1、第一节 概述第二节 抗生素效价微生物检定法第三节 抗生素药物的分析世界各国实际应用的抗生素有世界各国实际应用的抗生素有300300多种，我国药典中收载多种，我国药典中收载的品种有的品种有200200多种。多种。生物发酵，生物发酵，化学纯化，精致，化学修饰等过程，最后制化学纯化，精致，化学修饰等过程，最后制成制剂，结构，组成更复杂。成制剂，结构，组成更复杂。化学纯度低，有三多：同系物多，异构体多，降解物多。化学纯度低，有三多：同系物多，异构体多，降解物多。发酵过程不易控制。生产工艺复杂易受污染。分子结构发酵过程不易控制。生产工艺复杂易受污染。分子结构大多不稳定，降解后疗效下降、失效或增加毒副作用
2、。大多不稳定，降解后疗效下降、失效或增加毒副作用。活性产物易发生变异。活性产物易发生变异。一、抗生素药物的特点一、抗生素药物的特点第一节 概述二、抗生素类药物的检查项目二、抗生素类药物的检查项目抗生素的检查项目是由抗生素的生产、用途、毒副作用抗生素的检查项目是由抗生素的生产、用途、毒副作用等决定的。等决定的。一般来说，各种抗生素及其制剂的性质及工艺不同，检一般来说，各种抗生素及其制剂的性质及工艺不同，检查项目也不同。查项目也不同。注射剂型检查项目多、要求严；口服剂注射剂型检查项目多、要求严；口服剂型、外用药检查项目少、要求松。型、外用药检查项目少、要求松。第一节 概述n 鉴别试验：用物理化学方
3、法判定抗生素真伪鉴别试验：用物理化学方法判定抗生素真伪n 相关物质的检查：抗生素产生过程中产生的中间体、相关物质的检查：抗生素产生过程中产生的中间体、副产物、贮存过程中的降解产物副产物、贮存过程中的降解产物(TC ETCEATC)(TC ETCEATC)n 酸碱度检查：保证产品的稳定性和适用于临床应用酸碱度检查：保证产品的稳定性和适用于临床应用n 水分的检查：限制水分，以免水解反应水分的检查：限制水分，以免水解反应n 溶液澄清度检查：限制不溶性杂质溶液澄清度检查：限制不溶性杂质检查项目：检查项目：第一节 概述n无菌检查：检查有无杂菌无菌检查：检查有无杂菌n异常毒性试验：限制产品中的致毒物质异常
4、毒性试验：限制产品中的致毒物质n热源试验：限制产品中的致热物质热源试验：限制产品中的致热物质n降压物质检查：限制产品中降低血压的物质降压物质检查：限制产品中降低血压的物质n效价检查：检查抗生素含量与活性效价检查：检查抗生素含量与活性n其它检查：检查抗生素各组分之间的比例（其它检查：检查抗生素各组分之间的比例（GMCGMC），），比旋度检查比旋度检查(TC ETC)(TC ETC)、熔点检查、熔点检查(羟氨苄青霉素羟氨苄青霉素)、晶、晶型检查（金霉素、利福平）、溶剂残留量（甲醇、乙型检查（金霉素、利福平）、溶剂残留量（甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯、二氯甲烷等等）醇、丙酮、醋酸乙酯、二氯甲烷等等）第
5、一节 概述其中无菌试验的目的是检查药物是否染菌。有抑菌作其中无菌试验的目的是检查药物是否染菌。有抑菌作用的药物的微生物限度检查，应该先将抗生素活性灭用的药物的微生物限度检查，应该先将抗生素活性灭活，或者除去抗生素，这样才能使制品中所污染的杂活，或者除去抗生素，这样才能使制品中所污染的杂菌在培养基中生长出来，才能判定是否染菌。菌在培养基中生长出来，才能判定是否染菌。去除抗生素影响的办法很多，但是又要保证杂菌不被去除抗生素影响的办法很多，但是又要保证杂菌不被杀死，一般有以下方法：杀死，一般有以下方法：第一节 概述 青霉素酶法：青霉素酶先与青霉素类药物作用一段青霉素酶法：青霉素酶先与青霉素类药物作用
6、一段时间，使其水解时间，使其水解b-b-内酰胺环部分而灭活，对细菌无内酰胺环部分而灭活，对细菌无抑杀作用。这种方法只对青霉素有效，特异性高。抑杀作用。这种方法只对青霉素有效，特异性高。盐酸羟胺法：链霉素与盐酸羟胺反应生成链霉污，盐酸羟胺法：链霉素与盐酸羟胺反应生成链霉污，可使链霉素失活。只对链霉素有效，特异性高。可使链霉素失活。只对链霉素有效，特异性高。树脂法：以无菌的钠型树脂与碱性抗生素的水溶液树脂法：以无菌的钠型树脂与碱性抗生素的水溶液混合，放置，抗生素被交换吸附到树脂上，而被去混合，放置，抗生素被交换吸附到树脂上，而被去除，杂菌则留在中性或者偏碱性的水溶液中，这样除，杂菌则留在中性或者偏
7、碱性的水溶液中，这样取流出液作无菌检查。取流出液作无菌检查。无菌滤膜过滤法：将抗生素水溶液通过无菌滤膜，无菌滤膜过滤法：将抗生素水溶液通过无菌滤膜，抗生素被除去而杂菌被截留在滤膜上。取此滤膜作抗生素被除去而杂菌被截留在滤膜上。取此滤膜作无菌检查。这种方法应用最广，但是操作过程中不无菌检查。这种方法应用最广，但是操作过程中不得引入其他杂菌，以免错误判断。得引入其他杂菌，以免错误判断。第一节 概述三、抗生素效价的标示量三、抗生素效价的标示量1.1.效价定义：效价定义：早期抗生素产品往往不是纯品，因此无法用重量单位表早期抗生素产品往往不是纯品，因此无法用重量单位表示其活性。因此，示其活性。因此，为了
8、与临床上应用原理保持一致，以为了与临床上应用原理保持一致，以抗生素的抑制或者杀死细菌的能力作为衡量抗生素活性抗生素的抑制或者杀死细菌的能力作为衡量抗生素活性的指标，这个指标就叫做效价的指标，这个指标就叫做效价，即以效价的高低作为抗，即以效价的高低作为抗生素质量的标示。生素质量的标示。通常，新发现的抗生素在初期尚未得到纯品时候，常通常，新发现的抗生素在初期尚未得到纯品时候，常常用上述方法来确定效价，或者用性质相近的已知抗常用上述方法来确定效价，或者用性质相近的已知抗生素作为标准来衡量其效价。生素作为标准来衡量其效价。第一节 概述最早确定效价的抗生素是最早确定效价的抗生素是青霉素青霉素，其效价单位
9、定义是：在，其效价单位定义是：在实验条件下，能完全抑制实验条件下，能完全抑制50ml50ml肉汤培养基中金黄色葡萄球肉汤培养基中金黄色葡萄球菌标准菌株生长的青霉素的最低含量为一个效价单位，即菌标准菌株生长的青霉素的最低含量为一个效价单位，即一个牛津单位，也叫做一个生物活性单位。一个牛津单位，也叫做一个生物活性单位。链霉素的效价单位链霉素的效价单位：能完全抑制：能完全抑制1ml1ml肉汤培养基中大肠杆菌肉汤培养基中大肠杆菌标准菌株生长的链霉素的最低含量为一个效价单位。标准菌株生长的链霉素的最低含量为一个效价单位。第一节 概述随着抗生素分离纯化技术的不断提高，现在已经能制备随着抗生素分离纯化技术的
10、不断提高，现在已经能制备纯净的抗生素，可以用重量来表示其效价。纯净的抗生素，可以用重量来表示其效价。首先制备出纯净的抗生素为苄青霉素钠（首先制备出纯净的抗生素为苄青霉素钠（PcGNaPcGNa）,1949,1949年年国际联盟卫生组织通过试验证明，国际联盟卫生组织通过试验证明，1mg PcGNa1mg PcGNa能够抑制能够抑制83300ml83300ml肉汤培养基中的标准金黄色葡萄球菌标准菌的株生肉汤培养基中的标准金黄色葡萄球菌标准菌的株生长，即相当于长，即相当于1mg PcGNa1mg PcGNa=1667u=1667u（83300/5083300/50），），1u 1u PcGNaPcG
11、Na=0.6ug=0.6ug。第一节 概述2.2.抗生素的效价标示方法：抗生素的效价标示方法：重量单位：以抗生素中所含特定的抗菌活性部分（纯重量单位：以抗生素中所含特定的抗菌活性部分（纯游离碱或游离酸）的重量游离碱或游离酸）的重量1 1微克作为微克作为1 1单位，即单位，即1 1毫克毫克=1000=1000单位。单位。如链霉素硫酸盐、土霉素盐酸盐等均以重量单位表示。如链霉素硫酸盐、土霉素盐酸盐等均以重量单位表示。用这种方法表示，对不同有机酸根的同一抗生素，只用这种方法表示，对不同有机酸根的同一抗生素，只要单位一样或有效部分重量一样，则这一抗生素的各要单位一样或有效部分重量一样，则这一抗生素的各
12、种盐类虽然称重不同，但实际有效含量是相同的。种盐类虽然称重不同，但实际有效含量是相同的。这样标示的抗生素有：红霉素、卡那霉素、庆大霉素、这样标示的抗生素有：红霉素、卡那霉素、庆大霉素、新霉素、氯霉素、新生霉素、利福霉素新霉素、氯霉素、新生霉素、利福霉素SVSV。第一节 概述 类似重量单位：以特定的纯抗生素制品盐的重量，类似重量单位：以特定的纯抗生素制品盐的重量，规定规定1 1毫克毫克10001000单位，其中包括了无抗菌活性的单位，其中包括了无抗菌活性的酸根在内，如四环素盐酸盐（包括无生物活性的盐酸根在内，如四环素盐酸盐（包括无生物活性的盐酸根在内）。酸根在内）。这种这种 类似重量单位类似重量
13、单位，虽然并不合理，但在国际上已，虽然并不合理，但在国际上已经习惯沿用。经习惯沿用。第一节 概述 重量折算单位：以特定的纯抗生素制品的某一重量为效重量折算单位：以特定的纯抗生素制品的某一重量为效价单位而加以折算。价单位而加以折算。如第二次青霉素国际标准品（如第二次青霉素国际标准品（19521952年）青霉素年）青霉素G G钠称重钠称重0.59980.5998微克为微克为1 1单位，即单位，即1 1毫克毫克=1670=1670单位，那么单位，那么8080万单万单位的青霉素位的青霉素G G钠称重应为钠称重应为0.480.48克。虽然青霉素克。虽然青霉素G G制品现已制品现已完全可用化学或物理方法检
14、验其含量，但仍广泛使用效完全可用化学或物理方法检验其含量，但仍广泛使用效价单位的表示方法。价单位的表示方法。第一节 概述 特定单位：以一特定量的抗生素标准品（或对照品）特定单位：以一特定量的抗生素标准品（或对照品）作为作为1 1单位。单位。如第一批杆菌肽国际标准品（如第一批杆菌肽国际标准品（19531953年）杆菌肽年）杆菌肽A A为为1 1毫克毫克=55=55单位。单位。制霉菌素（制霉菌素（19631963年）为年）为1 1毫克毫克=3000=3000单位等。单位等。这类抗生素的效价单位的精确定义很难确定，折算效价这类抗生素的效价单位的精确定义很难确定，折算效价也难以计算，只能以国际标准品的
15、效价单位，作为比也难以计算，只能以国际标准品的效价单位，作为比较的基准。较的基准。第一节 概述 半合成新霉素、头孢菌素类药物纯度较高，化学结半合成新霉素、头孢菌素类药物纯度较高，化学结构确定，规定原料药按照整个分子计算其百分含量。构确定，规定原料药按照整个分子计算其百分含量。（同其他化学合成药物）（同其他化学合成药物）稀释单位：抗生素不纯时，不能用重量表示其效价，稀释单位：抗生素不纯时，不能用重量表示其效价，只能用稀释单位来标示抗生素的生物活性。用于新只能用稀释单位来标示抗生素的生物活性。用于新抗生素的初期研究抗生素的初期研究第一节 概述四、抗生素标准品四、抗生素标准品绝大多数抗生素效价采用绝
16、大多数抗生素效价采用微生物检定法微生物检定法。要使用到标。要使用到标准品。标准品是具有一定物理、化学性质及生物活性准品。标准品是具有一定物理、化学性质及生物活性的物质。分为的物质。分为国际标准品和国家标准品国际标准品和国家标准品。国际标准品国际标准品是由英国伦敦生物标准检定所负责标准品是由英国伦敦生物标准检定所负责标准品原料的挑选、理化分析、分装和分发等。国际标准品原料的挑选、理化分析、分装和分发等。国际标准品效价的标定由世界卫生组织邀请有条件的国家检定所效价的标定由世界卫生组织邀请有条件的国家检定所或者药厂实验室分别进行效价测定，然后通过统计分或者药厂实验室分别进行效价测定，然后通过统计分析
17、，考察标定结果的误差与真实性，最后由生物检定析，考察标定结果的误差与真实性，最后由生物检定专家委员会确定效价。我国自专家委员会确定效价。我国自19761976年参加了部分品种年参加了部分品种的国际协作标定。的国际协作标定。第一节 概述国内标准品国内标准品是由国际标准品来标定的。我国的抗生素是由国际标准品来标定的。我国的抗生素标准品是由中国药品生物制品检定所负责标准品原料标准品是由中国药品生物制品检定所负责标准品原料的挑选、理化分析、分装和分发等。的挑选、理化分析、分装和分发等。各种标准品都有一定的有效期，新制备的标准品开始各种标准品都有一定的有效期，新制备的标准品开始发放，上一批的标准品停止使
18、用。发放，上一批的标准品停止使用。第一节 概述第二节 抗生素效价微生物检定法一、抗生素效价测定方法一、抗生素效价测定方法 又叫微生物检定法，是各国又叫微生物检定法，是各国药典收载的法定方法。它是药典收载的法定方法。它是以抗生素的抑制、杀死细菌以抗生素的抑制、杀死细菌的能力作为衡量效价的标准的能力作为衡量效价的标准 物理测定法物理测定法化学测定法化学测定法生物测定法生物测定法生物测定法优点生物测定法优点：1 1）检测原理与临床应用原理一致，检测的结果能代表其）检测原理与临床应用原理一致，检测的结果能代表其杀菌、抑菌活性杀菌、抑菌活性2 2）灵敏度高，用量极少，）灵敏度高，用量极少，ugug级，是
19、其他方法所不及的级，是其他方法所不及的3 3）使用范围广，即可用于较纯的精品，也可用于粗品，）使用范围广，即可用于较纯的精品，也可用于粗品，对已知抗生素和位置抗生素都适用。只要按照操作规定对已知抗生素和位置抗生素都适用。只要按照操作规定，既可以一次测定其总效价，而不需要分离纯化。，既可以一次测定其总效价，而不需要分离纯化。生物测定法缺点生物测定法缺点：1 1）操作步骤多）操作步骤多2 2）测定时间长）测定时间长3 3）误差大。）误差大。第二节 抗生素效价微生物检定法物理、化学法物理、化学法测定效价是根据抗生素分子结构特点，利用测定效价是根据抗生素分子结构特点，利用其特有的物理或者化学性质及反应
20、而进行的测定。其特有的物理或者化学性质及反应而进行的测定。优点优点：操作简单、方便、省时、具有一定的专属性。：操作简单、方便、省时、具有一定的专属性。缺点缺点：1 1）只能对结构清楚、纯度高的已知抗生素有效）只能对结构清楚、纯度高的已知抗生素有效2 2）对未知的新抗生素，或者在发酵生产中未提纯的样品无）对未知的新抗生素，或者在发酵生产中未提纯的样品无法测定。法测定。只有当用物理化学方法所测定的结果与生测结果相同时，只有当用物理化学方法所测定的结果与生测结果相同时，才能用该法测定抗生素药物的效价，这是临床上的要求。才能用该法测定抗生素药物的效价，这是临床上的要求。第二节 抗生素效价微生物检定法第
21、二节 抗生素效价微生物检定法发展趋势发展趋势：随着对抗生素分子结构的逐步认识，用物：随着对抗生素分子结构的逐步认识，用物理化学方法测定效价的应用日渐增多。如我国现有几理化学方法测定效价的应用日渐增多。如我国现有几种抗生素（庆大霉素、青霉素、氯霉素、灰黄霉素）种抗生素（庆大霉素、青霉素、氯霉素、灰黄霉素）使用使用HPLCHPLC测定其含量，而且还分别要求了其中各个组测定其含量，而且还分别要求了其中各个组分的含量范围，为更好的控制其毒性提供了监督手段。分的含量范围，为更好的控制其毒性提供了监督手段。各国药典收载的抗生素，除了上述提及以外，其他均各国药典收载的抗生素，除了上述提及以外，其他均用微生物
22、效价检定法。用微生物效价检定法。第二节 抗生素效价微生物检定法二、抗生素效价微生物检定法（生测法）二、抗生素效价微生物检定法（生测法）原理：以抑制或者杀死细菌的能力作为检验标准。原理：以抑制或者杀死细菌的能力作为检验标准。是将供试液和标准液两者抗菌能力进行比较。是将供试液和标准液两者抗菌能力进行比较。分类：分类：稀释法稀释法比浊法比浊法扩散法扩散法 第二节 抗生素效价微生物检定法1.稀释法稀释法 抗生素微生物效价测定最简单的办抗生素微生物效价测定最简单的办法法操作方法操作方法：在一系列试管中用液体培养基逐管将抗生素：在一系列试管中用液体培养基逐管将抗生素做做2 2倍稀释，并于各个试管中加入同量
23、的对该抗生素高度倍稀释，并于各个试管中加入同量的对该抗生素高度敏感的试验菌液，将各个试管放置于敏感的试验菌液，将各个试管放置于37243724小时，观察小时，观察能抑制细菌生长的最低抗生素浓度作为测定终点。能抑制细菌生长的最低抗生素浓度作为测定终点。同法测定抗生素标准品终点，作比较，即可求出被测定同法测定抗生素标准品终点，作比较，即可求出被测定抗生素的效价。抗生素的效价。计算公式计算公式 A=(T/S)A=(T/S)C C A:A:供试品效价供试品效价 T T：供试品最大稀释倍数：供试品最大稀释倍数 C C：标准品效价：标准品效价 S S：标准品最大稀释倍数：标准品最大稀释倍数注意：这种方法终
24、点判定比较困难，误差较大，因此不注意：这种方法终点判定比较困难，误差较大，因此不是药典收载的方法，只适用于最小抑菌浓度的测定。是药典收载的方法，只适用于最小抑菌浓度的测定。第二节 抗生素效价微生物检定法二、比浊法二、比浊法原理原理：细菌生长产生的浊度与细菌数量、群体质量（生：细菌生长产生的浊度与细菌数量、群体质量（生长期、衰老期）及细菌细胞容积之间存在相关性，在一长期、衰老期）及细菌细胞容积之间存在相关性，在一定范围内符合定范围内符合BeerBeer定律。定律。操作方法操作方法：同稀释法相似。放置于：同稀释法相似。放置于37 2-437 2-4小时，加入小时，加入甲醛溶液（甲醛溶液（12%12
25、%），摇匀（抑制细菌生长），用分光光），摇匀（抑制细菌生长），用分光光度法测定度法测定530nm530nm透光率或者吸收度，用标准曲线法（先透光率或者吸收度，用标准曲线法（先用标准品作一条标准曲线），测定供试品效价。用标准品作一条标准曲线），测定供试品效价。标准曲线测定：每个浓度测定标准曲线测定：每个浓度测定3 3次次第二节 抗生素效价微生物检定法标准溶液浓度（标准溶液浓度（u/mlu/ml）24240 026268 830300 033335 537375 5试验菌液试验菌液1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml液体培养基液体培养基9ml9ml9ml9ml9ml9ml9
26、ml9ml9ml9ml供试液供试液1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml12%12%甲醛溶液甲醛溶液0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml空白：未接种试验菌的液体培养基空白：未接种试验菌的液体培养基9ml+9ml+蒸馏水蒸馏水1ml+12%1ml+12%甲醛溶液甲醛溶液0.5ml0.5ml先测定各浓度先测定各浓度3 3只试管吸光度，求平均值，绘制标准曲线只试管吸光度，求平均值，绘制标准曲线再测定供试品再测定供试品3 3只试管吸光度，求平均值，查标准曲线，计算效价。只试管吸光度，求平均值，查标准曲线，计算效价。该
27、法比较简单，准确，日英美等国家药典收载，我国药典不收载。该法比较简单，准确，日英美等国家药典收载，我国药典不收载。第二节 抗生素效价微生物检定法三、扩散法三、扩散法 原理原理：该法是采用固体琼脂培养基，在融化后凝固前：该法是采用固体琼脂培养基，在融化后凝固前接入试验菌（多为细菌），倒平板。等凝固后，根据接入试验菌（多为细菌），倒平板。等凝固后，根据量反应平行线原理，用不同的试验设计方法，将供试量反应平行线原理，用不同的试验设计方法，将供试品和标准品接触于含菌的培养基表面，经培养后，由品和标准品接触于含菌的培养基表面，经培养后，由于抗生素向培养基内部扩散，凡抑菌浓度所达到的地于抗生素向培养基内部
28、扩散，凡抑菌浓度所达到的地方都没有细菌生长方都没有细菌生长“抑菌圈抑菌圈”。通过比较标准品和供。通过比较标准品和供试品抑菌圈的大小测定抗生素的效价。试品抑菌圈的大小测定抗生素的效价。第二节 抗生素效价微生物检定法分类：分类：垂直扩散法垂直扩散法平面扩散法平面扩散法 依靠总量扩散依靠总量扩散 纸片法纸片法 依靠浓度扩散依靠浓度扩散 管蝶法管蝶法管蝶法管蝶法是国际通用的抗生素效价测定法，为是国际通用的抗生素效价测定法，为各国药典所收各国药典所收载载，中国药典只收载管碟法。它灵敏度高，所需要样品少，中国药典只收载管碟法。它灵敏度高，所需要样品少，但是操作复杂，时间长，影响结果因素多，因此要从多个但是
29、操作复杂，时间长，影响结果因素多，因此要从多个环节加以严格控制，才能保证试验结果与真实值接近环节加以严格控制，才能保证试验结果与真实值接近.第二节 抗生素效价微生物检定法1.管蝶法测定效价的原理、操作及公式推导管蝶法测定效价的原理、操作及公式推导 原理原理：利用抗生素在摊布特定试验菌的琼脂培养基内：利用抗生素在摊布特定试验菌的琼脂培养基内扩散，形成一定浓度的含抗生素的球形区，抑制了试扩散，形成一定浓度的含抗生素的球形区，抑制了试验菌的生长繁殖而呈现出透明的抑菌圈，并且在一定验菌的生长繁殖而呈现出透明的抑菌圈，并且在一定的范围内，抗生素浓度对数剂量与抑菌圈面积或者直的范围内，抗生素浓度对数剂量与
30、抑菌圈面积或者直径成正比。在同样条件下，将同质的已知效价的标准径成正比。在同样条件下，将同质的已知效价的标准品溶液与未知效价的供试品溶液同时测定，标准品溶品溶液与未知效价的供试品溶液同时测定，标准品溶液与供试品溶液对一定试验菌所得到的剂量反应曲线液与供试品溶液对一定试验菌所得到的剂量反应曲线，在一定剂量范围内应互相平行。通过比较两者抑菌，在一定剂量范围内应互相平行。通过比较两者抑菌圈的面积或者直径，利用公式，求得供试品效价。圈的面积或者直径，利用公式，求得供试品效价。第二节 抗生素效价微生物检定法根据原理设计出根据原理设计出一剂量法（标准曲线法）：适用于实验室研究的初级一剂量法（标准曲线法）：
31、适用于实验室研究的初级阶段，因为本身误差大，不要求很准。阶段，因为本身误差大，不要求很准。二计量法：各国药典收载，常用于抗生素产品的效价二计量法：各国药典收载，常用于抗生素产品的效价测定，法定方法测定，法定方法 。三计量法：用于抗生素标准品效价的测定，准确度最三计量法：用于抗生素标准品效价的测定，准确度最高，操作最复杂。高，操作最复杂。美国药典美国药典收载三种方法，收载三种方法，中国药典中国药典 1985 1985 年年后仅收载后两种方法，并且均规定要对测定的数据进行后仅收载后两种方法，并且均规定要对测定的数据进行统计处理。统计处理。一剂量法一剂量法 二计量法二计量法 三计量法三计量法第二节
32、抗生素效价微生物检定法公式推导：公式推导：将不锈钢小管放置在摊布特定实验菌（检定菌）的琼将不锈钢小管放置在摊布特定实验菌（检定菌）的琼脂培养基平板上，当向小钢杯内滴加抗生素溶液后，抗脂培养基平板上，当向小钢杯内滴加抗生素溶液后，抗生素分子就随着溶剂向培养基内呈球形扩散。同时将培生素分子就随着溶剂向培养基内呈球形扩散。同时将培养基平板置于培养箱内养基平板置于培养箱内3737培养，试验菌开始繁殖。抗培养，试验菌开始繁殖。抗生素分子在琼脂培养基中的浓度随着离开小管的距离增生素分子在琼脂培养基中的浓度随着离开小管的距离增大而降低，当抗生素分子扩散到大而降低，当抗生素分子扩散到T T时间，这时琼脂培养基
33、时间，这时琼脂培养基内抗生素的浓度恰好等于该抗生素对试验菌的最小抑菌内抗生素的浓度恰好等于该抗生素对试验菌的最小抑菌浓度，试验菌的生长繁殖受到抑制而出现透明的抑菌圈。浓度，试验菌的生长繁殖受到抑制而出现透明的抑菌圈。在抑菌圈边缘处，琼脂培养基中所含有抗生素的浓度即在抑菌圈边缘处，琼脂培养基中所含有抗生素的浓度即为该抗生素对该试验菌的最小抑菌浓度。为该抗生素对该试验菌的最小抑菌浓度。第二节 抗生素效价微生物检定法2.二计量操作方法二计量操作方法1)1)标准品溶液的制备、保存标准品溶液的制备、保存 见药典附录见药典附录2)2)培养基及其制备方法培养基及其制备方法 见药典附录见药典附录3)3)采用的
34、检定菌采用的检定菌4)4)供试品溶液的制备按照各药品项下规定的溶剂溶解后，供试品溶液的制备按照各药品项下规定的溶剂溶解后，再按估计效价或标示量稀释至与标准品相当的浓度再按估计效价或标示量稀释至与标准品相当的浓度第二节 抗生素效价微生物检定法第二节 抗生素效价微生物检定法第二节 抗生素效价微生物检定法5 5）操作步骤：）操作步骤：管：不锈钢小管（内径管：不锈钢小管（内径6.0mm6.0mm0.1mm0.1mm，高，高10.0mm10.0mm0.1mm0.1mm，外径，外径7.8mm7.8mm0.1mm0.1mm），重量要求一致），重量要求一致，内外壁洁净，不得粘有其他抗生素。，内外壁洁净，不得粘
35、有其他抗生素。摊布底层培养基：融化后，倒入平皿中（直径约摊布底层培养基：融化后，倒入平皿中（直径约90mm90mm、高、高161617mm17mm）。底层）。底层20ml20ml，冷却凝固。，冷却凝固。摊布上层培养基：融化后，冷却至摊布上层培养基：融化后，冷却至45-5545-55（芽孢可至（芽孢可至6060），加入试验菌，倒入平皿中。菌层），加入试验菌，倒入平皿中。菌层5ml5ml，冷却凝，冷却凝固。固。放置不钢杯，滴加抗生素溶液与供试品溶液稀释液。放置不钢杯，滴加抗生素溶液与供试品溶液稀释液。第二节 抗生素效价微生物检定法 SH/SL=2:1 SH/SL=2:1 或者或者4 4：1 1；S
36、3/S2/S1=1S3/S2/S1=1：0.8:0.80.8:0.80.80.8 盖陶瓦盖：防止培养过程中水滴回落到培养基或者小管中盖陶瓦盖：防止培养过程中水滴回落到培养基或者小管中，3716-183716-18小时。小时。测量抑菌圈：手工或者抑菌圈测量仪测量抑菌圈的直径（测量抑菌圈：手工或者抑菌圈测量仪测量抑菌圈的直径（或面积）。或面积）。计算效价：带入公式计算，抑菌圈测量仪自动计算。计算效价：带入公式计算，抑菌圈测量仪自动计算。照生物检定统计法（附录照生物检定统计法（附录）中的（）中的（2.2 2.2）法进行可靠）法进行可靠性测验及效价计算。性测验及效价计算。本法计算所得效价，如低于估计效
37、价的本法计算所得效价，如低于估计效价的9090或高于估计效或高于估计效价的价的110110时时,则应调整其估计效价，予以重试。除另有规则应调整其估计效价，予以重试。除另有规定外，本法的可信限率不得大于定外，本法的可信限率不得大于5 5。第二节 抗生素效价微生物检定法要求要求：二剂量法标准品溶液的高浓度所致的抑菌圈直：二剂量法标准品溶液的高浓度所致的抑菌圈直径在径在181822mm22mm，三剂量法标准品溶液的中心浓度所致，三剂量法标准品溶液的中心浓度所致的抑菌圈直径在的抑菌圈直径在151518mm18mm。注意注意：不同的国家，同一种抗生素，使用的检定菌不：不同的国家，同一种抗生素，使用的检定
38、菌不完全相同。完全相同。三、影响管蝶法效价测定结果的因素及其控制三、影响管蝶法效价测定结果的因素及其控制1.影响抑菌圈形状的因素及控制影响抑菌圈形状的因素及控制出现抑菌圈破裂、不圆（椭圆或不正常形态），其原因：出现抑菌圈破裂、不圆（椭圆或不正常形态），其原因：稀释抗生素的缓冲液稀释抗生素的缓冲液PHPH值及盐浓度值及盐浓度 制备琼脂菌层时，加菌时培养基的温度制备琼脂菌层时，加菌时培养基的温度 测试用实验器材洁净程度测试用实验器材洁净程度 培养温度培养温度 其他其他第二节 抗生素效价微生物检定法1 1）稀释抗生素的缓冲液）稀释抗生素的缓冲液PHPH值及盐浓度值及盐浓度有些抗生素溶液，若有些抗生素
39、溶液，若PHPH值低或者盐浓度高，就会出现不显值低或者盐浓度高，就会出现不显抑菌圈或者呈椭圆或不正常形态，这可能是因为抗生抑菌圈或者呈椭圆或不正常形态，这可能是因为抗生素分子的解离状态发生了改变，从而抑菌作用受影响。素分子的解离状态发生了改变，从而抑菌作用受影响。四环素、链霉素都会出现这种现象。四环素、链霉素都会出现这种现象。2 2）制备琼脂菌层时，加菌时培养基的温度）制备琼脂菌层时，加菌时培养基的温度温度高，试验菌被烫死而造成无圈。解决办法：依据实验温度高，试验菌被烫死而造成无圈。解决办法：依据实验菌的生理特性，将融化的培养基放在不同温度的恒温菌的生理特性，将融化的培养基放在不同温度的恒温水
40、浴中，待温度平衡后，加入试验菌。水浴中，待温度平衡后，加入试验菌。3 3）测试用实验器材洁净程度测试用实验器材洁净程度如果测试用的玻璃平皿、小钢杯、镊子等先被抗生素污染，如果测试用的玻璃平皿、小钢杯、镊子等先被抗生素污染，可能出现抑菌圈不完整的现象。可能出现抑菌圈不完整的现象。第二节 抗生素效价微生物检定法4 4）培养温度）培养温度培养温度不均匀，造成试验菌生长快慢不均匀，抑菌圈不圆。培养温度不均匀，造成试验菌生长快慢不均匀，抑菌圈不圆。培养温度不均匀，抗生素的扩散系数不同，抑菌圈不圆。培养温度不均匀，抗生素的扩散系数不同，抑菌圈不圆。解决办法：培养箱内要温度均一，平皿放在同一层内，不要过解决
41、办法：培养箱内要温度均一，平皿放在同一层内，不要过多开启培养箱多开启培养箱 5 5）其他）其他抗生素滴加到小钢杯外，或者溅到小钢杯外，抑菌圈不圆。抗生素滴加到小钢杯外，或者溅到小钢杯外，抑菌圈不圆。小钢杯底部与培养基表面接触不严，漏液，抑菌圈不圆。小钢杯底部与培养基表面接触不严，漏液，抑菌圈不圆。小钢杯放置太近，抑菌圈扩散到一起，抑菌圈不圆。小钢杯放置太近，抑菌圈扩散到一起，抑菌圈不圆。平皿内培养基厚度不同，抑菌圈不圆。平皿内培养基厚度不同，抑菌圈不圆。第二节 抗生素效价微生物检定法第二节 抗生素效价微生物检定法2.影响抑菌圈边缘清晰度的因素及控制影响抑菌圈边缘清晰度的因素及控制抑菌圈不清楚，
42、模糊、不光滑、锯齿、双圈，其原因是：抑菌圈不清楚，模糊、不光滑、锯齿、双圈，其原因是：试验菌放置时间过长试验菌放置时间过长菌层中含菌量过低菌层中含菌量过低 培养基原材料的影响培养基原材料的影响 培养基培养基pHpH值及盐浓度的影响值及盐浓度的影响 培养时间的影响培养时间的影响 第二节 抗生素效价微生物检定法1 1）试验菌放置时间过长）试验菌放置时间过长试验菌放置时间过长，菌群内一些菌株生理特性有改变，试验菌放置时间过长，菌群内一些菌株生理特性有改变，如生长速度不同（有先长，后长），或者对抗生素敏感度如生长速度不同（有先长，后长），或者对抗生素敏感度不同，从而出现双圈，抑菌圈边缘不圆。这是由于不
43、同，从而出现双圈，抑菌圈边缘不圆。这是由于CC变化变化 r2r2改变（改变（lgM=1/9.21DTlgM=1/9.21DT*r2+lgC r2+lgC*4DTH4DTH）。）。解决办法解决办法：定期对实验菌纯化，试验菌必须是纯种的，使：定期对实验菌纯化，试验菌必须是纯种的，使其处于同一生理状态。在挑取单菌落的时候，球菌要取光其处于同一生理状态。在挑取单菌落的时候，球菌要取光滑型，芽孢杆菌挑取粗滑型，芽孢杆菌挑取粗慥慥型，传斜面。斜面培养好后，用型，传斜面。斜面培养好后，用无菌水洗下菌苔，过滤。芽孢要无菌水洗下菌苔，过滤。芽孢要60-6560-65处理处理3030分钟。镜检分钟。镜检观察，单个
44、菌分散度在观察，单个菌分散度在90%90%以上。以上。第二节 抗生素效价微生物检定法2 2）菌层中含菌量过低）菌层中含菌量过低抑菌圈边缘不清，含菌量高，抑菌圈太小，影响灵敏度。解抑菌圈边缘不清，含菌量高，抑菌圈太小，影响灵敏度。解决办法：在正式实验前，找出最适菌浓。决办法：在正式实验前，找出最适菌浓。解决办法解决办法：预实验预实验 3 3）培养基原材料的影响）培养基原材料的影响蛋白胨、酵母膏、琼脂等都能影响抑菌圈的大小与清晰度。蛋白胨、酵母膏、琼脂等都能影响抑菌圈的大小与清晰度。实验发现，蛋白胨选取鱼胨、骨胨、鸡肉胨要好于肉胨、蛋实验发现，蛋白胨选取鱼胨、骨胨、鸡肉胨要好于肉胨、蛋胨。酵母膏中
45、含有维生素胨。酵母膏中含有维生素B B，不仅影响试验菌的生长，还影响，不仅影响试验菌的生长，还影响某些抗生素的抗菌活性。如氯霉素效价测定，培养基中含有某些抗生素的抗菌活性。如氯霉素效价测定，培养基中含有维生素维生素B,B,抑菌圈较为清晰。琼脂的质量与加量能影响抑菌圈抑菌圈较为清晰。琼脂的质量与加量能影响抑菌圈的质量。不同琼脂的机械强度、凝固点、杂质种类和数量等的质量。不同琼脂的机械强度、凝固点、杂质种类和数量等等都不同，都会对试验菌的生长以及抗生素在琼脂培养基内等都不同，都会对试验菌的生长以及抗生素在琼脂培养基内的扩散系数，导致抑菌圈的模糊不清，不圆等现象。的扩散系数，导致抑菌圈的模糊不清，不
46、圆等现象。第二节 抗生素效价微生物检定法4 4）培养基）培养基pHpH值及盐浓度的影响值及盐浓度的影响调节培养基的调节培养基的PHPH或者适量增加盐浓度可以使抑菌圈清晰。或者适量增加盐浓度可以使抑菌圈清晰。如碱性抗生素在偏碱性的培养基和缓冲液中，抗菌活性强，如碱性抗生素在偏碱性的培养基和缓冲液中，抗菌活性强，抑菌圈清晰。抑菌圈清晰。如酸性抗生素在偏酸性的培养基和缓冲液中，抗菌活性强，如酸性抗生素在偏酸性的培养基和缓冲液中，抗菌活性强，抑菌圈清晰。抑菌圈清晰。庆大霉素、新霉素缓冲液中增加庆大霉素、新霉素缓冲液中增加3%3%的的NaClNaCl，使分子扩散加，使分子扩散加快，抑菌圈大而清晰。快，抑
47、菌圈大而清晰。第二节 抗生素效价微生物检定法5 5）培养时间的影响）培养时间的影响 不适当的延长双蝶的培养时间，使抑菌圈边缘不清不适当的延长双蝶的培养时间，使抑菌圈边缘不清，这是因为某些抗生素只是抑制试验菌的生长，当，这是因为某些抗生素只是抑制试验菌的生长，当继续培养时，细菌总量增加，抗生素随着时间的延继续培养时，细菌总量增加，抗生素随着时间的延长而降解，抑菌圈边缘的细菌便会向圈内生长，致长而降解，抑菌圈边缘的细菌便会向圈内生长，致使抑菌圈变小，边缘不清。使抑菌圈变小，边缘不清。3.标准品与供试品的质要相同标准品与供试品的质要相同效价计算公式是以标准品与供试品的质相同为前提推导效价计算公式是以
48、标准品与供试品的质相同为前提推导而来的，因此在操作的时候要确保这一点。而来的，因此在操作的时候要确保这一点。如标准品与供试品要相同，稀释用的缓冲液（如标准品与供试品要相同，稀释用的缓冲液（PHPH、盐浓度）要相同。盐浓度）要相同。如供试品中含有某种可能影响效价测定的杂质，那如供试品中含有某种可能影响效价测定的杂质，那么在标准品溶液中要相应的添加这种杂质，以抵消么在标准品溶液中要相应的添加这种杂质，以抵消影响。影响。如盐酸四环素制剂中含有维生素如盐酸四环素制剂中含有维生素C C，则标准品种也要，则标准品种也要添加维生素添加维生素C C第二节 抗生素效价微生物检定法4.抗生素最后稀释浓度与抑菌圈直
49、径的关系抗生素最后稀释浓度与抑菌圈直径的关系由公式由公式lgMlgM=1/9.21DT=1/9.21DTr r2 2+lgC+lgC44DTH DTH 得出，得出，抗生素最后稀释液的浓度与抑菌圈半径平方值之间在一抗生素最后稀释液的浓度与抑菌圈半径平方值之间在一定的剂量范围内呈直线关系（剂量反应直线）。为了简定的剂量范围内呈直线关系（剂量反应直线）。为了简化计算过程，常以直径代替半径平方来计算。如果供试化计算过程，常以直径代替半径平方来计算。如果供试品的效价估计不准，仍可用半径平方来计算，这样线性品的效价估计不准，仍可用半径平方来计算，这样线性范围宽一些。范围宽一些。如果抗生素在实验过程中，最后
50、稀释浓度发生变化（如如果抗生素在实验过程中，最后稀释浓度发生变化（如抗生素被破坏或被培养基中某些杂质吸附，被试验菌吸抗生素被破坏或被培养基中某些杂质吸附，被试验菌吸附等等），都能使计量反应直线的距离缩短。附等等），都能使计量反应直线的距离缩短。解决办法解决办法：调节稀释用的缓冲液：调节稀释用的缓冲液pHpH值、培养基值、培养基pHpH值、去值、去除某些杂质、选取灵敏度高的试验菌等除某些杂质、选取灵敏度高的试验菌等 第二节 抗生素效价微生物检定法5.直线的斜率与截率直线的斜率与截率由公式由公式lgMlgM=1/9.21DT=1/9.21DTr2+lgCr2+lgC44DTHDTH得出，如果斜率得
