿一步法相当。它是以(异)硫氰酸胍-酚的单相裂解试剂裂解细胞。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚而得到释放。酚虽可
6、有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8-羟基喹啉、-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，变性的DNA与蛋白质位于两相的界面，保留于上层水相的RNA在RNA沉淀溶液中通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤进行制备。Trizol试剂可用于小量样品（50100mg组织、5106细胞）也适用于大量样品（1g组织、107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。三、三、实验操作实验操作1.样品处理：a 单层培养细胞：细胞接种在12孔培养板中，待细胞满度达90%以上或成融合状态时，弃去培养基，用1m
7、l枪头将剩余培养基吸干，每个孔直接加入500l的TRIzol试剂裂解细胞（每10cm2面积加1ml试剂）将培养板放在三维迷你摇床上，室温（15-30）下充分裂解，至少需5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。将裂解液转移至1.5ml离心管中。（注：加TRIzol之前勿需洗涤细胞。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有基因组DNA污染。）2.每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。3.4下，11000g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约
8、为所用TRIzol试剂的60。4.把水相转移到新管中，加入0.5ml异丙醇（1ml TRIzol的用量），充分混匀后，室温放置10分钟，以沉淀水相中的RNA。5.4下，11000g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。弃去上清。6.用75乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75乙醇。4不超过7500g离心5分钟，弃上清，将离心管倒置在吸水纸上，让残留乙醇挥发，时间约为5分钟。（注意不要完全晾干，否则会导致RNA的溶解性降低）7.加入10l DEPC水，盖紧盖子，轻弹管底，使RNA沉淀充分溶解，冰上放置10分钟。8.RNA含量测定：紫外分光
9、光度法测量所提RNA的浓度与纯度，并登记在实验记录本上。剩余RNA保存于-80C冰箱中，备用。注：RNA在260nm波长处有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波长分光测定RNA浓度，OD值为1相当于大约40g/ml的单链RNA。如用1cm光径，用DEPC水稀释DNA样品n倍并以DEPC水为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：RNA（mg/ml）=40OD260读数稀释倍数(n)/1000（RNA纯品的OD260/OD280的比值为2.0，故根据OD260/OD280的比值可以估计RNA的纯度。若比值较低，说明有残余蛋白质和基因组DNA污染；比值太高，则提示RNA有
10、降解）实验二实验二 反转录反转录一、实验目的一、实验目的了解并掌握cDNA合成的基本原理及其具体操作过程。二、实验原理二、实验原理 反转录是进行基因工程过程中，人为地提取出所需要的目的基因的信使RNA，并以之为模板人工合成DNA的过程。反转录过程由反转录酶催化，该酶也称依赖RNA的DNA聚合酶（RDDP），即以RNA为模板催化DNA链的合成。合成的DNA链称为与RNA互补DNA（cDNA）。反转录酶存在于一些RNA病毒中，可能与病毒的恶性转化有关。人类免疫缺陷病毒（HIV）也是一种RNA病毒，含有反转录酶。在小鼠及人的正常细胞和胚胎细胞中也有反转录酶，推测可能与细胞分化和胚胎发育有关。大多数反
11、转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性。DNA聚合酶活性：以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。此酶需要RNA为引物，多为色氨酸的tRNA，在引物tRNA3末端以53方向合成DNA。反转录酶中不具有35外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。RNase H活性：由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNase H从RNA 5端水解掉RNA分子。DNA指导的DNA聚合酶活性：以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子。反转录反应使用反转录酶，以随机引物、Oligo(dT)或基因特异性的引物
12、起始。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种引物都可采用。随机引物适用于任何类型的RNA模板，但由于特异性低，主要用于单一模板的RT-PCR反应。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。Oligo(dT)只适用于具有PolyA尾巴的RNA，对无PolyA尾巴的原核生物的RNA、真核生物的rRNA、tRNA以及某些种类的真核生物的mRNA不适用。由于PolyA RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。基因特异性引物是根据模板序列设计的互补引物
13、，特异性好，但仅适用于目的序列已知的情况。cDNA合成的模板可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物，无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无基因组DNA的污染。目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。本实验将以TaKaRa公司提供的PrimeScript RT reagent Kit试剂盒（Code No.RR037A）为例进行介绍。三、三、实验操作实验操作*1：Oligo dT Primer和Random 6 mers同时使用，可有效将全长mRNA反转录成cDNA.*2：10l反转录反应体系可最大使用500ng的Total RNA。1.反转录反应体
14、系配制：按如下成分于冰上配制反应混合液，为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+1的量配制Master Mix，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品。轻柔混匀后立即进行反转录反应。2.反应条件(注：上述反转录过程可在PCR仪中操作完成)第一步，37，15 min（反转录反应）第二步，85，5 sec（反转录酶的失活反应）第三步，4注：1.将得到的 RT 反应液加入到下一步的Real Time PCR反应体系中，其加入量不要超过PCR 反应体积的 1/10（V/V）量。2.合成的cDNA需要长期保存时，请于-20或更低温度保存。实验三实验三 实时荧光定量实时荧光定量PC
15、R一、实验目的一、实验目的1.了解并掌握实时荧光定量PCR的基本原理2.熟悉使用有关仪器和软件，掌握基本操作和分析过程，并学会运用相关的实验技术与方法，利用网上的分子生物学信息资源，独立设计出相关解决方案。二、实验原理二、实验原理 实时荧光定量PCR技术（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction，Real-Time PCR）是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术。在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的cDNA的起始浓度进行定量的方法。实时
16、荧光定量PCR是目前确定样品中cDNA拷贝数最敏感、最准确的方法。荧光定量检测系统由实时荧光定量PCR仪，实时荧光定量试剂，通用电脑，自动分析软件等构成。设备由荧光定量系统和计算机组成（见图3-2），用来监测循环过程的荧光。与实时设备相连的计算机收集荧光数据。数据通过实时分析软件以图表的形式显示。原始数据被绘制成荧光强度相对于循环数的图表。实时设备的软件能使收集到的数据进行正常化处理来弥补背景荧光的差异。正常化后可以设定域值水平，这就是分析荧光数据的水平。样品到达域值水平所经历的循环数称为Ct值（限制点的循环数）。域值应设定在使指数期的扩增效率为最大，这样可以获得最准确，可重复性的数据（见图3
17、-3）。如果同时扩增的还有标有相应浓度的标准品，线性回归分析将产生一条标准曲线，可以用来计算未知样品的浓度。图3-2 7500 型实时荧光定量PCR系统图3-3 扩增曲线对数图谱 线性图谱qPCR的扩增曲线有两种视图方式：线性图谱和对数图谱。1基线的定义（见图3-4）是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即是基线。图3-4 基线对数图谱 线性图谱2荧光域值（threshold）的设定（见图3-5）一般将PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，荧光阈值设定在PCR扩增的指数期。对
18、数图谱 线性图谱图3-5 阈值3Ct值的定义（见图3-6）在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念-Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。图3-6 Ct值的定义4Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值（见图3-7）。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。图3-7如何使用Ct值计算结果5荧光化学荧光定量PCR所使
19、用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。不同的仪器可选用的荧光标记组合不一（见图3-8）。图3-8 7500 型实时荧光定量PCR系统可使用的荧光标记1）TaqMan荧光探针（见图3-9）：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53 核酸外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR产物形成完全同步。而新型Ta
20、qMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。图3-9 TaqMan荧光探针2）SYBR荧光染料（见图3-10）：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。图3-10 SYBR荧光染料本实验将以TaKaRa公司提供的TB Green Fast qPCR Mix试剂盒（Code No.RR430B）为例进行介绍。使用注意以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前
21、一定认真阅读。1.使用前，请上下轻轻颠倒混匀，避免产生气泡，试剂混匀后再使用。试剂混合不均匀会造成反应效果不佳。(1)请勿涡旋振荡混匀。(2)TB Green Fast qPCR Mix(2)在-20保存时，可能会产生白色或淡黄色的沉淀。可用手握缓慢溶解，或于室温短时间避光放置后，上下颠倒混匀直至沉淀全部消失。(3)沉淀会导致试剂组份不均匀，必须混匀后再使用。2.配制反应液时，试剂请于冰上放置。3.本制品中含有荧光染料TB Green，配制PCR 反应液时应避免强光照射。4.反应液的配制、分装请一定使用新的一次性枪头、尽量避免样品间的污染。三、三、实验操作实验操作1.建立Real-time P
22、CR反应体系：于冰上溶解TB Green Fast qPCR Mix，cDNA模板，引物（LCN2和-actin）和RNase-free dH2O，混匀。依次在8联管内加入下列试剂（10 l反应体系）：*2：ROX Reference Dye II（50）比ROX Reference Dye（50）浓度低，使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR 时，使用ROX Reference Dye II（50）。注：反应体系可随需要调整，反应液配制在冰上进行，多个样品同时操作时，可以先配制一个Master Mix，再分装到各管。2.进行Real-time PCR反
23、应PCR 反应条件第一步，预变性：95，30 sec 第二步，PCR反应：95，5 sec，60，34 sec，40 个循环。第三步，溶解曲线分析注：1.选择所使用的荧光通道（FAM、ROX）;2.采用两步法PCR反应程序进行反应，当出现模板浓度过低引起非特异性扩增，引物Tm值较低导致的扩增效率低下或扩增曲线重现性不佳等现象时，可尝试进行三步法PCR扩增反应。3 将反应体系（8联管）置于荧光定量PCR仪中，设置相应的反应条件（注意设置荧光收集），开始反应。定量PCR反应是在7500型实时荧光定量PCR-Life Tech（applied biosystems）系统上进行的。4反应结束后确认Re
24、al Time PCR的扩增曲线（是否具有特征性的三个增长阶段，见图3-11）和融解曲线；通过分析溶解曲线来判断反应的特异性（见图3-12），理想的溶解曲线是单峰型，如果出现两个或两个以上的峰，说明有引物二聚体或其它非特异扩增的存在。图3-11 正常扩增图3-12单一PCR产物的熔解曲线5 实验数据的处理：Comparative Delta-delta Ct法法 Comparative Delta-delta Ct法是常用的一种相对定量方法，是基于荧光定量的数学计算模型的简化形式，用于比较不同样品之间的差别或变化比率。其最大特点是，当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因
25、做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。其缺点是，每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，这里势必存在一定的误差。注：在使用该法展开实验前，必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小于0.1，那么后续实验中就可以用Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量分析。反之，如果M差值大于0.1，则需换用其它的相对定量方法。数据分析步骤：1）同一样品分别进行看家基因和目的基因的扩增2）在Excel软件计算（2-Ct）：其中Ct目的基因Ct值看家基因Ct值；Ct值实验样品Ct对照样品Ct。最终结果以柱
26、形图进行呈现（对照样品数值为1，实验样品数值为2-Ct）。ControlCt-geneCt-actinCtSampleCt-geneCt-actinCt-Ct2-CtPG-B1N129.2615.3513.91PG-B1T229.7116.8912.821.092.128740365例：2-Ct=POWER(2,-Ct)四、预期结果四、预期结果 扩增曲线、溶解曲线、标准曲线1.到目前为止，人们对遗传性物质改变引起的遗传性疾病还无法治疗，只能通过产前监测，减少病婴出生，以防止各类遗传性疾病的发生，如为减少X连锁遗传病患儿的出生，从孕妇的外周血中分离胎儿DNA，用实时荧光定量PCR检测其Y性别决定区基因是一种无创伤性的方法，易为孕妇所接受。请尝试用你学到的相关知识，设计一个可能的实验方案。2.荧光定量PCR被广泛用于H7N9人感染禽流感检测，请谈谈还有哪些常用的实验技术手段可应用于禽流感的检测。课堂分组讨论课堂分组讨论
