1、1 1 植物反应器概述植物反应器概述植物生物反应器定义植物生物反应器定义优点：优点：（1 1）蛋白翻译后正确修饰、加工）蛋白翻译后正确修饰、加工，（2 2）生产成本低）生产成本低，（3 3）生产工艺简单）生产工艺简单，（4 4）存储、使用简单方便）存储、使用简单方便，（5 5）使用安全）使用安全。角质细胞生长因子概述角质细胞生长因子概述（1 1）角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor,KGF)是1989 年由Rubin 等首先从人胚胎肺成纤维细胞的生长培养液中分离出来的。是成纤维细胞生长因子家族的成员之一。（2 2）KGF基因编码一有194 个氨基酸的蛋白质。基
2、因含有三个外显子和两个内含子。（3）KGF是由间充质来源的细胞产生的，通过旁分泌途径特异地作用于上皮细胞。（4 4）KGF具有很强的促上皮细胞分裂的功能。角质细胞生长因子的生物学功能角质细胞生长因子的生物学功能KGFKGF在生长发育中器官的分化、形成中起重要作用在生长发育中器官的分化、形成中起重要作用 1、肺表皮细胞的生长、分化和成型及肺的分支形成中起着重要的作用。2、动物的精囊发生。损伤修复功能及减少化疗的损伤损伤修复功能及减少化疗的损伤1、皮肤损伤修复，2、肠胃损伤的修复，3、减少放化疗的伤害。以胡萝卜、水稻为植物反应器表达KGF的意义首先，具有植物反应器的优点胡萝卜胡萝卜（1 1）营养丰
3、富）营养丰富（2 2）营养保健品营养保健品 食用含食用含KGFKGF的胡萝卜可以辅助治疗肠胃疾病，药敷则的胡萝卜可以辅助治疗肠胃疾病，药敷则可加快皮肤伤口的愈合。因此在胡萝卜中表达高活性的可加快皮肤伤口的愈合。因此在胡萝卜中表达高活性的KGFKGF将具有重要的商业价值将具有重要的商业价值。水稻(1)美容保健品(2)“米疗”在水稻中表达人KGF，这无疑给水稻这位美容新秀更添一“亮点”，即使用萃取的水稻精华及水稻中表达的人KGF可以在对皮肤进行保养的同时加快伤口、疤痕的修复，角质细胞更新。技术流程技术流程 角质细胞生长因子的核苷角质细胞生长因子的核苷酸序列的获得酸序列的获得植物水稻、胡萝卜表植物水
4、稻、胡萝卜表达体系的建立达体系的建立筛选培养基上抗性苗的获得筛选培养基上抗性苗的获得检测检测植物表达载体的构建植物表达载体的构建共培养，筛选出抗性愈伤共培养，筛选出抗性愈伤GUS检测检测PCRPCR检测检测Southern bottingSouthern bottingRT-PCRRT-PCR检检测测Western bottingWestern botting 角质细胞生长因子的核苷酸序列的获得角质细胞生长因子的核苷酸序列的获得 重叠延伸重叠延伸PCRPCR方法获得角质细胞生长因子编码序列方法获得角质细胞生长因子编码序列1 1）重叠延伸）重叠延伸PCRPCR介绍介绍 2 2）外显子外显子2 2
5、、3 3的获得的获得 外显子外显子2 2：2 2号引物：号引物：5-GAAGAATAATTACAATATCATGGAAATCA-3 5-GAAGAATAATTACAATATCATGGAAATCA-3 3 3号引物：号引物：5-TGCATTCTTTCTTTGCATAGAGTTT-3 5-TGCATTCTTTCTTTGCATAGAGTTT-3 外显子外显子3 3：4 4号引物号引物5-CTATGCAAAGAAAGAATGCAATGAA-3 5-CTATGCAAAGAAAGAATGCAATGAA-3 3(3)3(3)引物引物 5-5-GAATTCGAATTCTTAAGTTATTGCCATAGGAAG
6、-3TTAAGTTATTGCCATAGGAAG-3 用人肺组织块提取的用人肺组织块提取的DNADNA为模板，为模板，PCRPCR获得相应的外显子序列。获得相应的外显子序列。外显子外显子1 1的获得的获得1 1号引物号引物 5 5-GATTTCCATGATATTGTAATTATTCTTCA-3-GATTTCCATGATATTGTAATTATTCTTCA-3 5 5-GGC-GGCGGATCCGGATCCTCTAGAATGTGCAATGACATGACTCCAGAGCAAATGGCTACAAATGTGAA-3TCTAGAATGTGCAATGACATGACTCCAGAGCAAATGGCTACAAATG
7、TGAA-3 5 5-TCCATGTAATCATAACTTCTTGTGTGTCGCTCAGGGCTGGAACAGTTCACATTTGTAGC-3-TCCATGTAATCATAACTTCTTGTGTGTCGCTCAGGGCTGGAACAGTTCACATTTGTAGC-3 5 5-ATGATTACATGGAAGGAGGGGATATAAGAGTGAGAAGACTCTTCTGTCGAACACAGTGG-3-ATGATTACATGGAAGGAGGGGATATAAGAGTGAGAAGACTCTTCTGTCGAACACAGTGG-3 5 5-GGGTCCCTTTTACTTTGCCTCTTTTATCGATCC
8、TCAGGTACCACTGTGTTCGACAG-3-GGGTCCCTTTTACTTTGCCTCTTTTATCGATCCTCAGGTACCACTGTGTTCGACAG-3 5 5-CAAAGTAAAAGGGACCCAAGAGATGAAGAATAATTACAATATCATGGAAATCAGGAC-3-CAAAGTAAAAGGGACCCAAGAGATGAAGAATAATTACAATATCATGGAAATCAGGAC-3 图图1、外显子、外显子1核苷酸获得图示核苷酸获得图示 KGF KGF全长的获得图全长的获得图图图2 KGF2 KGF序列获得图示序列获得图示 KGFKGF三段外显子及全长的凝胶电泳图
9、三段外显子及全长的凝胶电泳图图图3 3、PCRPCR产物凝胶电泳图产物凝胶电泳图M DNA marker DL2 000M DNA marker DL2 0001 1 外显子外显子1,2 1,2 外显子外显子2,3 2,3 外显子外显子3 3 4 4 阴性对照阴性对照 图图4 4、KGFKGF核苷酸凝胶电泳图核苷酸凝胶电泳图M M、DNA marker DL2000,DNA marker DL2000,1 1、KGFKGF片段片段 外显子外显子1 1为为193bp193bp的核苷酸片断的核苷酸片断 ，外显子，外显子2 2为为104bp104bp的核苷酸的核苷酸片断，外显子片断，外显子3 3为为
10、192bp192bp的核苷酸片断的核苷酸片断 ，总长为，总长为500 bp500 bp左右。左右。经凝胶电泳后，与预期的大小一致。经凝胶电泳后，与预期的大小一致。获得序列的测序结果获得序列的测序结果 BamH I Xbal I EcoR IGGATCCGGATCCTCTAGAGATTGAATTCGAATTCTTAAGTTATTGCCATAGGAAGAAAGTGGGCCGTTTTTTGTTCTTTCTTCGTTTTCTTCCCTTTGACAGGAAGCCCCTTTTGATTTAAGGCCACGAACATTTCCCCTCCGCTGTGTGTCCATTTAGCTGATGCATAGGTGTTGTAAT
11、GGTTTTCCAGAATCAGTTCTTTGAAGTTGCAATCTTCATTGCATTCTTTCTTTGCATAGAGTTTCCCTTCTTTGTTCATGGCAAGATAGTATTCACTTTCCACCCCTTTGATTGCCACAATTCCAACTGCCACAGTCCTGATTTCCATGATATTGTAATTATTCTTCATCTCTTGGGTCCCTTTTACTTTGCCTCTTTTATCGATCCTCAGGTACCACTGTGTTCGACAGAAGAGTCTTCTCACTCTTATATCCCCTCCTTCCATGTAATCATAACTTCTTGTGTGTCGCTCAGGGCTGG
12、AACAGTTCACATTTGTAGCCATTTGCTCTGGAGTCATGTCATTGCAAGCCATTCTCTAGATAGAGGATCCGGATCC Xbal I BamH I 测序得到的序列提交测序得到的序列提交genbankgenbank比对，核苷酸的同源性达比对，核苷酸的同源性达96.096.0。将翻译后的蛋白序列提交将翻译后的蛋白序列提交genbankgenbank比对，蛋白质同源性达比对，蛋白质同源性达98.898.8。核苷酸比对结果：核苷酸比对结果：蛋白比对结果：蛋白比对结果：将所获得的将所获得的KGFKGF核苷酸编码序列与核苷酸编码序列与GenbankGenbank中已有的中
13、已有的KGFKGF核苷酸序列比对，核苷酸序核苷酸序列比对，核苷酸序列同源性达列同源性达96.0%96.0%（其中外显子（其中外显子1 1为为100%100%同源，差异都位于外显子同源，差异都位于外显子2 2和外显子和外显子3 3中）。由于中）。由于外显子外显子1 1根据根据genbankgenbank序列设计，因而外显子序列设计，因而外显子1 1与与genbankgenbank上的数据上的数据100%100%同源同源,同时这也说同时这也说明了在本实验延伸明了在本实验延伸PCRPCR的过程并不存在碱基的突变，或碱基突变的频率比较低。而外显的过程并不存在碱基的突变，或碱基突变的频率比较低。而外显子
14、子2 2、外显子、外显子3 3与与genbankgenbank的差异推测为人种间的差异。氨基酸序列比对，同源性达的差异推测为人种间的差异。氨基酸序列比对，同源性达98.8%98.8%。成熟肽的第成熟肽的第122-132122-132个氨基酸之间是个氨基酸之间是KGFKGF的受体特异性结合位点，在此位点无氨基酸位点的受体特异性结合位点，在此位点无氨基酸位点突变。蛋白比对结果显示第突变。蛋白比对结果显示第3636、4040、4343位点存在差异，但研究发现成熟肽的前位点存在差异，但研究发现成熟肽的前1919个氨基个氨基酸丢失并不会影响成熟肽的活性，因此这些位点的差异不会影响蛋白的活性、功能。酸丢失
15、并不会影响成熟肽的活性，因此这些位点的差异不会影响蛋白的活性、功能。植物表达载体的构建植物表达载体的构建中间载体中间载体pBPF7-KGFpBPF7-KGF的构建的构建 pBPF7 pBPF7中含有中含有CaMV35sCaMV35s启动子及启动子及NOSNOS终止子，将终止子，将KGFKGF编码序列插入编码序列插入CAMV35sCAMV35s启动子启动子与与NOSNOS终止子之间（命名终止子之间（命名CAMV35s-KGF-NOSCAMV35s-KGF-NOS），将使人），将使人KGFKGF基因能在植物中表达基因能在植物中表达。载体载体pBI1301-KGFpBI1301-KGF的构建的构建
16、将中间载体将中间载体pBPF7-KGF pBPF7-KGF 经经PstPst酶切后，回收酶切后，回收CAMV35s-KGF-NOSCAMV35s-KGF-NOS片段。同时，片段。同时，将载体将载体pBI1301pBI1301用用PstPst酶切、去磷酸化后回收。将两回收片段连接，转化大肠酶切、去磷酸化后回收。将两回收片段连接，转化大肠杆菌杆菌 质粒构建如下图质粒构建如下图 质粒构建鉴定结果质粒构建鉴定结果图图5 5 质粒质粒pMD18-T-KGFpMD18-T-KGF阳性克隆酶阳性克隆酶切鉴定图切鉴定图M DNA marker DL 2 000 M DNA marker DL 2 000 1
17、pMD18-T-KGF/1 pMD18-T-KGF/BamBamHIHI酶切酶切图图6 6 质粒质粒pBI1301-KGF PCRpBI1301-KGF PCR鉴定凝胶电泳图鉴定凝胶电泳图1 pBI1301-KGF PCR1 pBI1301-KGF PCR鉴定结果鉴定结果M DNA marker DL 2 000M DNA marker DL 2 000 图图7 7质粒质粒pBI1301-KGFpBI1301-KGF阳性克隆酶切鉴定图阳性克隆酶切鉴定图1 pBI1301-KGF/1 pBI1301-KGF/EcoEcoRR和和BamBamHH双酶切双酶切M DNA marker DL 2 00
18、0+15 000 M DNA marker DL 2 000+15 000 图图5 5、6 6、7 7的鉴定图都可以看到的鉴定图都可以看到500 bp500 bp左右的左右的KGFKGF目的条带。同时目的条带。同时图图7 7中有一中有一1500 bp1500 bp左右的条带，为左右的条带，为CAMV35sCAMV35s片段。图片段。图7 7的酶切结果的酶切结果与预期结果相同，说明与预期结果相同，说明CAMV35s-KGF-NOSCAMV35s-KGF-NOS已经连接于已经连接于pBI1301pBI1301。将。将质粒质粒pBI 1301-KGFpBI 1301-KGF转化农杆菌转化农杆菌EHA
19、105EHA105，获得植物侵染菌株。，获得植物侵染菌株。植物水稻、胡萝卜表达体系的建立植物水稻、胡萝卜表达体系的建立1 1、日本晴培养基：、日本晴培养基：1 1）诱导培养基）诱导培养基MBMB（MSMS的大量元素、铁盐、肌醇加的大量元素、铁盐、肌醇加B5B5的微量元素、维生素）的微量元素、维生素）+2,4-D 2mg/L+2,4-D 2mg/L；2 2）继代培养基）继代培养基MB+2,4-D 2 mg/LMB+2,4-D 2 mg/L；3 3）共培养培养基）共培养培养基 MS+2,4-D 4 mg/L+AS MS+2,4-D 4 mg/L+AS；4 4）筛选培养基）筛选培养基NBNB（N6N
20、6的大量元素、铁盐、肌醇加的大量元素、铁盐、肌醇加B5B5的微量元素、维生素）的微量元素、维生素）+2,4-D 2 mg/L+Cb500 mg/L+Hyg100 mg/L+2,4-D 2 mg/L+Cb500 mg/L+Hyg100 mg/L；5 5）预分化培养基）预分化培养基NB+ABA 2 mg/L+6-BA 3 mg/L+NAA 1 mg/L+Cb 250 mg/L NB+ABA 2 mg/L+6-BA 3 mg/L+NAA 1 mg/L+Cb 250 mg/L+Hyg 25 mg/L+Hyg 25 mg/L；6 6）分化培养基）分化培养基NB+6-BA 3 mg/L+NAA 1 mg/
21、L+Sorbitol 13 g/L+Cb 250 mg/L NB+6-BA 3 mg/L+NAA 1 mg/L+Sorbitol 13 g/L+Cb 250 mg/L+Hyg 25 mg/L+Hyg 25 mg/L 2 2、胡萝卜培养基、胡萝卜培养基1 1）诱导愈伤（继代）培养基）诱导愈伤（继代）培养基MS+2,4-D 0.1 mg/LMS+2,4-D 0.1 mg/L2 2）共培养基）共培养基MS+2,4-D 0.1 mg/L+As 50 mmol/MS+2,4-D 0.1 mg/L+As 50 mmol/3)3)筛选培养基筛选培养基MS+2,4-D 0.1 mg/L+Hyg 40mg/L+
22、Cb 300 mg/LMS+2,4-D 0.1 mg/L+Hyg 40mg/L+Cb 300 mg/L4)4)诱导胚状体培养基诱导胚状体培养基MS+2,4-D 0.001 mg/L+Hyg 20 mg/L+Cb 100 mg/LMS+2,4-D 0.001 mg/L+Hyg 20 mg/L+Cb 100 mg/L5)5)分化培养基分化培养基MS+Hyg 40 mg/L+Cb 100 mg/MS+Hyg 40 mg/L+Cb 100 mg/6)6)生根壮苗培养基生根壮苗培养基1/2 MS+NAA 0.2 mg/L 1/2 MS+NAA 0.2 mg/L 水稻及胡萝卜愈伤的诱导水稻及胡萝卜愈伤的诱
23、导AB图图8 8 水稻及胡萝卜胚性愈伤水稻及胡萝卜胚性愈伤A A、水稻胚性愈伤、水稻胚性愈伤:水稻幼胚在诱导培养基诱导水稻幼胚在诱导培养基诱导4 4天后长出约天后长出约1cm1cm芽芽,芽的基部出现颗粒状的愈伤组织。将芽从芽的基部出现颗粒状的愈伤组织。将芽从基部掐出基部掐出,将剩余的颗粒状的愈伤接种至新愈伤诱导培养基中将剩余的颗粒状的愈伤接种至新愈伤诱导培养基中,2,2周后周后,愈伤长至直径愈伤长至直径0.50.51.0 1.0 cm,cm,呈现淡黄色呈现淡黄色,半松散状颗粒半松散状颗粒,可用作遗传转化可用作遗传转化 B B、胡萝卜胚性愈伤、胡萝卜胚性愈伤:将胡萝卜韧皮部切块、消毒后接种于愈伤
24、诱导培养基中，二周后在红色的韧皮部组织块上将胡萝卜韧皮部切块、消毒后接种于愈伤诱导培养基中，二周后在红色的韧皮部组织块上长出淡绿色的愈伤组织块。将愈伤组织块掐下接种于新的愈伤诱导培养基中培养二周后即可用长出淡绿色的愈伤组织块。将愈伤组织块掐下接种于新的愈伤诱导培养基中培养二周后即可用作遗传转化作遗传转化 农杆菌介导的遗传转化农杆菌介导的遗传转化1 1）农杆菌的培养）农杆菌的培养 吸取吸取2020保存的甘油菌于保存的甘油菌于15 mL LB15 mL LB（含（含Kan 50 g/mLKan 50 g/mL）液体培养基中，）液体培养基中，2828振振荡荡32 h32 h，吸取，吸取150 L15
25、0 L农杆菌液涂农杆菌液涂LBLB（含（含Kan 50 g/mLKan 50 g/mL）平板，）平板，2828培养培养2-3 d2-3 d。2 2）农杆菌感染愈伤组织块）农杆菌感染愈伤组织块将培养了将培养了2-32-3天的农杆菌用共培养液体培养基悬浮，将愈伤组织浸泡在菌液中，并天的农杆菌用共培养液体培养基悬浮，将愈伤组织浸泡在菌液中，并在菌液中加入在菌液中加入ASAS至浓度为至浓度为100M100M。于摇床中缓慢摇动。于摇床中缓慢摇动15 min15 min。3 3）农杆菌与愈伤组织块共培养）农杆菌与愈伤组织块共培养将愈伤组织块从菌液中取出，置于无菌滤纸上吸干，而后移入共培养基中，在培将愈伤组
26、织块从菌液中取出，置于无菌滤纸上吸干，而后移入共培养基中，在培养基表面铺一张无菌滤纸。养基表面铺一张无菌滤纸。4 4）抗性愈伤组织的筛选）抗性愈伤组织的筛选共培养共培养2-3 d2-3 d后，再把愈伤组织块移到筛选培养基上，后，再把愈伤组织块移到筛选培养基上，2 2周继代一次，继代周继代一次，继代2 2次。次。5 5）预分化（水稻）预分化（水稻）挑选直径挑选直径1-2 mm1-2 mm生长良好、结构致密的抗性愈伤组织转移入预分化培养基中，生长良好、结构致密的抗性愈伤组织转移入预分化培养基中，2525，12 h12 h光照培养，预分化时间一般为光照培养，预分化时间一般为2 2周。周。6 6）分化
27、及再生培养）分化及再生培养将预分化后的抗性愈伤组织转移至分化培养基上进行分化培养，待再生出小苗，将预分化后的抗性愈伤组织转移至分化培养基上进行分化培养，待再生出小苗，转移至水中培养两周后，移栽到土里。转移至水中培养两周后，移栽到土里。抗性愈伤的筛选抗性愈伤的筛选 水稻：经过水稻：经过1 1周的筛选培养，愈伤褐化。而后，再经过周的筛选培养，愈伤褐化。而后，再经过4-54-5天，天，褐化的组织上长出淡乳白色，略透明，生长相对旺盛的抗性褐化的组织上长出淡乳白色，略透明，生长相对旺盛的抗性愈伤。愈伤。胡萝卜：经过大约为胡萝卜：经过大约为2 2周的筛选，愈伤褐化。而后，再经过周的筛选，愈伤褐化。而后，再
28、经过1 1周，褐化的组织上长出淡绿色，略透亮，生长相对旺盛的抗周，褐化的组织上长出淡绿色，略透亮，生长相对旺盛的抗性愈伤。性愈伤。筛选培养基上抗性苗的产生筛选培养基上抗性苗的产生 A A、水稻抗性苗、水稻抗性苗 ：抗性愈伤在筛选培养基中长大至直径为：抗性愈伤在筛选培养基中长大至直径为5 mm5 mm时移至预分化培养基中，时移至预分化培养基中，一周后可以看到愈伤上有绿点产生。抗性愈伤于预分化培养基培养一周后可以看到愈伤上有绿点产生。抗性愈伤于预分化培养基培养2 2周后移至分化培养周后移至分化培养基中，在分化培养基中二周后，每个愈伤长出基中，在分化培养基中二周后，每个愈伤长出1 14 4棵小苗棵小
29、苗 B、胡萝卜抗性苗胡萝卜抗性苗 ：抗性愈伤转至新的筛选培养基中继续培养，待抗性愈伤长大至直：抗性愈伤转至新的筛选培养基中继续培养，待抗性愈伤长大至直径为径为5 mm5 mm时移至分化培养基中。抗性愈伤于分化培养基中光照培养后，愈伤变为绿色，时移至分化培养基中。抗性愈伤于分化培养基中光照培养后，愈伤变为绿色，一周后有深绿色的芽点长出。再经过二周后长大成苗一周后有深绿色的芽点长出。再经过二周后长大成苗 AAB图图10 10 GUSGUS基因在水稻转化体中瞬时表达基因在水稻转化体中瞬时表达A A、为共培养后的、为共培养后的GUSGUS检测图检测图B B、未转化的阴性对照、未转化的阴性对照AB图图1
30、111 GUS GUS基因在胡萝卜转化体中瞬时表达基因在胡萝卜转化体中瞬时表达A A、为共培养后的、为共培养后的GUSGUS检测图检测图B B、未转化的阴性对照、未转化的阴性对照 在转化共培养后（在转化共培养后（3 d3 d）检测）检测GUSGUS基因的表达，愈伤组织染色基因的表达，愈伤组织染色后呈现蓝色（图后呈现蓝色（图1010、图、图1111），而未转化的愈伤组织无蓝色出现，），而未转化的愈伤组织无蓝色出现，表明外源基因片断在植物的愈伤组织细胞中得到瞬时表达。表明外源基因片断在植物的愈伤组织细胞中得到瞬时表达。7 7、2 2 GUSGUS基因在抗性植株中的表达检测基因在抗性植株中的表达检测
31、 ABCD图图12 12 GUSGUS基因在水稻及胡萝卜再生基因在水稻及胡萝卜再生植株中稳定表达植株中稳定表达A A、GUSGUS基因在水稻再生植株叶片中稳定表达基因在水稻再生植株叶片中稳定表达B B、GUSGUS基因在水稻再生植株根中稳定表达基因在水稻再生植株根中稳定表达C C、GUSGUS基因在胡萝卜再生根中稳定表达基因在胡萝卜再生根中稳定表达D D、GUSGUS基因在胡萝卜再生植株叶片中稳定表达基因在胡萝卜再生植株叶片中稳定表达再生植株中叶片经组织化再生植株中叶片经组织化学染色后可见蓝色学染色后可见蓝色,说明说明GUSGUS基因在植株中稳定表达基因在植株中稳定表达 PCRPCR检测检测
32、AB图图13 13 部分水稻及胡萝卜再生植株的部分水稻及胡萝卜再生植株的PCRPCR检测结果检测结果A 1:A 1:未转化的再生植株未转化的再生植株;210:210:转化的再生植株编号转化的再生植株编号KA1KA9;11:KA1KA9;11:空白对照空白对照;12:;12:阳性对照阳性对照;B 1B 1：未转化的再生植株：未转化的再生植株;2 29:9:转化再生植株编号转化再生植株编号HK1HK1HK8;10:HK8;10:阳性对照阳性对照;11:DNA Maker 2 000 11:DNA Maker 2 000 取转化的水稻及胡萝卜植株叶片提取总取转化的水稻及胡萝卜植株叶片提取总DNADN
33、A，以总，以总DNADNA为模板进行为模板进行PCRPCR扩增，未转扩增，未转化的植株化的植株DNADNA为阴性对照模板为阴性对照模板,结果如图结果如图1313转化的水稻植株转化的水稻植株KA3KA3、KA4KA4、KA5KA5、KA6KA6、KA8 PCRKA8 PCR检测出现检测出现 500bp 500bp左右的目的带，阴性对照没有出现相应的带。转化的胡萝左右的目的带，阴性对照没有出现相应的带。转化的胡萝卜植株卜植株HK1HK1、HK3HK3、HK7 PCRHK7 PCR检测出现检测出现500bp500bp左右目的带，阴性对照没有出现相应的带。左右目的带，阴性对照没有出现相应的带。说明说明
34、 KGF KGF核苷酸序列经转化整合到水稻及胡萝卜的染色体组中。核苷酸序列经转化整合到水稻及胡萝卜的染色体组中。斑点杂交检测斑点杂交检测AB图图14 14 部分水稻再生植株的斑点杂交检测结果部分水稻再生植株的斑点杂交检测结果A A 水稻水稻 1 17:7:转化再生植株编号转化再生植株编号KA1KA1、KA3KA3、KA4KA4、KA5KA5、KA6KA6、KA8KA8、KA11KA11 8 8：未转化的再生植株：未转化的再生植株 9 9：阳性对照（质粒：阳性对照（质粒pMD18-T-KGFpMD18-T-KGF）B B 胡萝卜胡萝卜 1 1：阳性对照（质粒：阳性对照（质粒pMD18-T-KGF
35、pMD18-T-KGF）2 24:4:转化再生植株编号转化再生植株编号HK1HK1、HK3HK3、HK7HK7 5 5：未转化的再生植株：未转化的再生植株 取转基因植株的叶片提取总取转基因植株的叶片提取总DNADNA，进行斑点杂交。结果显示部分再生植株的，进行斑点杂交。结果显示部分再生植株的DNADNA与与地高辛标记的探针结合，在底片的显影中呈现黑色斑点（图地高辛标记的探针结合，在底片的显影中呈现黑色斑点（图14)14)，进一步证实了，进一步证实了PCRPCR检测结果的可靠性。检测结果的可靠性。反转录反转录PCRPCR检测检测AB图图15 15 部分水稻及胡萝卜再生植株的部分水稻及胡萝卜再生植
36、株的RT-PCRRT-PCR检测结果检测结果A A 水稻水稻 1:1:阴性对照阴性对照(未转化植株未转化植株cDNAcDNA为模板为模板)2 25:5:转化再生植株编号转化再生植株编号KA3KA3、KA4KA4、KA5KA5、KA6 cDNAKA6 cDNA为模板为模板 6:DNA maker DL 2 000 6:DNA maker DL 2 000 B B 胡萝卜胡萝卜 1:1:阴性对照阴性对照(未转化植株未转化植株cDNAcDNA为模板为模板)2 25:5:转化再生植株编号转化再生植株编号HK1HK1、HK3HK3、HK5HK5、HK7 cDNAHK7 cDNA为模板为模板 6:DNA
37、maker DL 2 000 6:DNA maker DL 2 000 提取再生植株的总提取再生植株的总RNARNA，经反转录反应合成，经反转录反应合成cDNAcDNA，cDNA cDNA作为反应模板，扩增出长度作为反应模板，扩增出长度约为约为500 bp500 bp的清晰条带，而阴性对照（未转化植株）没有相应的扩增条带（图的清晰条带，而阴性对照（未转化植株）没有相应的扩增条带（图1515）。）。说明目的基因已在转化植株中正常转录。说明目的基因已在转化植株中正常转录。Western blotting Western blotting 检测结果检测结果 图图16 16 水稻再生植株的水稻再生植株
38、的western botting western botting 检测结果检测结果1:1:再生植株再生植株KA3;2:KA3;2:再生植株再生植株KA4;3KA4;3再生植株再生植株KA5;4:KA5;4:再生植株再生植株KA6;5:KA6;5:未转未转化植株化植株 综合以上对部分的水稻再生植株的综合以上对部分的水稻再生植株的southern blottingsouthern blotting、RT-PCRRT-PCR及及western bottingwestern botting检测的结果，可以看到水稻植株检测的结果，可以看到水稻植株KA4KA4及植株及植株KA6KA6表达了转基因蛋白人角质细胞生长因子。胡表达了转基因蛋白人角质细胞生长因子。胡萝卜植株萝卜植株HK1HK1、HK5HK5、HK7HK7中人中人KGFKGF基因得以转录。基因得以转录。
