1、流式细胞仪流式细胞仪上海交通大学医学院丁磊 副教授 FCMFCM是以流式细胞仪为检测手段的一项是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的技术多参数定量分析和分选的技术。FALS SensorLaser 单细胞的流动的单细胞的流动的 活细胞的活细胞的 定量的定量的 多参数的多参数的 高统计学精度的高统计学精度的 分选细胞分选细胞一、一、流式细胞仪的分析及分选原理流式细胞仪的分析及分选原理二、二、数据的显示与分析数据的显示与分析三、三、流式细胞仪分析的技术要求流式细胞仪分析的技术要求四、四、流式细胞术应用流式细胞术应
2、用 一一 工作原理：工作原理：FCMFCM是一种在计算机技术支持下的高度是一种在计算机技术支持下的高度自动化的细胞显微荧光脉冲分光光度仪。自动化的细胞显微荧光脉冲分光光度仪。流式细胞仪的分析及分选原理流式细胞仪的分析及分选原理 1 1、液流系统、液流系统 样品流和鞘流样品流和鞘流 2 2、光学系统、光学系统 激光激光、透镜组、透镜组、光电倍增管等。光电倍增管等。3 3、数据处理系统数据处理系统(一）一）基本组成结构基本组成结构Injector TipSheath fluid样品流和鞘流样品流和鞘流1 1、液流系统、液流系统流动室流动室Laser Flow Cell孔径孔径50-20050-20
3、0 m m 检测区离喷口检测区离喷口200200 m m有分选功能有分选功能 液流驱动系统液流驱动系统（示意图）（示意图）流速与压力的关系服从流速与压力的关系服从BernoulliBernoulli方程，即方程，即 P=(1/2)P=(1/2)V V2 2 (忽略高度的变化忽略高度的变化)。改变气压。改变气压,就可获得不同的流速。就可获得不同的流速。PMTPMTPMTPMTDichroicFiltersBandpassFiltersLaser 1234Flow cell 激光激光、透镜组、光电倍增管等。、透镜组、光电倍增管等。2 2、光学系统、光学系统 E0E0E0E1E1E1 吸收吸收自发辐
4、射自发辐射受激辐射受激辐射hvhvhvhvhv 当物质受到强烈激励当物质受到强烈激励,使某一能级的粒子数大量积聚使某一能级的粒子数大量积聚,发生粒子数反分布发生粒子数反分布.如有光束入射如有光束入射,入射光子与粒子发生入射光子与粒子发生完全弹性碰撞完全弹性碰撞,使粒子从激发态跃迁到基态同时发生一使粒子从激发态跃迁到基态同时发生一个光子个光子.光子的能量与入射光子能量相同光子的能量与入射光子能量相同,有一致的方向有一致的方向和恒定的位相关系和恒定的位相关系,这种发射称受激发射这种发射称受激发射.球透镜和柱面透镜球透镜和柱面透镜：20200 m 椭圆形光，短轴和细胞流平行，长椭圆形光，短轴和细胞流
5、平行，长长轴与细胞流垂直。长轴与细胞流垂直。光束成形与细胞受照方式光束成形与细胞受照方式 激发光焦斑这种椭圆形光斑的这种椭圆形光斑的检测区保证每个细检测区保证每个细胞分别受到光照胞分别受到光照且受检时受到一致且受检时受到一致的光照的光照 光束成形与细胞受照方式光束成形与细胞受照方式（二）（二）基本工作原理基本工作原理单细胞流：流动室单细胞流：流动室单细胞照明：激光单细胞照明：激光488 nm laser488 nm laser单细胞检测：信号处理单细胞检测：信号处理（一）前向散射光（一）前向散射光 (foword(foword scatter)scatter)：FSCFSC 信号的强弱与细胞的
6、大小相关信号的强弱与细胞的大小相关（二）侧向散射光（二）侧向散射光（side scatter)side scatter)：SSCSSC 信号的强弱与细胞内的颗粒多少相关信号的强弱与细胞内的颗粒多少相关二二 散射光的测定散射光的测定FALS SensorLaserForward Angle Light Scatter细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.90 Degree Light ScatterFALS Sensor90LS SensorLaser细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.前向散色光前向散色光FSCFSC侧向
7、散色光侧向散色光SSCSSC 利用前向角和利用前向角和测向角散射光可测向角散射光可以把外周血白细以把外周血白细胞分成三群，淋胞分成三群，淋巴细胞、单核巴细胞、单核细胞和粒细胞。细胞和粒细胞。散射光的测定散射光的测定 荧光检测器检测特定荧光的特定发射波长荧光检测器检测特定荧光的特定发射波长（一）光信号测量（一）光信号测量 线性放大器线性放大器 对数放大器对数放大器三三 荧光测量荧光测量600 nm300 nm500 nm700 nm400 nm457350514610 632488Common Laser LinesExcitationEmisson300 nm 400 nm 500 nm 60
8、0 nm 700 nm（二）荧光补偿（二）荧光补偿 利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻荧光通道的信号加以扣除的技术称荧光通道的信号加以扣除的技术称“荧光补偿荧光补偿”荧光补荧光补偿偿（一）分选的基本原理（一）分选的基本原理488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector四四 细胞分选原理细胞分选原理阳性选择阳性选择MACS-Magnetic Cell Sorting MACS-Magnetic Cell Sor
9、ting 磁珠磁珠分离分离阴性选择阴性选择1 1、分选速度：几千个细胞分选速度：几千个细胞/秒秒2 2、分选纯度分选纯度:99.5%:99.5%左右左右3 3、分选收获率分选收获率:90-95%:90-95%4 4、分选得率分选得率（二）分选的技术要求（二）分选的技术要求 分选纯度分选纯度 是指分离后的样品中该亚群细胞是指分离后的样品中该亚群细胞所占的百分比所占的百分比。分选收获率分选收获率 是指分离后所得的细胞亚群数占原是指分离后所得的细胞亚群数占原细胞样品中该亚群细胞数的百分比。细胞样品中该亚群细胞数的百分比。数据的显示和分析数据的显示和分析 一、参数一、参数前向散射光前向散射光FS:FS
10、:反映颗粒的大小反映颗粒的大小侧向侧向散射光散射光SS:SS:细胞内部结构复杂程度细胞内部结构复杂程度荧光荧光FL:FL:细胞被染上荧光部分数量的多少细胞被染上荧光部分数量的多少二二、数据的显示方式数据的显示方式（一）（一）单参数直方图显示单参数直方图显示（二）（二）双参数显示双参数显示（三）（三）三参数显示三参数显示 以分布直方图以分布直方图(distribution histogram)(distribution histogram)来显示，横轴为该参数测量强度相对值，单位是来显示，横轴为该参数测量强度相对值，单位是道数。强度分布可以是线性的，也可以是对数的。道数。强度分布可以是线性的，也
11、可以是对数的。纵轴一般是细胞数或细胞出现的频数纵轴一般是细胞数或细胞出现的频数。(一一)单参数直方图的显示单参数直方图的显示Single-Parameter Histogram DisplaysX轴表示绿荧光信号轴表示绿荧光信号(CD3)强弱强弱,Y轴则反应细胞的数量轴则反应细胞的数量.(二二)双参数数据的显示双参数数据的显示Two-Parameter Data Displays 细胞双参数测定不仅能提供二个参数各自与细细胞双参数测定不仅能提供二个参数各自与细胞数量的关系，更重要的是获得了这二个参数之胞数量的关系，更重要的是获得了这二个参数之间的相关关系，其中包含了更多的生物学信息。间的相关关
12、系，其中包含了更多的生物学信息。双参数数据显示最常用的是二维的散点图双参数数据显示最常用的是二维的散点图(Dot(Dot Plot)Plot)。在二维图上，横轴代表第一个测量参数，。在二维图上，横轴代表第一个测量参数，纵轴代表第二个测量参数。纵轴代表第二个测量参数。纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数参数,在图中每一个点代表一个细胞在图中每一个点代表一个细胞1 1、点图、点图双参数点图双参数点图双参数点图双参数点图 用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相同，不同的等高线上细胞数不同。同，不同的等高线上细胞
13、数不同。2、二维等高图、二维等高图 纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数数,Z,Z轴为细胞数。轴为细胞数。3、假三维等高图、假三维等高图 三维坐标匀为参数（散射光或荧光）而三维坐标匀为参数（散射光或荧光）而非细胞数。非细胞数。(三三)三参数直方图三参数直方图 一般利用所得参数的两两组合并利用设门（一般利用所得参数的两两组合并利用设门（Gate)技术，来分析参数之间的相互关系。技术，来分析参数之间的相互关系。（四）流式细胞仪的多参数分析（四）流式细胞仪的多参数分析1、RegionRegion设置设置2、设置设置Gate 样品制备：单细胞悬液样品制备：单细
14、胞悬液 特定荧光染料的选择：光谱重叠特定荧光染料的选择：光谱重叠 阴性对照的设置阴性对照的设置:检测标本的重复性检测标本的重复性 质量控制质量控制流式细胞仪免疫分析的技术要求流式细胞仪免疫分析的技术要求 细胞碎片细胞碎片 细胞团块细胞团块 离心漂洗离心漂洗 固定剂固定剂一一、免疫检测样品制备、免疫检测样品制备 淋巴细胞分离液分离外周血中单个核细胞。淋巴细胞分离液分离外周血中单个核细胞。Ficoll,40kdFicoll,40kd，高密度，低渗透压，无毒性。，高密度，低渗透压，无毒性。（比重为（比重为1.01771.01770.0010.001的分层液的分层液).).（一）外周血淋巴细胞样品的制
15、备（一）外周血淋巴细胞样品的制备 利用红细胞裂解液去除红细胞后，得到外周血利用红细胞裂解液去除红细胞后，得到外周血中所有白细胞的流式细胞分析的二维散色光点图中所有白细胞的流式细胞分析的二维散色光点图 单层培养细胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法单层培养细胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法使细胞从培养皿上消化下来，然后离心漂洗。使细胞从培养皿上消化下来，然后离心漂洗。悬浮培养细胞，可不用酶消化，直接吹打制备悬浮培养细胞，可不用酶消化，直接吹打制备成单细胞悬液。成单细胞悬液。（二（二)培养细胞的样品制备培养细胞的样品制备 机械法：剪碎法、网搓法、研磨法。机械法：剪碎法、网搓法、研磨法。酶处理法：胃蛋白酶、
16、胰蛋白酶、胶原酶等。酶处理法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶等。化学试剂处理法：化学试剂处理法：EDTA、EGTA等。等。表面活性剂处理法：表面活性剂处理法：Triton-x100、皂素等、皂素等。机械法往往常成严重的细胞损伤，而结果却是机械法往往常成严重的细胞损伤，而结果却是较低的细胞产量。较低的细胞产量。如用低速离心去碎片，用尼龙网过滤团块等，如用低速离心去碎片，用尼龙网过滤团块等，也可利用电子学技术处理的方法排除团块和碎片也可利用电子学技术处理的方法排除团块和碎片的干扰。的干扰。酶学法、化学法对实体组织的分散效果较理想，酶学法、化学法对实体组织的分散效果较理想，但会造成所测化学成份的不良影响
17、。但会造成所测化学成份的不良影响。FCMFCM所测细胞所测细胞是单个分散状态；对细胞团块，细胞碎片尽可能是单个分散状态；对细胞团块，细胞碎片尽可能少；细胞的活性不受损害，以保证下一步的荧光少；细胞的活性不受损害，以保证下一步的荧光染色处理不受影响。染色处理不受影响。防止细胞自溶，保持细胞膜原有的特性保存的方法：防止细胞自溶，保持细胞膜原有的特性保存的方法：1 1、深低温保存法：深低温冰箱，保存一年。、深低温保存法：深低温冰箱，保存一年。2 2、乙醇与甲醇保存法：、乙醇与甲醇保存法：70%70%冷乙醇、冷乙醇、75%75%的甲醇。的甲醇。3 3、甲醛或多聚甲醛固定法：细胞不具有生物活性，但、甲醛
18、或多聚甲醛固定法：细胞不具有生物活性，但 细胞表面荧光染色分析不受影响。细胞表面荧光染色分析不受影响。(四）单细胞悬液的保存四）单细胞悬液的保存 染料的选择和标记染色保证了荧光信号的产生染料的选择和标记染色保证了荧光信号的产生（一）免疫荧光标记最常用的荧光染料（一）免疫荧光标记最常用的荧光染料荧光染料荧光染料 激发波长（激发波长（nm)发射波长（发射波长（nm)颜色颜色FITC 488 525 深蓝色PE(RDI)488 575 橙色ECD 488 620 橙红色PeCy-5 488 670 红色PeCy-7 488 755 深红色PI 488 620 橙红色APC 633 670 红色二、免
19、疫分析中常用的荧光染料与标记染色二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色 用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在488nm波长激发光激发后产生的发射波长激发另一荧光波长激发光激发后产生的发射波长激发另一荧光染料产生的荧光信号。染料产生的荧光信号。LaserCY5PECY5CY5488nm能量传递染料：能量传递染料：荧光染料与细胞成分的结合方式：荧光染料与细胞成分的结合方式：结构亲和方式结构亲和方式 嵌入结合方式嵌入结合方式 共价结合方式共价结合方式 荧光抗体特异性结合方式荧光抗体特异性结合方式1、直接免疫荧光染色、直接免疫荧光染色2、间接免疫
20、荧光染色、间接免疫荧光染色（二）免疫荧光标记（二）免疫荧光标记3、双或多参数荧光抗体的组合标记、双或多参数荧光抗体的组合标记FITC+PE 488 525、575 绿色、橙色绿色、橙色FITC+T red 488 525 绿色绿色 568 615 红色红色FITC+PeCy5 488 525、675 绿色、绿色、红色红色FITC+ECD 488 525、625 绿色、橙红色绿色、橙红色F+P+PeCy5 488 525、575、675 绿、橙、绿、橙、红色红色F+ECD+PeCy5 488 525、575、675 绿、绿、橙红色、橙红色、红色红色F+P+APC 488 525、575 绿色、橙
21、色绿色、橙色 633 670 红色红色荧光染料荧光染料 激发波长（激发波长（nm)发射波长（发射波长（nm)颜色颜色 FITCFITC的激发的激发波长处于自发波长处于自发荧光的光谱区荧光的光谱区内，因此内，因此FITCFITC荧光易受自发荧光易受自发荧光的干扰。荧光的干扰。(三三)细胞的自发荧光细胞的自发荧光（一）单细胞悬液制备的质量控制（一）单细胞悬液制备的质量控制（二）细胞悬液免疫荧光染色的质量控制（二）细胞悬液免疫荧光染色的质量控制 1、温度对荧光染色的影响、温度对荧光染色的影响 2、pH对荧光发射强度的影响对荧光发射强度的影响 3、荧光染料浓度的控制、荧光染料浓度的控制 4、固定剂对荧
22、光染色的影响、固定剂对荧光染色的影响（三）仪器操作技术的质量控制（三）仪器操作技术的质量控制三、流式细胞免疫学技术的质量控制三、流式细胞免疫学技术的质量控制 1 1、同型对照：选用相同源性的未标记单抗作为、同型对照：选用相同源性的未标记单抗作为同型对照（阴性对照）同型对照（阴性对照）2 2、全程质控：在流式检测中，样品标记、溶血、全程质控：在流式检测中，样品标记、溶血、洗涤、仪器质量控制和上机检测的过程都会直接影洗涤、仪器质量控制和上机检测的过程都会直接影响检测结果。采用标准质控样品来进行全程质控，响检测结果。采用标准质控样品来进行全程质控，使得同类实验室建立质控比对，数据可以互用。使得同类实验室建立质控比对，数据可以互用。（四）免疫检测的质量控制（四）免疫检测的质量控制一、淋巴细胞及其亚群的分析一、淋巴细胞及其亚群的分析 流式细胞的应用流式细胞的应用二、淋巴细胞功能分析二、淋巴细胞功能分析三、白血病免疫分型三、白血病免疫分型四、肿瘤耐药基因分析四、肿瘤耐药基因分析五、在五、在AIDS病检测中的分析病检测中的分析六、自身免疫性疾病相关六、自身免疫性疾病相关HLA 抗原分析抗原分析
