1、第七章第七章 高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLC）7.1 概述概述7.1.1 两个比较两个比较（1）与经典液相色谱比较）与经典液相色谱比较 相同点相同点:分析原理相同分析原理相同 主要差别：固定相的性质、形状、粒度主要差别：固定相的性质、形状、粒度 经典：经典：10m的全多孔吸附剂，不均匀，的全多孔吸附剂，不均匀，不耐高压，操作方式为间断式，速度慢。不耐高压，操作方式为间断式，速度慢。（2）HPLC 与与GC比较比较 主要差别：作为流动相的液体和气体之间主要差别：作为流动相的液体和气体之间的性质差别。的性质差别。GC分析对象分析对象：挥发性和：挥发性和热稳定性高的物质（约热稳定性高的物质
2、（约20的有机物）的有机物）流动相流动相：种类少，但组分：种类少，但组分没有作用力没有作用力操作条件操作条件：恒温，压力小：恒温，压力小LC不受分析对象热稳定性不受分析对象热稳定性的限制的限制种类多对分离起很大种类多对分离起很大作用作用室温，高压室温，高压7.1.2 高效液相色谱法的分类高效液相色谱法的分类（1）液液分配色谱（）液液分配色谱（LLC）不同组分在固定相与流动相中的分配不同组分在固定相与流动相中的分配系数差异进行分离。系数差异进行分离。固定相固定相：涂渍在担体表面或键合到担体：涂渍在担体表面或键合到担体上的固定液。上的固定液。正相色谱正相色谱固定相：极性物质固定相：极性物质流动相：
3、非极性或弱极性物质流动相：非极性或弱极性物质反相色谱反相色谱固定相：极性小的物质固定相：极性小的物质流动相：极性大的物质（水系溶剂）流动相：极性大的物质（水系溶剂）应用应用：分离不同类化合物或同系物：分离不同类化合物或同系物,对分离异构体不优越对分离异构体不优越,固定相固定相 的种类多，用途广的种类多，用途广.性能性能：重现性佳，溶质保持稳定：重现性佳，溶质保持稳定（2）液固吸附色谱（）液固吸附色谱（LSC）基于不同组分吸附能力的差异而进行混合物基于不同组分吸附能力的差异而进行混合物的分离。的分离。应用应用：适于分离不同类化合物或异构体。：适于分离不同类化合物或异构体。不适宜分离同系物，固定相
4、的种类少，不适宜分离同系物，固定相的种类少，应用不十分广泛。应用不十分广泛。固定相固定相：极性吸附剂：极性吸附剂流动相流动相：弱极性的有机溶剂：弱极性的有机溶剂性能性能：重现性能差，样品有时会异构化解。：重现性能差，样品有时会异构化解。（3）离子色谱）离子色谱 根据离子交换树脂对组分的亲和力不根据离子交换树脂对组分的亲和力不同而进行分离。同而进行分离。固定相固定相：离子交换剂：离子交换剂流动相流动相：多为缓冲溶液：多为缓冲溶液应用应用：一般用于分离离子型化合物：一般用于分离离子型化合物（4）分子排阻色谱）分子排阻色谱按分子的尺寸大小进行分离。按分子的尺寸大小进行分离。凝胶过滤凝胶过滤固定相：亲
5、水性凝胶固定相：亲水性凝胶流动相：水系溶剂流动相：水系溶剂凝胶渗透凝胶渗透固定相：疏水性凝胶固定相：疏水性凝胶流动相：有机溶剂流动相：有机溶剂应用：应用：分离分子量大于分离分子量大于2000的物质的物质 测高聚物分子量分布测高聚物分子量分布 分离各种大分子（蛋白质，核酸）分离各种大分子（蛋白质，核酸）7.2 高效液相色谱仪高效液相色谱仪7.2.1 流动相输送系统流动相输送系统 流动相输送系统由流动相输送系统由过滤器、储液装置，脱气过滤器、储液装置，脱气装置，高压泵、压力脉冲阻尼器、梯度淋洗装置装置，高压泵、压力脉冲阻尼器、梯度淋洗装置组成。组成。脱气装置脱气装置：抽真空或吹入惰性气体的装置：抽
6、真空或吹入惰性气体的装置仪器外脱气仪器外脱气:低压脱气（抽真空）低压脱气（抽真空）、超声波脱气超声波脱气阻尼器阻尼器：螺旋毛细管、波纹管等：螺旋毛细管、波纹管等(稳定液流稳定液流)过滤器过滤器：孔径约为：孔径约为2 m的多孔性烧结不锈钢的多孔性烧结不锈钢 过滤器或特种烧结玻璃过滤器过滤器或特种烧结玻璃过滤器.在线在线脱气脱气:真空脱气真空脱气7.2.2 高压输液泵高压输液泵（1）对泵的要求）对泵的要求 输出压力高输出压力高;流量范围宽流量范围宽;流量稳定，无脉冲流量稳定，无脉冲;耐腐蚀。耐腐蚀。（2）泵的种类）泵的种类 恒流泵恒流泵（往复泵，注射泵）（往复泵，注射泵）输出流量稳定，与外界阻力变
7、化无关，为输出流量稳定，与外界阻力变化无关，为保护泵，设有最高压力限制装置。保护泵，设有最高压力限制装置。恒压泵恒压泵（气动放大泵）（气动放大泵）输出压力恒定，流量随色谱体系的压力而输出压力恒定，流量随色谱体系的压力而变化。变化。保留时间重现性差，较少应用。保留时间重现性差，较少应用。7.2.3 梯度洗脱装置梯度洗脱装置（1）低压梯度洗脱装置（外梯度）低压梯度洗脱装置（外梯度）常压下溶剂按一定比例混合后再由高压泵常压下溶剂按一定比例混合后再由高压泵输入色谱柱。输入色谱柱。（2）高压梯度洗脱装置（内梯度）高压梯度洗脱装置（内梯度）由两台或三台高压泵，梯度程序控制器组成。由两台或三台高压泵，梯度程
8、序控制器组成。各台泵将不同溶剂送入混合器，经充分混合后进各台泵将不同溶剂送入混合器，经充分混合后进入色谱柱。入色谱柱。7.2.4 进样系统进样系统直接注射进样，进样阀，自动进样系统直接注射进样，进样阀，自动进样系统六通阀动画六通阀动画7.3.5 检测器检测器类型类型溶质性质检测器溶质性质检测器：仅对溶质的物理性：仅对溶质的物理性质或物理化学性质有响应（紫外、荧质或物理化学性质有响应（紫外、荧光检测器）光检测器）总体性质检测器总体性质检测器：测量流动相中总的：测量流动相中总的物理性质变化（差示折光，电导电检测）物理性质变化（差示折光，电导电检测）（1）紫外检测器紫外检测器光源光源氘灯：氘灯：19
9、0350nm连续波长连续波长氢弧光灯：氢弧光灯：200300nm连续波长连续波长低压：低压：254nm汞灯汞灯中压：中压：280nm光谱通带光谱通带：25nm池体池体池长：一般为池长：一般为10mm直径：直径：1mm池体积：池体积：8L左右左右池材料：石英池材料：石英光接收元件：光接收元件：光敏电阻光敏电阻，光电管或光电倍增管光电管或光电倍增管。光源光源参比池参比池光敏电阻光敏电阻1测量池测量池光敏电阻光敏电阻2 若两池通过的都是纯流动相，则两光敏电阻若两池通过的都是纯流动相，则两光敏电阻接收的辐射强度相等，无信号输出。接收的辐射强度相等，无信号输出。吸光度吸光度：lgbcIAI参 比测 量
10、当组分进入测量池时，吸收紫外辐射，两光当组分进入测量池时，吸收紫外辐射，两光电阻接收的辐射强度不等，有信号输出。电阻接收的辐射强度不等，有信号输出。优点优点灵敏度高（灵敏度高（10-9gmL-1）选择性好选择性好线性范围宽（线性范围宽（10-510-8）对温度不敏感对温度不敏感适于梯度洗脱适于梯度洗脱光二极管阵列检测器 由1024(512或211)个光电二极管组成,各检测特定波长;计算机快速处理，可同时检测180600nm波长范围内全部紫外光和可见光波的信号.可获得A-t三维立体色谱图.(2)差示折光检测器差示折光检测器测量参比池和样品池之间的折射率之差测量参比池和样品池之间的折射率之差n1溶
11、剂的折射率溶剂的折射率 n2溶质的折射率溶质的折射率c1溶液中溶剂的浓度分数溶液中溶剂的浓度分数c2溶液中溶质的浓度分数溶液中溶质的浓度分数溶液的溶液的折射率折射率：ns=n1c1+n2c2c1+c2=1ns-n1=n1c1+n2c2-n1=n1(1-c2)+n2c2-n1=c2(n2-n1)一定稀溶液：折射率之差（一定稀溶液：折射率之差（ns-n1)c2优点优点：适用性好：适用性好缺点缺点：灵敏度较低：灵敏度较低(10-6gmL-1)不能用于梯度洗脱不能用于梯度洗脱 折光率对环境温度敏感，要折光率对环境温度敏感，要求求 恒温精度恒温精度0.001。对于无紫外吸收的有机物（如高分子化合物、糖类
12、、脂肪对于无紫外吸收的有机物（如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃）是比较适合的。烷烃）是比较适合的。在凝胶色谱中是必备检测器，在制在凝胶色谱中是必备检测器，在制备色谱中也经常使用。备色谱中也经常使用。(3)荧光检测器（荧光检测器（FLD）氙闪光灯氙闪光灯透镜透镜平面镜平面镜激发单色器激发单色器透镜透镜样品样品光电二极管光电二极管光电倍增器光电倍增器发射单色器发射单色器测量溶质受紫外光照射发生的荧光能量测量溶质受紫外光照射发生的荧光能量荧光强度荧光强度组分浓度组分浓度应用应用：测量在紫外线照射下能发出荧光的物质：测量在紫外线照射下能发出荧光的物质优点优点：检测限低（：检测限低（10-12gmL-1）
13、选择性强选择性强（4）电化学检测器）电化学检测器 检测具有电活性的物质，如含有硝基、检测具有电活性的物质，如含有硝基、氨基的有机化合物及无机阴、阳离子。氨基的有机化合物及无机阴、阳离子。优点优点：灵敏度高（：灵敏度高（10-9g）选择性高选择性高 结构简单结构简单7.3 色谱柱色谱柱7.3.1 柱材质与结构柱材质与结构材料材料：不锈钢、氟塑料：不锈钢、氟塑料要求要求：耐高压，抗腐蚀，精密管径，内：耐高压，抗腐蚀，精密管径，内 壁抛光壁抛光长度长度：一般：一般150250mm，少量，少量30mm短柱，短柱，500mm长柱长柱内径内径：一般：一般45mm，标准柱径：，标准柱径：4.6mm，痕量分析
14、痕量分析3mm，凝胶色谱柱：，凝胶色谱柱：8mm7.3.2 固定相的种类固定相的种类刚性固体刚性固体 以以SiO2为基质，表面键合各种官能团，可以为基质，表面键合各种官能团，可以承受压力承受压力70100MPa.可用于分配色谱，吸附色谱，凝胶色谱可用于分配色谱，吸附色谱，凝胶色谱缺点缺点：只能在：只能在pH2 7.5条件下使用，碱度条件下使用，碱度过大，硅胶容易粉碎溶解，过大，硅胶容易粉碎溶解，pH太低，连结有机太低，连结有机基团的化学键易断裂。基团的化学键易断裂。优点优点：机械强度大，化学稳定性好，容易控：机械强度大，化学稳定性好，容易控制孔结构和表面积。制孔结构和表面积。（1）按承受的压力
15、分类）按承受的压力分类 硬胶（高分子微球）硬胶（高分子微球）聚苯乙烯与二乙烯苯交联而成，改变制备聚苯乙烯与二乙烯苯交联而成，改变制备方法可以得到各种刚性和孔隙度不同的硬胶，方法可以得到各种刚性和孔隙度不同的硬胶，承受压力上限为承受压力上限为35MPa。可用于离子色谱和离子交换色谱，凝胶可用于离子色谱和离子交换色谱，凝胶渗透色谱。渗透色谱。缺点缺点：不同溶剂收缩率不同，柱效较硅胶微粒低：不同溶剂收缩率不同，柱效较硅胶微粒低优点优点：化学惰性好，可在：化学惰性好，可在pH1 14范围使用范围使用 软胶软胶葡聚糖，琼胶糖等葡聚糖，琼胶糖等用于凝胶过滤色谱中分离水溶性物质。用于凝胶过滤色谱中分离水溶性
16、物质。（2）按表面形状分）按表面形状分表面多孔表面多孔：基体是实心玻珠，外覆活性多孔材料，：基体是实心玻珠，外覆活性多孔材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂等，多孔表层薄，孔如硅胶、氧化铝、离子交换剂等，多孔表层薄，孔浅，传质快，柱效高浅，传质快，柱效高.缺点：柱容量小，已较少使用。缺点：柱容量小，已较少使用。全多孔型全多孔型：比表面积大：比表面积大,粒径粒径3-5m，柱容量高，柱容量高，保留值大。保留值大。缺点：由于孔深，传质阻力大，所以缺点：由于孔深，传质阻力大，所以10 m以上柱效低。以上柱效低。（3）化学键合相）化学键合相 化学键合相是通过化学反应将固定液化学键合相是通过化学反应将固定液键
17、合到载体上。键合到载体上。优点优点减弱了表面活性作用点减弱了表面活性作用点耐溶剂冲洗耐溶剂冲洗热稳定性好热稳定性好表面改性灵活表面改性灵活反应类型：反应类型：SiOC键型（硅胶与醇类反应生成硅酸酯）键型（硅胶与醇类反应生成硅酸酯）SiOH+HOR150-2500C3-8小时SiOR+H2O 因为在水、醇存在下有水解，醇解的可能，因为在水、醇存在下有水解，醇解的可能，所以只能在正相条件下使用。所以只能在正相条件下使用。SiN键型（硅胶与胺类的反应产物）键型（硅胶与胺类的反应产物）SiOH+SiCl+SO2SOCl2+HClSiCl+Si+HClH2NRNHRSiC键型（硅胶与卤代烷反应产物）键型
18、（硅胶与卤代烷反应产物）SiCl+SiR+MgXClRXMg可用于非或强极性溶剂作流动相，使用水溶液时，可用于非或强极性溶剂作流动相，使用水溶液时，必须限制在必须限制在pH 4 8范围内范围内SiOSiC（硅胶与有机硅烷反应产物）（硅胶与有机硅烷反应产物）这类固定相是将硅胶表面用有机氯硅烷这类固定相是将硅胶表面用有机氯硅烷或烷氧基硅烷处理。最常用的十八烷的键合或烷氧基硅烷处理。最常用的十八烷的键合形式可表示如下：形式可表示如下：SiOH+ClSiCH3CH3(CH2)17CH3SiCH3CH3(CH2)17CH3SiO+HCl 通过硅烷化反应导入的基团可以是从强极性通过硅烷化反应导入的基团可以
19、是从强极性到非极性的官能团，如十八烷基、辛烷基（到非极性的官能团，如十八烷基、辛烷基（C8）、）、氨基、氰基、苯基等氨基、氰基、苯基等.键合的表面可以是单分子层、也可以被多分子键合的表面可以是单分子层、也可以被多分子聚合物覆盖。聚合物覆盖。7.3.3 色谱柱的填充方法色谱柱的填充方法（1）干法）干法 适于颗粒大小在适于颗粒大小在20m以上的硬胶固定相以上的硬胶固定相（2）匀浆法）匀浆法 当固定相的颗粒直径当固定相的颗粒直径乙腈乙腈丙酮丙酮 d6.26.56.8接近接近0585乙腈乙腈甲醇丙酮甲醇丙酮a7.52.52.5甲醇甲醇乙腈丙酮乙腈丙酮h7.500甲醇甲醇乙腈丙酮乙腈丙酮 当分离萘、硝基
20、萘时，主要是极性作用力，乙当分离萘、硝基萘时，主要是极性作用力，乙腈强于甲醇；腈强于甲醇；分离酚类物质时，主要是氢键作用力，甲醇强分离酚类物质时，主要是氢键作用力，甲醇强于乙腈。于乙腈。溶质的强度：由溶质的强度：由支配支配 溶剂的选择性：由溶剂的选择性：由d，0，a，h决定决定 混合溶剂的混合溶剂的，d，0，a，h是组成混合是组成混合溶剂的各种纯溶剂相应的溶剂的各种纯溶剂相应的的平均值的平均值。在保证在保证1 K 10的前提下（的前提下（在一定范围内），通过选择在一定范围内），通过选择 d、o、a、h不同的试剂来改善分离选择性不同的试剂来改善分离选择性 溶剂极性参数溶剂极性参数P 溶剂极性参数
21、是溶剂极性的另一尺度，是溶剂极性参数是溶剂极性的另一尺度，是Sngder使使用用Rohrschneider的溶解度参数数据推导出的。的溶解度参数数据推导出的。Plog（Kg）乙醇乙醇+log(Kg)二氧六环二氧六环+log(Kg）硝基甲苯硝基甲苯式中：式中：Kg与溶剂的汽化自由能成正比的极性分布系数与溶剂的汽化自由能成正比的极性分布系数 P由乙醇、二氧六环、硝基甲苯分别作溶质时的由乙醇、二氧六环、硝基甲苯分别作溶质时的溶解度数据计算得到。每种溶质的溶解度数据计算得到。每种溶质的Kg值与值与P的比值的比值称为选择性参数。称为选择性参数。Sngder规定的选择性参数为：规定的选择性参数为：log(
22、)/(log()/log()/egdgngxKpxKpxKp乙 醇二 氧 六 环硝 基 甲 烷 接 收 质 子 能 力）（给 质 子 能 力）（偶 极 作 用 力）P增大，溶剂极性增加增大，溶剂极性增加正相色谱正相色谱：P增大，溶剂强度增加，样品增大，溶剂强度增加，样品K减小减小反相色谱反相色谱：P增大，溶剂强度减少，样品增大，溶剂强度减少，样品K增大增大1221()221()22112122101010pppppkkkkkppkk值改变 个单位，组分的值大致改变倍正相色谱：反相色谱：式中：和分别表示第一种溶剂和第二种溶剂的溶剂极性参数。和分别表示同一组分在使用两种溶剂时的分配比。abaabb
23、ababpppABpApB如果，溶剂A(弱）+溶剂B（强）二元混合溶剂混合溶剂溶剂 的体积分数溶剂 的体积分数溶剂 的极性参数溶剂 的极性参数 例：反相色谱中，流动相从例：反相色谱中，流动相从30（V/V）甲醇水）甲醇水改变为改变为40（V/V）甲醇水，问组分的调整保留值）甲醇水，问组分的调整保留值改变多少？（已知甲醇的改变多少？（已知甲醇的p值为值为5.1，水的，水的p值为值为10.2）2112210.5122121300.35.10.710.28.6740%0.45.10.610.28.168.168.670.511101.811.8RRpppppkktkkt 解：时，时，组 分 的 调
24、整 保 留 时 间 减 少 到 原 来 的 溶剂的选择溶剂的选择 Sngder以等边三角形的三条边代表以等边三角形的三条边代表xe,xd,xn三个参数。按每种溶剂的三个参数。按每种溶剂的xi值在三角形内找到值在三角形内找到相应的点，发现选择性相似的溶剂集中在一个相应的点，发现选择性相似的溶剂集中在一个小小区域（圆圈）内，将各个圆圈的溶剂归成一组，区域（圆圈）内，将各个圆圈的溶剂归成一组，共分成八组。共分成八组。如果溶剂样品的主要作用力变化如果溶剂样品的主要作用力变化,则溶剂的选择性有明显的变化则溶剂的选择性有明显的变化.溶剂分类溶剂分类I脂肪族醚、三级烷胺脂肪族醚、三级烷胺II脂肪醇脂肪醇II
25、I四氢呋喃、吡啶、二甲基甲酰胺、二甲亚砜四氢呋喃、吡啶、二甲基甲酰胺、二甲亚砜IV乙二醇、乙酸、甲酰胺乙二醇、乙酸、甲酰胺V二氯甲烷、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷二氯乙烷,VI乙腈、乙酸乙酯、二氧六环乙腈、乙酸乙酯、二氧六环,脂肪族酮脂肪族酮VII苯、甲苯、二甲苯、硝基甲烷、硝基乙烷、甲乙酮苯、甲苯、二甲苯、硝基甲烷、硝基乙烷、甲乙酮VIII氯仿、水氯仿、水 同一组内的溶剂有相似的选择性，但极性同一组内的溶剂有相似的选择性，但极性可能相差很大。可能相差很大。不同组间极性相似的溶剂，选择性可能相差不同组间极性相似的溶剂，选择性可能相差很大。很大。例：例：PXeXdXn选择性甲醇5.10.480.2
26、20.31丙酮5.10.350.230.42 甲醇：质子受体甲醇：质子受体 丙酮：偶极作用力丙酮：偶极作用力 寻找最佳溶剂的方法：寻找最佳溶剂的方法：选择合适的选择合适的p值，使值，使k在最佳范围。在最佳范围。考虑溶剂的选择性考虑溶剂的选择性 例：正相色谱分离某一样品，以例：正相色谱分离某一样品，以20（V/V）氯仿己烷作流动相，溶剂强度合适，但分离情况氯仿己烷作流动相，溶剂强度合适，但分离情况不佳。不佳。改变溶剂的选择性，必须使选择性组的位置改变溶剂的选择性，必须使选择性组的位置有较大的变化。有较大的变化。氯仿属氯仿属组，距离较远的有组，距离较远的有，组。组。若以若以组的二氯甲烷代替氯仿，混
27、合溶剂组的二氯甲烷代替氯仿，混合溶剂的极性应维持不变。的极性应维持不变。即：即：4.1()0.20.2653.10.80 0.1 0.20 4.10.9026.5%0.735 0.1 0.265 3.10.894aabbaaccabcbcppppppppp忽略 的变化对 的影响即混合溶剂的配比是26.5（v/v)二氯甲烷己烷20氯仿己烷：二氯甲烷己烷：（3）离子交换色谱流动相）离子交换色谱流动相 大多数离子交换色谱以盐类的缓冲溶液大多数离子交换色谱以盐类的缓冲溶液为流动相，某些特殊的情况下也加入有机溶为流动相，某些特殊的情况下也加入有机溶剂。剂。在离子交换色谱中，交换反应可表示如下：在离子交换
28、色谱中，交换反应可表示如下：DSRYXRXYRXYKRYXRXRYKKXY 交换洗脱S阳离子交换：平衡常数：分配系数：当溶液中有多种离子同时存在时，不同离子当溶液中有多种离子同时存在时，不同离子对树脂可交换的基团进行竞争，即发生不同离子对树脂可交换的基团进行竞争，即发生不同离子间的交换反应：间的交换反应：,ABRYRABYBRARBAAB离 子 发 生 交 换()()1,BABAD BDABAKRBAKRABKRBABRAKK上述反应向哪个方向进行，取决于反应平衡常数若则反应向右进行。影响溶质影响溶质 k值的因素：值的因素：pH的影响的影响 离子交换分离的对象是一些可电离的化合物。离子交换分离
29、的对象是一些可电离的化合物。流动相的流动相的pH值影响样品的电离，从而影响样品值影响样品的电离，从而影响样品的保留值。的保留值。对于弱酸组分，采用阴离子树脂作为固定相。对于弱酸组分，采用阴离子树脂作为固定相。COOHCOOHRXCOORCOOY流动相中：先电离在阴离子树脂上：后交换,pHCOOCOOpH溶 液 的，H,电 离 平 衡 向 右 移 动，可 交 换 离 子交 换 平 衡 向 右 移 动，R-COO流 动 相 溶 质 浓 度，保 留 值，即 阴 离 子 交 换，k对于弱碱组分，采用阳离子树脂作固定相NH+H+NH2+在阳离子树脂上：在阳离子树脂上：N H2+R-Y+R-NH2+Y+2
30、,pHHNHpHpH=在 树 脂 上 的 浓 度，k阴 离 子 树 脂：k阳 离 子 树 脂：k pH值是通过影响溶质中可交换离子的浓度值是通过影响溶质中可交换离子的浓度来影响来影响k值。值。所以所以pH值对弱酸、弱碱样品影响大，对强值对弱酸、弱碱样品影响大，对强酸、强碱样品影响小。酸、强碱样品影响小。溶剂离子强度的影响溶剂离子强度的影响 缓冲溶液或其它盐的浓度增大，溶剂离子缓冲溶液或其它盐的浓度增大，溶剂离子强度增大，对交换剂上的离子基强度增大，对交换剂上的离子基R-或或R+竞争力竞争力增强，样品离子的竞争力下降，保留值下降。增强，样品离子的竞争力下降，保留值下降。DSRYkKKY 因为样品
31、中阳离子的量极少（因为样品中阳离子的量极少（NH4+Na+H+,阴离子与树脂的亲和力顺序：阴离子与树脂的亲和力顺序：柠檬酸根柠檬酸根SO42-C2O42-洗脱能力：钾盐缓冲溶液比钠盐缓冲能力快洗脱能力：钾盐缓冲溶液比钠盐缓冲能力快 （4）分子排阻色谱的流动相分子排阻色谱的流动相 不能借助改变流动相来改善分离。不能借助改变流动相来改善分离。流动相的选择主要考虑：流动相的选择主要考虑：能够很好溶解样品和有低的粘度能够很好溶解样品和有低的粘度 与检测器和固定相匹配与检测器和固定相匹配 常用的流动相：四氢呋喃、甲苯、氯仿、常用的流动相：四氢呋喃、甲苯、氯仿、水等。水等。7.4.3 改善分离的一般方法改
32、善分离的一般方法 正常洗脱：一种溶剂，恒流洗脱正常洗脱：一种溶剂，恒流洗脱 当样品组分的当样品组分的k范围很大时，用单一溶剂范围很大时，用单一溶剂难以使各组分获得适当的难以使各组分获得适当的k值，可以通过下列值，可以通过下列途径达到分离的目的：途径达到分离的目的：（1）程序变流程序变流 初期流速较慢，后期逐渐增加。初期流速较慢，后期逐渐增加。此法不能改变此法不能改变k值，在值，在k变化小于变化小于20，后面，后面各峰分离好时适应。各峰分离好时适应。（2）梯度洗脱梯度洗脱 若前面各峰分离不好，后面各峰过于若前面各峰分离不好，后面各峰过于扁平的时候，必须使用梯度洗脱改善分离。扁平的时候，必须使用梯
33、度洗脱改善分离。梯度洗脱是指在分离过程中逐步改变梯度洗脱是指在分离过程中逐步改变溶剂的组成，使溶剂强度按照一种特定溶剂的组成，使溶剂强度按照一种特定的变化规律逐渐由弱变强，使所有的的变化规律逐渐由弱变强，使所有的组分的组分的k值都能处于最佳值都能处于最佳k值范围值范围.正相：溶剂极性逐步增加正相：溶剂极性逐步增加 CH2Cl2（增加）（增加）/己烷己烷 反相：溶剂极性逐步降低反相：溶剂极性逐步降低 甲醇（增加）甲醇（增加）/水水 液固：溶剂极性逐步增加液固：溶剂极性逐步增加 离子交换色谱：离子交换色谱：流动相盐浓度（离子强度）逐步增加流动相盐浓度（离子强度）逐步增加 逐步改变溶液的逐步改变溶液
34、的pH值。值。梯度洗脱的方法梯度洗脱的方法线性线性非线性非线性凹形凹形凸形凸形 注意：注意：梯度洗脱完毕，柱子在下一次分离梯度洗脱完毕，柱子在下一次分离之前需要进行再生，恢复到初始状态，通常用之前需要进行再生，恢复到初始状态，通常用反梯度洗脱程序再生。反梯度洗脱程序再生。（3）组合柱固定相程序）组合柱固定相程序改变固定相的强度：改变固定相的强度：改变固定液的涂渍量改变固定液的涂渍量 改变吸附剂的表面积改变吸附剂的表面积 改变固定相表面性质（全多孔薄壳）改变固定相表面性质（全多孔薄壳）做法：流动相组成恒定，样品在不同固定相做法：流动相组成恒定，样品在不同固定相的柱子按程序分离。的柱子按程序分离。
35、流动相流动相柱柱1柱柱2柱柱3柱柱4检测器检测器切换阀切换阀柱柱1：全部组分在柱：全部组分在柱1中中k值较小（初步分离）值较小（初步分离）柱柱2：全部组分在柱：全部组分在柱2中中k值最大值最大柱柱3：组分在柱中组分在柱中k值中等值中等柱柱4：同柱：同柱1，k最小。最小。样品在柱样品在柱1大致分成快、中、慢三组大致分成快、中、慢三组1 2，“快快”组分进入柱组分进入柱2存储存储1 3，“中中”组分进入柱组分进入柱3存储存储1 4，“慢慢”组分进入柱组分进入柱4直到全部出峰直到全部出峰然后切换阀，然后切换阀，柱柱3中的中的k值中等的组分值中等的组分逐步流出。逐步流出。k值最小的组分值最小的组分k增大，增大，达到分离。达到分离。7.4.4 以开放床色谱作为溶剂选择的先导以开放床色谱作为溶剂选择的先导 选择分离条件时，可以先采用开放床色谱进行选择分离条件时，可以先采用开放床色谱进行分离试验，选出合适的溶剂后再进行柱上试验并分离试验，选出合适的溶剂后再进行柱上试验并作进一步的调整。作进一步的调整。
