1、 聚合酶链反应于二十世纪聚合酶链反应于二十世纪8080年代由年代由K.MullisK.Mullis建立，建立，并和定点突变的发明者并和定点突变的发明者M.SmithM.Smith一起荣获一起荣获19931993年度年度 诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时代。时代。第一节第一节 聚合酶链反应聚合酶链反应第二节第二节 以以PCRPCR为基础的相关技术为基础的相关技术第三节第三节 PCRPCR产物的检测产物的检测第一节第一节 聚合酶链反应聚合酶链反应 聚合酶链反应（聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCRpoly
2、merase chain reaction,PCR）是是DNADNA体外体外复制反应，基本原理与细胞内复制反应，基本原理与细胞内DNADNA的复制的复制相似相似 第一节第一节 聚合酶链反应聚合酶链反应第一节第一节 聚合酶链反应聚合酶链反应一、一、PCRPCR反应原理、反应过程和特点反应原理、反应过程和特点二、二、PCRPCR的反应体系的反应体系三、三、PCRPCR的反应条件的反应条件四、四、PCRPCR技术的质量控制技术的质量控制一、一、PCRPCR反应原理和反应过程反应原理和反应过程1.1.原理原理 DNA DNA的体外复制包括的体外复制包括3 3个步骤：个步骤：变性（变性（denatura
3、tiondenaturation）:94:94 C C9595 C C 退火（退火（annealingannealing）:40 :40 C C7070 C C 延伸（延伸（extensionextension）:72 :72 C C 变性变性:DNA:DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链分子作为双螺旋的氢键断裂，形成单链分子作为 反应的模板反应的模板 退火退火:引物与模板互补结合，形成杂交链引物与模板互补结合，形成杂交链 延伸延伸:按照模板链的序列以互补的方式依次把按照模板链的序列以互补的方式依次把dNTPdNTP加至引物的加至引物的3 3 端，端，Taq DNATaq DNA聚合酶使杂交双链不
4、断聚合酶使杂交双链不断延伸，直至形成新的延伸，直至形成新的DNADNA双链双链 一、一、PCRPCR反应原理和反应过程反应原理和反应过程5533d.NTPs耐热DNA聚合酶引物5353535353535353535353535353退火退火加入试管中加入试管中添加反应混添加反应混合液及样本合液及样本变性变性一、一、PCRPCR反应原理和反应过程反应原理和反应过程53535353535355TaqTaq353TaqTaq55循环循环延伸延伸继续延伸继续延伸一、一、PCRPCR反应原理和反应过程反应原理和反应过程5353535355335353第二个循环第二个循环4 4个拷贝个拷贝第三个循环第三个
5、循环8 8个拷贝个拷贝53535353535353535353533553535353第第n n个循环个循环2 2n n个拷贝个拷贝一、一、PCRPCR反应原理和反应过程反应原理和反应过程2.2.特点特点 特异性强特异性强 引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性 灵敏度高灵敏度高 指数增长，从指数增长，从pg(10pg(10-12-12)可扩增至可扩增至 m mg(10g(10-6-6)水平水平 简便、快速简便、快速 2 24 4 小时完成扩增反应小时完成扩增反应一、一、PCRPCR反应原理和反应过程反应原理和反应过程二、二、PCRPCR的反应体系的反应体
6、系参与参与PCRPCR反应的主要成份反应的主要成份:1 1.模板模板2 2.引物引物3 3.脱氧核苷三磷酸脱氧核苷三磷酸4.Taq DNA4.Taq DNA聚合酶聚合酶5 5.镁离子浓度镁离子浓度6 6.其它反应因素其它反应因素1 1.模板（模板（templatetemplate）基因组基因组DNADNA、RNARNA、质粒质粒DNADNA、线粒体线粒体DNADNA等等 RNARNA作为模板时，须先将作为模板时，须先将RNARNA逆转录为逆转录为cDNA cDNA 模板量：模板量：10001000ngng、500ng500ng、100ng100ng、50ng50ng 反应体系中较低量的模板有利
7、于提高扩增反应体系中较低量的模板有利于提高扩增产量和减少非特异性扩增产量和减少非特异性扩增 二、二、PCRPCR的反应体系的反应体系2 2.引物引物(primer)primer)化学合成的寡核苷酸化学合成的寡核苷酸 与模板特异地结合与模板特异地结合 决定产物的特异性和长度决定产物的特异性和长度二、二、PCRPCR的反应体系的反应体系设计引物的原则设计引物的原则(一一)两条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板两条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负链序列互补正负链序列互补 长度为长度为18182525个核苷酸个核苷酸 二条引物之间避免形成引物二聚体二条引物之间避免形成引物二聚体 引物浓度：引
8、物浓度：0.10.10.20.2mol/Lmol/L，浓度过高容易生，浓度过高容易生成引物二聚体成引物二聚体二、二、PCRPCR的反应体系的反应体系设计引物的原则设计引物的原则(二二)引物的碱基组成应平衡，引物的碱基组成应平衡，C+G C+G 碱基含量在引物中碱基含量在引物中的比例一般以的比例一般以45%45%55%55%为宜为宜 引物退火温度计算：引物退火温度计算：Tm=2Tm=2（A+TA+T）+4+4（C+GC+G）引物的引物的5 5 端可被修饰（引入酶切位点、引入突变端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记）位点、生物素等标记）二、二、PCRPCR的反应体系的反应体系3 3
9、.脱氧核苷三磷酸（脱氧核苷三磷酸（dNTPdNTP）dATPdATP、dCTPdCTP、dGTPdGTP和和dTTPdTTP的混合物的混合物 反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致 浓度过高虽能加快反应速度，但非特异浓度过高虽能加快反应速度，但非特异性扩增也随之增加性扩增也随之增加 最适浓度：最适浓度：2020200200mol/Lmol/L二、二、PCRPCR的反应体系的反应体系4.4.Taq Taq DNADNA聚合酶聚合酶 从一种生活在热泉（从一种生活在热泉（80809090）中的水栖）中的水栖噬热菌（噬热菌（Thermus aquaticus,TaqThe
10、rmus aquaticus,Taq）中提取，有中提取，有很高的耐热稳定性很高的耐热稳定性 二、二、PCRPCR的反应体系的反应体系Taq Taq 酶的作用酶的作用:在模板指导下，以在模板指导下，以dNTPdNTP为原料，在引物为原料，在引物3 3-OHOH末末端加上脱氧单核苷酸，形成端加上脱氧单核苷酸，形成3 3,5,5-磷酸二酯键，磷酸二酯键，使使DNADNA链沿链沿5 5 3 3 方向延伸，催化方向延伸，催化DNADNA合成合成 最适酶量：最适酶量：1 12.5U2.5U二、二、PCRPCR的反应体系的反应体系 Taq DNATaq DNA聚合酶无聚合酶无3 3 5 5 外切酶活性，因而
11、无校外切酶活性，因而无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配 Taq DNATaq DNA聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为1/300001/30000，碱基替换率为，碱基替换率为1/80001/8000，因此扩增的片段，因此扩增的片段越长，错配的机率越高越长，错配的机率越高 二、二、PCRPCR的反应的反应体系体系 耐热的高保真耐热的高保真 DNADNA多聚合酶：多聚合酶：Pwo DNA polymerase Pwo DNA polymerase Tth DNA polymerase Tth DNA polym
12、erase Pfu DNA polymerase Pfu DNA polymerase 高热稳定性，高保真性，能降低碱基错配率高热稳定性，高保真性，能降低碱基错配率二、二、PCRPCR的反应体系的反应体系5 5.镁离子浓度镁离子浓度 对反应系统本身、稳定核苷酸和提高对反应系统本身、稳定核苷酸和提高Taq Taq 酶的活性酶的活性有直接影响有直接影响 PCRPCR反应体系中反应体系中dNTPdNTP、引物、模板引物、模板DNADNA及鳌合剂均可及鳌合剂均可与与MgMg2+2+结合，降低游离结合，降低游离MgMg2+2+的浓度，影响酶的活性的浓度，影响酶的活性 dNTPdNTP浓度为浓度为2002
13、00mol/Lmol/L时，时，M MgClgCl2 2浓度为浓度为1.51.5mmol/Lmmol/L较宜较宜二、二、PCRPCR的反应体系的反应体系6 6.其它反应因素其它反应因素 pHpH：反应所需的最适反应所需的最适pHpH值在值在7.27.2左右左右 盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物与模板杂交物与模板杂交 基质：牛血清白蛋白、明胶、基质：牛血清白蛋白、明胶、Tween20Tween20、DTTDTT等等 二、二、PCRPCR的反应体系的反应体系三、三、PCRPCR的反应条件的反应条件 1.1.反应温度（变性、退火、延伸）反应温度（
14、变性、退火、延伸）2.2.反应时间（变性、退火、延伸）反应时间（变性、退火、延伸）3.3.循环次数（循环次数（PCRPCR效率及产物量）效率及产物量）4.PCR4.PCR过程的实时监测过程的实时监测1 1.反应温度反应温度 变性温度：变性温度：94949797 退火温度：低于引物退火温度：低于引物Tm Tm 5 5左右左右 温度过高：降低扩增效率温度过高：降低扩增效率 温度过低：增加非特异性扩增温度过低：增加非特异性扩增 延伸温度：延伸温度：7272三、三、PCRPCR的反应条件的反应条件 2 2.反应时间反应时间 第一次变性应给予足够时间第一次变性应给予足够时间 每一个步骤所需时间取决于扩增
15、片段的长度，每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，时间过长易导致非特异性扩增时间过长易导致非特异性扩增三、三、PCRPCR的反应条件的反应条件 3 3.循环次数循环次数 一般设为一般设为25253535个循环个循环 每一个循环使一个分子的模板被复制为二个，每一个循环使一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长产物量以指数形式增长三、三、PCRPCR的反应条件的反应条件 一个分子的模板经过一个分子的模板经过3030个循环，理论上即个循环，理论上即可得可得2 23030(约约10109 9)个拷贝产物个拷贝产物 实际反应中，每个循环的扩增效率大多约实际反应中，每个循环的扩增效率大多约为为8
16、5%85%左右左右三、三、PCRPCR的反应条件的反应条件 扩增反应的平台效应：扩增反应的平台效应：PCR PCR反应产物呈指数性增长，但这种增长反应产物呈指数性增长，但这种增长形式在扩增形式在扩增25253535个循环以后便放慢直至停止，个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随循环次达到反应平台，此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长。数的增加而呈指数增长。三、三、PCRPCR的反应条件的反应条件 n指数增长期指数增长期n线形增长期线形增长期n平台期平台期循环数 理论值 实际值Log 产物DNA4.PCR实时监测实时监测三、三、PCRPCR的反应条件的反应条件 平
17、台出现得迟早与模板的初始量有关，模板初始平台出现得迟早与模板的初始量有关，模板初始量越多，平台出现得越早量越多，平台出现得越早 平台效应产生的因素：平台效应产生的因素：引物二聚体的产生引物二聚体的产生 反应体系各组分的消耗反应体系各组分的消耗 引物和已扩增的引物和已扩增的DNADNA片段间的竞争等片段间的竞争等三、三、PCRPCR的反应条件的反应条件 四、四、PCRPCR技术的质量控制技术的质量控制1.1.实验室的规范化设置实验室的规范化设置 试剂贮存和准备区试剂贮存和准备区 标本制备区标本制备区 扩增反应区扩增反应区 产物分析区产物分析区 2.2.防污染体系：防污染体系：正确设置实验室、严格
18、规范实验操作、完整有正确设置实验室、严格规范实验操作、完整有效的去污染措施效的去污染措施 反应体系中以反应体系中以dUTPdUTP取代取代dTTPdTTP，加入尿嘧啶糖苷加入尿嘧啶糖苷酶（酶（UNGUNG），），破坏以往的扩增产物破坏以往的扩增产物 每次实验完毕后须用每次实验完毕后须用1 1g/Lg/L次氯酸钠清洁实验台次氯酸钠清洁实验台面，或用面，或用254254nmnm波长的紫外光近距离充分照射波长的紫外光近距离充分照射 四、四、PCRPCR技术的质量控制技术的质量控制3.PCR3.PCR技术的质量保证技术的质量保证 基因扩增检验的全过程的质量保证基因扩增检验的全过程的质量保证 分析前分析
19、前 分析中分析中 分析后分析后 室内质量控制和室间质量评价室内质量控制和室间质量评价四、四、PCRPCR技术的质量控制技术的质量控制第二节第二节 以以PCRPCR为基础的相关技术为基础的相关技术第二节第二节 以以PCRPCR为基础的相关技术为基础的相关技术一、逆转录一、逆转录PCRPCR二、定量二、定量PCRPCR三、多重三、多重PCRPCR四、四、PCRPCR诱导定点突变诱导定点突变五、连接酶链式反应五、连接酶链式反应六、随机扩增多态性六、随机扩增多态性DNADNA一、逆转录一、逆转录PCRPCR（RT-PCRRT-PCR）以细胞内总以细胞内总RNARNA或或mRNAmRNA为材料进行体外扩
20、增为材料进行体外扩增的技术的技术 主要用于克隆主要用于克隆 cDNAcDNA、合成合成cDNAcDNA探针，检测探针，检测RNARNA病毒、分析基因表达等病毒、分析基因表达等逆转录合成逆转录合成cDNAcDNA所用所用的引物：的引物：以以PCRPCR扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物 以以oligo(dT)oligo(dT)作为引物作为引物 以人工合成的随机序列（六核苷酸混合物）作为以人工合成的随机序列（六核苷酸混合物）作为引物引物一、逆转录一、逆转录PCRPCR（RT-PCRRT-PCR）一、逆转录一、逆转录PCRPCR二、定量二、定量PCR(qua
21、ntitative PCR)PCR(quantitative PCR)对对DNADNA或或RNARNA样本的靶序列进行定量分析样本的靶序列进行定量分析 主要用于基因表达的分析、病原体核酸的检测等主要用于基因表达的分析、病原体核酸的检测等 荧光定量荧光定量PCRPCR（fluorescence quantitative fluorescence quantitative PCR,FQ-PCRPCR,FQ-PCR），），又称实时又称实时PCR(real-time PCR)PCR(real-time PCR)FQ-PCRFQ-PCR通过荧光信号对通过荧光信号对PCRPCR过程中的产物量进行过程中的产
22、物量进行实时监测，精确计算出实时监测，精确计算出PCRPCR的初始模板量的初始模板量 二、定量二、定量PCRPCR荧光信号的检测方法荧光信号的检测方法二、定量二、定量PCRPCR1 1.DNA.DNA结合染料技术结合染料技术2 2.水解探针技术水解探针技术3 3.杂交探针技术杂交探针技术4 4.分子信标技术分子信标技术1 1.DNA.DNA结合染料技术结合染料技术 PCRPCR反应体系中加入反应体系中加入SYBR Green ISYBR Green I染料，能选染料，能选择性地掺入至双链择性地掺入至双链DNADNA分子中，并且产生强烈分子中，并且产生强烈荧光荧光 PCRPCR过程中，过程中，S
23、YBR Green ISYBR Green I染料结合到新合成染料结合到新合成的双链的双链DNADNA分子中，结合的荧光信号和分子中，结合的荧光信号和DNADNA含含量成正比量成正比 二、定量二、定量PCRPCR 二、定量二、定量PCRPCR 优点：成本较低，无须对引物或探针进行特殊的优点：成本较低，无须对引物或探针进行特殊的荧光标记，操作亦比较简单荧光标记，操作亦比较简单 缺点：特异性不够，染料分子会结合到非特异性缺点：特异性不够，染料分子会结合到非特异性扩增产生的双链分子和引物二聚体中，使反应体扩增产生的双链分子和引物二聚体中，使反应体系中的荧光本底较高系中的荧光本底较高 二、定量二、定量
24、PCRPCR2.2.水解探针技术技术水解探针技术技术 荧光素标记探针荧光素标记探针 探针的探针的5 5 端和端和3 3 端分别标记荧光报告基团端分别标记荧光报告基团R R和和荧光淬灭基团荧光淬灭基团Q Q 探针完整时探针完整时R R基团与基团与Q Q基团分别位于探针的二基团分别位于探针的二端，端，Q Q基团抑制基团抑制R R基团使其不能发射荧光基团使其不能发射荧光 二、定量二、定量PCRPCR荧光信号检测荧光信号检测 PCR PCR过程中，过程中，Taq DNATaq DNA聚合酶沿模板移动，其聚合酶沿模板移动，其 5 5 33 外切核酸酶活性，可逐个水解脱氧核外切核酸酶活性，可逐个水解脱氧核
25、 苷三磷酸，苷三磷酸，R R基团与基团与Q Q基团随之分离基团随之分离 R R基团不再受基团不再受Q Q基团的抑制便发射荧光，基团的抑制便发射荧光，R R基团信基团信 号强弱的程度与号强弱的程度与PCRPCR反应产物的拷贝数成正比反应产物的拷贝数成正比 二、定量二、定量PCRPCR水水 解解 探探 针针 技技 术术二、定量二、定量PCRPCR二、定量二、定量PCRPCR3 3.杂交探针技术（杂交探针技术（hybridization probehybridization probe）反应反应体系需要体系需要2 2条探针条探针 探针探针A A的的3 3 端标以荧光素作为荧光染料供体；端标以荧光素作
26、为荧光染料供体；探针探针B B的的5 5 端标以另一种染料，作为荧光染料端标以另一种染料，作为荧光染料受体。受体。2 2个探针的序列头尾排列，并且相距仅间隔个探针的序列头尾排列，并且相距仅间隔1 1个个碱基，从而能够进行荧光共振能量的转移碱基，从而能够进行荧光共振能量的转移 二、定量二、定量PCRPCR外来光源首先刺激供体荧光染料，供体便发光外来光源首先刺激供体荧光染料，供体便发光刺激附近的受体荧光染料，使后者再发射出具刺激附近的受体荧光染料，使后者再发射出具另一种波长的信号而被检测系统接收另一种波长的信号而被检测系统接收 受体荧光染料在受体荧光染料在2 2个探针都与模板杂交时才会个探针都与模
27、板杂交时才会被激发而发射荧光信号被激发而发射荧光信号 二、定量二、定量PCRPCR 分子信标是一段荧光素标记的寡核苷酸分子信标是一段荧光素标记的寡核苷酸 环状区环状区(15(153030个核苷酸个核苷酸)柄区柄区(5(58 8个碱基对个碱基对)组成组成 5 5 末端标记荧光基团末端标记荧光基团 3 3 末端标记淬灭基团末端标记淬灭基团4.4.分子信标技术（分子信标技术（molecular beaconmolecular beacon）二、定量二、定量PCRPCR 在自由状态下，分子信标的结构呈发夹状，两在自由状态下，分子信标的结构呈发夹状，两端的基团相距较近，荧光基团将能量转移给淬端的基团相距
28、较近，荧光基团将能量转移给淬灭基团而使荧光淬灭，荧光本底极低灭基团而使荧光淬灭，荧光本底极低 当分子信标与序列互补的靶分子结合时，分子当分子信标与序列互补的靶分子结合时，分子信标的构型发生变化，柄部被打开，从而使荧信标的构型发生变化，柄部被打开，从而使荧光基团远离淬灭基团而发射荧光光基团远离淬灭基团而发射荧光 二、定量二、定量PCRPCR分子信标技术原理分子信标技术原理R二、定量二、定量PCRPCR定量定量 PCRPCR参照系统参照系统二、定量二、定量PCRPCR1.1.外参照系统的设置外参照系统的设置2.2.内参照系统的设置内参照系统的设置1.1.外参照系统外参照系统CtCt值值(cycle
29、 threshold)cycle threshold)扩增曲线与荧光本底基线的交叉点处相应的反应扩增曲线与荧光本底基线的交叉点处相应的反应循环数循环数,即即每个反应管内的荧光信号到达设定的每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数域值时所经历的循环数 CtCt值与模板的起始拷贝数的对数存在线性反比关值与模板的起始拷贝数的对数存在线性反比关系，起始拷贝数越多，系，起始拷贝数越多，CtCt值越小值越小 二、定量二、定量PCRPCR相同模板进行相同模板进行9696次扩增的扩增曲线图次扩增的扩增曲线图二、定量二、定量PCRPCR利用已知起始拷贝数的标利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，横
30、坐准品作出标准曲线，横坐标代表起始拷贝数的对数，标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代纵坐标代CtCt值值 获得未知样品的获得未知样品的CtCt值，即值，即可从标准曲线上计算出该可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数样品的起始拷贝数 二、定量二、定量PCRPCR2.2.内参照系统内参照系统 内标准品内标准品:一段人为地引入了突变序列的靶基一段人为地引入了突变序列的靶基因片段因片段 内标准品加入被检样品中一起抽提、扩增内标准品加入被检样品中一起抽提、扩增 内标准品和靶基因的探针分别用内标准品和靶基因的探针分别用2 2种不同的荧种不同的荧光染料标记，二者探针杂交的序列不同光染料标记，二者探针杂交的序列不
31、同 二、定量二、定量PCRPCR 同一对引物同时扩增靶基因和内标准品，双通道同一对引物同时扩增靶基因和内标准品，双通道荧光检测系统可以特异地同时检测出内标准品和荧光检测系统可以特异地同时检测出内标准品和靶基因的扩增产物，计算出靶基因起始拷贝数靶基因的扩增产物，计算出靶基因起始拷贝数 内参照系统避免了由于不同抽提效率导致的样本内参照系统避免了由于不同抽提效率导致的样本间的差异，使结果的重复性更好，定量更为准确间的差异，使结果的重复性更好，定量更为准确,但仍不能监控内标准品和靶基因是否有一致的扩但仍不能监控内标准品和靶基因是否有一致的扩增效率增效率 二、定量二、定量PCRPCR三、多重三、多重PC
32、R(multiplex PCR)PCR(multiplex PCR)在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增一份在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增一份 DNA DNA样本中多个靶片段样本中多个靶片段四、四、PCRPCR诱导定点突变诱导定点突变1.1.引入点突变引入点突变ABABP2P1PCR用酶用酶A A和和B B消化，将突变位点引入消化，将突变位点引入PCRPCR产物产物2.2.引入大片段缺失引入大片段缺失四、四、PCRPCR诱导定点突变诱导定点突变五、连接酶链反应五、连接酶链反应(LCR(LCR）空隙空隙LCR LCR 引物与模板特异性互补引物与模板特异性互补引物引物A A和和B B之间
33、、之间、a a和和b b之之间有一段空隙间有一段空隙空隙在空隙在DNADNA聚合酶的作聚合酶的作用下特异性延伸用下特异性延伸连接酶连接缺口连接酶连接缺口 六、随机扩增多态性六、随机扩增多态性DNADNA(RAPD)RAPD)RAPDRAPD是一种在整个基因组是一种在整个基因组DNADNA内进行随机扩增而获内进行随机扩增而获得多态性长度得多态性长度DNADNA片段的技术片段的技术 用一条随机序列的引物与模板用一条随机序列的引物与模板DNADNA序列作随机配对，序列作随机配对，反应过程中随机引物只有在与模板反应过程中随机引物只有在与模板DNADNA互补后，在互补后，在足够近的间距足够近的间距(20
34、0(20020002000bp)bp)内、方向相对的两个内、方向相对的两个引物片段之间的模板引物片段之间的模板DNADNA序列才能被扩增序列才能被扩增 六、随机扩增多态性六、随机扩增多态性DNADNA 不同个体不同个体DNADNA序列之间存在差异或发生突变，经扩序列之间存在差异或发生突变，经扩增所得到的产物片段长度会有所不同，经过电泳增所得到的产物片段长度会有所不同，经过电泳分离便可以发现这种差异，从而可了解和比较两分离便可以发现这种差异，从而可了解和比较两个生物体之间基因组个生物体之间基因组DNADNA的结构等信息的结构等信息 随机扩增多态性随机扩增多态性DNADNA六、随机扩增多态性六、随
35、机扩增多态性DNADNARAPDRAPD的应用的应用 种群生物学研究种群生物学研究 基因组基因组DNADNA图谱构建图谱构建 遗传鉴定遗传鉴定 临床致病菌的流行病学检测和分型临床致病菌的流行病学检测和分型 DNADNA指纹鉴定指纹鉴定 六、随机扩增多态性六、随机扩增多态性DNADNA第三节第三节 PCRPCR产物的检测产物的检测第三节第三节 PCRPCR产物的检测产物的检测一、一、PCR-PCR-限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（PCR-RFLPPCR-RFLP）二、等位基因特异性寡核苷酸（二、等位基因特异性寡核苷酸（ASOASO）三、单链构象多态性（三、单链构象多态性（SSCPSS
36、CP）四、变性梯度凝胶电泳（四、变性梯度凝胶电泳（DGGEDGGE）五、融点曲线分析五、融点曲线分析(melting curve analysis)melting curve analysis)六、六、PCRPCR产物的序列分析（产物的序列分析（sequencingsequencing）一、一、PCR-限制性片段长度多态性 PCR-RFLPPCR-RFLP是对是对PCRPCR产物作限制性片段长度多态产物作限制性片段长度多态性分析性分析 根据根据PCRPCR产物的突变序列是否位于限制性内切产物的突变序列是否位于限制性内切酶的酶切位点内而设计酶的酶切位点内而设计 突变点在某一限制性内切酶的酶切位点
37、序列时，突变点在某一限制性内切酶的酶切位点序列时，可在突变点的二侧设计引物，或通过改变引物可在突变点的二侧设计引物，或通过改变引物序列使扩增产物产生（或消失）酶切位点序列使扩增产物产生（或消失）酶切位点 用相应的内切酶对扩增产物进行水解并作电泳用相应的内切酶对扩增产物进行水解并作电泳分离，分离，PCRPCR产物能（或不能）被酶水解而产生产物能（或不能）被酶水解而产生不同长度的片段不同长度的片段 根据水解片段的大小和相应电泳位置可区分野根据水解片段的大小和相应电泳位置可区分野生型和突变型靶基因片段生型和突变型靶基因片段一、一、PCR-限制性片段长度多态性EcoRI 水解水解 A B C A B
38、C一、一、PCR-限制性片段长度多态性二、二、等位基因特异性寡核苷酸 用寡核苷酸探针和用寡核苷酸探针和PCRPCR产物进行杂交检测点突产物进行杂交检测点突变的技术变的技术 被检靶片段经被检靶片段经PCRPCR扩增并经电泳分离后转移到扩增并经电泳分离后转移到膜上，分别与经标记的野生型和突变型靶基膜上，分别与经标记的野生型和突变型靶基因序列的寡核苷酸探针杂交因序列的寡核苷酸探针杂交 PCRPCR产物仅与完全互补的探针进行杂交产物仅与完全互补的探针进行杂交 含突变序列的产物仅与突变探针杂交含突变序列的产物仅与突变探针杂交 根据有无杂交信号判断被检扩增片段根据有无杂交信号判断被检扩增片段中是否带有突变
39、点中是否带有突变点二、二、等位基因特异性寡核苷酸二、二、等位基因特异性寡核苷酸不同顺序不同顺序 不同构象不同构象 不同电泳行为不同电泳行为三、三、单链构象多态性 单链单链DNADNA分子的空间构象，取决于该分子本身分子的空间构象，取决于该分子本身的碱基组成的碱基组成 突变突变DNADNA的的PCRPCR产物经变性后产生与正常产物经变性后产生与正常DNADNA空空间构象不同的两条单链间构象不同的两条单链 不同构象的单链片段具有不同的电泳迁移率，不同构象的单链片段具有不同的电泳迁移率，因而能区别正常与突变的因而能区别正常与突变的DNADNA SSCPSSCP技术检测技术检测DNADNA突变突变三、
40、三、单链构象多态性 DGGEDGGE是一种筛选单碱基突变及多态性的方法是一种筛选单碱基突变及多态性的方法 DNADNA分子被加热至其融点温度时双链被部分解链。分子被加热至其融点温度时双链被部分解链。融点温度取决于融点温度取决于DNADNA分子本身的序列，野生型和突分子本身的序列，野生型和突变型变型DNADNA双链具有不同的融点温度双链具有不同的融点温度 四、四、变性梯度凝胶电泳 设计引物时使被扩增的靶基因片段的二端含设计引物时使被扩增的靶基因片段的二端含有不同的有不同的TmTm值值 将将PCRPCR产物在含有梯度浓度变性剂的聚丙烯酰产物在含有梯度浓度变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中电泳胺凝胶中电泳 当
41、泳动至变性剂相应浓度的位置时，产物片当泳动至变性剂相应浓度的位置时，产物片段中段中TmTm值较低一端的双链被部分解链，使该值较低一端的双链被部分解链，使该片段的电泳迁移率大大降低片段的电泳迁移率大大降低 四、四、变性梯度凝胶电泳 野生序列的野生序列的PCRPCR产物片段与突变序列的产物片段与突变序列的PCRPCR产产物片段的物片段的TmTm不同，它们在电泳过程中被部分不同，它们在电泳过程中被部分解链的先后不同，经过一定时间的电泳后，解链的先后不同，经过一定时间的电泳后，可以发现这些产物片段在凝胶中所处的位置可以发现这些产物片段在凝胶中所处的位置也不同也不同 四、四、变性梯度凝胶电泳ABCABC
42、四、四、变性梯度凝胶电泳五、熔点曲线分析五、熔点曲线分析 DNADNA片段中突变碱基与正常碱基不能配对而形片段中突变碱基与正常碱基不能配对而形成异源双链，所产生的成异源双链，所产生的TmTm较完全配对的同源双较完全配对的同源双链的链的TmTm低，而显示出不同的曲线，从而将突变低，而显示出不同的曲线，从而将突变序列检测出来序列检测出来 根据熔点曲线可判断野生型或突变型根据熔点曲线可判断野生型或突变型DNADNA片段片段五、熔点曲线分析五、熔点曲线分析精品课件精品课件！精品课件精品课件！六、六、PCRPCR产物的序列分析产物的序列分析 主要用于分子克隆时对于目的基因扩增片段主要用于分子克隆时对于目的基因扩增片段的序列鉴定以及对致病基因检测时分析扩增的序列鉴定以及对致病基因检测时分析扩增片段中点突变的位置和性质片段中点突变的位置和性质 测序策略：测序策略：产物纯化后作为模板直接测序产物纯化后作为模板直接测序 将将PCRPCR产物克隆入载体后再测序，后者测序的产物克隆入载体后再测序，后者测序的效果更好效果更好 ，如，如A-TA-T克隆克隆
