1、LOGO 第四章 食品安全评价基本方法本章内容本章内容概述概述11.急性毒性试验及其评价急性毒性试验及其评价2.亚慢性和慢性毒性试验及其评价亚慢性和慢性毒性试验及其评价3.遗传毒性试验遗传毒性试验4.致癌致癌 试验试验5.生殖发育试验生殖发育试验 第一节第一节 急性毒性试验及其评价急性毒性试验及其评价急性毒性试验概述急性毒性试验概述急性毒性试验的目的急性毒性试验的目的急性毒性试验的主要参数急性毒性试验的主要参数急性毒性的试验方法急性毒性的试验方法急性毒性试验结果评价急性毒性试验结果评价第一节第一节 急性毒性试验及其评价急性毒性试验及其评价一、急性毒性试验概述一、急性毒性试验概述1.定义定义（1
2、）指机体（人或试验动物）指机体（人或试验动物）一次接触一次接触或或24h内多内多次接触化学物后在短期内（最长到次接触化学物后在短期内（最长到14d）所发生的）所发生的毒性效应。毒性效应。（2）一次接触一次接触经口经口和和注射注射接触，接触，“一次一次”指在瞬间将受指在瞬间将受试化学物输入实验动物体内；试化学物输入实验动物体内；经经呼吸道呼吸道吸入与经吸入与经皮肤皮肤接触，接触，“一次一次”指指在一个特定期间内实验动物持续地接触受在一个特定期间内实验动物持续地接触受试化学物的过程试化学物的过程第一节第一节 急性毒性试验及其评价急性毒性试验及其评价确定急性毒确定急性毒性评价参数性评价参数找出剂量找
3、出剂量-效应效应剂量剂量-反应关系反应关系试验目的试验目的AB为毒作用机制为毒作用机制研究提供线索研究提供线索D为后续试验的剂量为后续试验的剂量和观察指标选择提和观察指标选择提供依据供依据C二、急性毒性试验的试验目的二、急性毒性试验的试验目的第一节第一节 急性毒性试验及其评价急性毒性试验及其评价三、急性毒性试验的主要参数三、急性毒性试验的主要参数第一节第一节 急性毒性试验及其评价急性毒性试验及其评价三、急性毒性试验的主要参数三、急性毒性试验的主要参数1.ED50与与EC50（半数效应剂量或浓度）（半数效应剂量或浓度）指一次给予实验动物某种化学物质引起动物群体中指一次给予实验动物某种化学物质引起
4、动物群体中50%个体出现某种特殊效应的剂量。个体出现某种特殊效应的剂量。2.ATE（急性毒性估计值）（急性毒性估计值）同一受试物在不同实验室、不同动物之间，或在重同一受试物在不同实验室、不同动物之间，或在重复实验中获得的复实验中获得的LD50值有很大差异值有很大差异 对某些低毒或剧毒物质没必要准确确定对某些低毒或剧毒物质没必要准确确定LD50（LC50）便可对受试物毒性分级便可对受试物毒性分级 处于动物福利观念和节约资金、资源、时间和人力处于动物福利观念和节约资金、资源、时间和人力的观念。的观念。第一节第一节 急性毒性试验及其评价急性毒性试验及其评价1234以死亡和死以死亡和死亡率作为试亡率作
5、为试验终点和急验终点和急性毒性的评性毒性的评定参数；定参数；可以获得剂可以获得剂量量-效应效应/反反应曲线、曲应曲线、曲线的斜率、线的斜率、LD50及其可及其可信限等重要信限等重要参数；参数；实验动物用实验动物用量大；量大；是一种体内是一种体内试验方法。试验方法。四、急性毒性试验的试验方法四、急性毒性试验的试验方法1.经典急性毒性试验的特点经典急性毒性试验的特点第一节第一节 急性毒性试验及其评价急性毒性试验及其评价四、急性毒性试验的试验方法四、急性毒性试验的试验方法2.实验动物实验动物（1）动物物种选择）动物物种选择原则：实验动物接触受试物的毒性反应与原则：实验动物接触受试物的毒性反应与 人类
6、基本一致，并且对受试物最敏感人类基本一致，并且对受试物最敏感两种实验动物：两种实验动物：啮齿类动物：大鼠、小鼠、豚鼠、兔啮齿类动物：大鼠、小鼠、豚鼠、兔非啮齿类动物：狗、猴非啮齿类动物：狗、猴第一节第一节 急性毒性试验及其评价急性毒性试验及其评价四、急性毒性试验的试验方法四、急性毒性试验的试验方法2.实验动物实验动物（2）动物品系的选择）动物品系的选择 大鼠品系为大鼠品系为SD（sprague-dawley）和）和Wistar大鼠大鼠 小鼠品系为昆明种、小鼠品系为昆明种、NIH和和ICR（3）性别和年龄的选择）性别和年龄的选择 一般雌雄各半一般雌雄各半 一般选择初成年者一般选择初成年者动物动物
7、体重体重动物动物体重体重动物动物体重体重大鼠大鼠180240g家兔家兔22.5kg犬犬1012kg小鼠小鼠1825g豚鼠豚鼠200250g猫猫1.52kg第一节第一节 急性毒性试验及其评价急性毒性试验及其评价四、急性毒性试验的试验方法四、急性毒性试验的试验方法2.实验动物实验动物（4）实验动物数量和分组）实验动物数量和分组 一般分一般分57组，大、小鼠不少于组，大、小鼠不少于10只，家兔不少于只，家兔不少于8只，犬不少于只，犬不少于6只只 分组遵循随机原则分组遵循随机原则（5）动物饲养和管理）动物饲养和管理 动物在实验前应有动物在实验前应有12周周检疫观察期检疫观察期 适应饲料和环境适应饲料和
8、环境35d 染毒前禁食、空腹，大鼠和大型动物染毒前禁食、空腹，大鼠和大型动物隔夜隔夜禁食，禁食，小鼠禁食小鼠禁食4h左右，染毒后禁食左右，染毒后禁食24h。饮水不限。饮水不限。第一节第一节 急性毒性试验及其评价急性毒性试验及其评价v急性毒性试验的试验方法急性毒性试验的试验方法3.受试物处理和染毒途径受试物处理和染毒途径（2）染毒途径）染毒途径 经口经口染毒染毒 经呼吸经呼吸道染毒道染毒经皮肤经皮肤染毒染毒经注射经注射染毒染毒 染毒染毒途径途径第一节第一节 急性毒性试验及其评价急性毒性试验及其评价四、急性毒性试验的试验方法四、急性毒性试验的试验方法5.试验周期试验周期 14天为宜天为宜6.毒性观
9、察毒性观察 中毒症状中毒症状 死亡时间和数量死亡时间和数量 动物体重变化动物体重变化 病理学检查病理学检查 其他指标其他指标第一节第一节 急性毒性试验及其评价急性毒性试验及其评价四、急性毒性试验的试验方法四、急性毒性试验的试验方法7.试验设计与试验设计与LD50计算计算常用常用方法方法改良寇氏法改良寇氏法霍恩氏法霍恩氏法威尔氏法威尔氏法概率单位法概率单位法第一节第一节 急性毒性试验及其评价急性毒性试验及其评价五、急性毒性试验结果评价五、急性毒性试验结果评价1.分级标准分级标准第二节第二节 急性毒性试验及其评价急性毒性试验及其评价五、急性毒性试验结果评价五、急性毒性试验结果评价1.分级标准分级标
10、准我国工业毒物急性毒性分级标准我国工业毒物急性毒性分级标准急性毒性分级急性毒性分级小鼠小鼠1次经口次经口LD50/（mg/kg）小鼠吸入小鼠吸入2hLC50/（mg/m3）兔经皮兔经皮LD50/（mg/kg）剧毒剧毒105010高毒高毒11100515001150中等毒中等毒1011 0005015 00051500低毒低毒1 00110 0005 00150 0005015000微毒微毒10 00050 0005001第二节第二节 急性毒性试验及其评价急性毒性试验及其评价五、急性毒性试验结果评价五、急性毒性试验结果评价1.分级标准分级标准我国农药急性毒性分级标准我国农药急性毒性分级标准毒性分
11、级毒性分级经口经口LD50/(mg/kg)经皮经皮LD50/(mg/kg)，4h吸入吸入LD50/(mg/m3)，2h剧毒剧毒52020高毒高毒5502020020200中等毒中等毒5050020020002002000低毒低毒50020002000第二节第二节 亚慢性和慢性毒性试验及其结果评价亚慢性和慢性毒性试验及其结果评价 亚慢性和慢性毒性试验概述亚慢性和慢性毒性试验概述亚慢性和慢性毒性试验的目的亚慢性和慢性毒性试验的目的亚慢性和慢性毒性试验的方法亚慢性和慢性毒性试验的方法亚慢性和慢性毒性试验结果评价亚慢性和慢性毒性试验结果评价1234本节内容本节内容第二节第二节 亚慢性和慢性毒性作用和评
12、价亚慢性和慢性毒性作用和评价一、亚慢性毒性试验一、亚慢性毒性试验1.定义：指人或实验动物定义：指人或实验动物连续较长时间接触较大连续较长时间接触较大剂量的外源化学物所引剂量的外源化学物所引起的毒性效应。起的毒性效应。2.持续时间：实验动物寿持续时间：实验动物寿命的命的1/301/10，一般为，一般为3个月。个月。3.剂量与染毒：上限剂量剂量与染毒：上限剂量LD50，每次染毒剂量，每次染毒剂量及染毒时间相等。及染毒时间相等。二、慢性毒性试验二、慢性毒性试验1.定义：指实验动物或人定义：指实验动物或人长期（甚至终生）反复长期（甚至终生）反复接触外源化学物所产生接触外源化学物所产生的毒性效应。的毒性
13、效应。2.持续时间：啮齿类动物持续时间：啮齿类动物生命周期的绝大部分时生命周期的绝大部分时间或终生。间或终生。3.举例：小鼠举例：小鼠18个月，大个月，大鼠鼠24个月，其他动物一个月，其他动物一般为般为2年，特殊情况可长年，特殊情况可长达达710年。年。概述概述第二节第二节 亚慢性和慢性毒性作用和评价亚慢性和慢性毒性作用和评价一、亚慢性和慢性毒性试验的目的一、亚慢性和慢性毒性试验的目的确定受试物亚慢性和慢性毒性的效应谱确定受试物亚慢性和慢性毒性的效应谱，对在急性毒性试验中发现的毒作用提，对在急性毒性试验中发现的毒作用提供新信息，并发现以往未发现的毒作用供新信息，并发现以往未发现的毒作用 研究受
14、试物亚慢性和慢性毒作用的靶研究受试物亚慢性和慢性毒作用的靶器官器官研究受试物亚慢性和慢性毒性剂量研究受试物亚慢性和慢性毒性剂量-反应反应（效应）关系，确定其（效应）关系，确定其LOAEL和和NOAEL，提出安全限量参考值，提出安全限量参考值第二节第二节 亚慢性和慢性毒性作用和评价亚慢性和慢性毒性作用和评价一、亚慢性和慢性毒性试验的目的一、亚慢性和慢性毒性试验的目的研究受试物亚慢性和慢性毒性损害的研究受试物亚慢性和慢性毒性损害的可逆性可逆性亚慢性毒性试验为慢性毒性试验的剂亚慢性毒性试验为慢性毒性试验的剂量设计及观察指标的选择提供依据量设计及观察指标的选择提供依据确定不同动物物种对受试物亚慢性和慢
15、确定不同动物物种对受试物亚慢性和慢性毒效应的差异，为将毒性研究结果外性毒效应的差异，为将毒性研究结果外推到人提供依据推到人提供依据第二节第二节 亚慢性和慢性毒性作用和评价亚慢性和慢性毒性作用和评价二、亚慢性毒性试验方法二、亚慢性毒性试验方法1.实验动物的选择实验动物的选择2.染毒途径染毒途径3.剂量选择与分组剂量选择与分组4.观察指标观察指标一般指标一般指标生理生化指标生理生化指标病理学检查病理学检查特异性指标特异性指标中毒症状中毒症状动物体重动物体重食物利用率食物利用率尸检尸检脏器系数脏器系数组织学检查组织学检查第二节第二节 亚慢性和慢性毒性作用和评价亚慢性和慢性毒性作用和评价二、亚慢性毒性
16、试验方法二、亚慢性毒性试验方法1.实验动物的选择实验动物的选择（1）种系选择）种系选择（2）性别：一般雌雄各半）性别：一般雌雄各半（3）年龄）年龄 小鼠小鼠15g左右，大鼠左右，大鼠100g左右左右 组内体重差不超过平均体重的组内体重差不超过平均体重的10%;组间体重差不超过平均体重的组间体重差不超过平均体重的5%（4）数量）数量 小动物每组不少于小动物每组不少于20只，大动物每组只，大动物每组68只只 试验中期如果要处死动物则要相应增加数量试验中期如果要处死动物则要相应增加数量啮齿类动物啮齿类动物非啮齿类动物：犬非啮齿类动物：犬Beagle犬犬小白鼠：昆明种、小白鼠：昆明种、NIH或或ICR
17、大白鼠：大白鼠：Wistar、SD第二节第二节 亚慢性和慢性毒性作用和评价亚慢性和慢性毒性作用和评价二、亚慢性毒性试验方法二、亚慢性毒性试验方法2.染毒途径染毒途径（1）选择原则）选择原则（2）经口染毒）经口染毒 饲喂法：每日染毒，连续给予，饲喂法：每日染毒，连续给予，定时定量定时定量 灌胃和胶囊吞咽法：适用于有灌胃和胶囊吞咽法：适用于有异味、易挥发、易水解、易氧异味、易挥发、易水解、易氧化的受试物化的受试物（1）尽量模拟人类在环境中接触化合）尽量模拟人类在环境中接触化合 物的途径或方式物的途径或方式（2）与预期进行慢性毒性试验的接触）与预期进行慢性毒性试验的接触 途径相一致途径相一致第二节第
18、二节 亚慢性和慢性毒性作用和评价亚慢性和慢性毒性作用和评价二、亚慢性毒性试验方法二、亚慢性毒性试验方法3.剂量选择与分组剂量选择与分组（1）试验设组）试验设组 高剂量组、中剂量组、低剂量组、空白对照高剂量组、中剂量组、低剂量组、空白对照组组（2）剂量设计原则）剂量设计原则 高剂量组在试验期内既不发生死亡，又能引高剂量组在试验期内既不发生死亡，又能引起明显的毒性反应，或仅有个别动物死亡起明显的毒性反应，或仅有个别动物死亡（10%）中剂量组为观察到最小损害作用剂量中剂量组为观察到最小损害作用剂量（LOAEL）低剂量组为未观察到损害作用剂量（低剂量组为未观察到损害作用剂量（NOAEL）第二节第二节
19、亚慢性和慢性毒性作用和评价亚慢性和慢性毒性作用和评价二、亚慢性毒性试验方法二、亚慢性毒性试验方法3.剂量选择与分组剂量选择与分组（3）剂量设计依据）剂量设计依据 高剂量组：急性毒性试高剂量组：急性毒性试验的阈剂量，或验的阈剂量，或LD50的的1/201/5 中、低剂量组：以中、低剂量组：以310倍公比等比设计倍公比等比设计3组剂量组剂量 一般适宜设计范围为一般适宜设计范围为LD50的的1/101/80之间做之间做等比设计等比设计第二节第二节 亚慢性和慢性毒性作用和评价亚慢性和慢性毒性作用和评价二、亚慢性毒性试验方法二、亚慢性毒性试验方法4.观察指标观察指标（1）一般指标）一般指标 中毒症状：每
20、日观察实验动物出现的行为改变和中毒症状：每日观察实验动物出现的行为改变和客观征象的异常，出现的时间和先后次序客观征象的异常，出现的时间和先后次序 动物体重：每周称重，在上午的同一时间进行；动物体重：每周称重，在上午的同一时间进行；观察各组间差异是否有剂量观察各组间差异是否有剂量-反应关系反应关系 食物利用率食物利用率 定义：动物每食入定义：动物每食入100g饲料所增加的体重克数。饲料所增加的体重克数。若干扰物质吸收代谢，则食物利用率若干扰物质吸收代谢，则食物利用率，体重，体重；若不适口而降低食欲，则食物利用率不变，体重若不适口而降低食欲，则食物利用率不变，体重第二节第二节 亚慢性和慢性毒性作用
21、和评价亚慢性和慢性毒性作用和评价二、亚慢性毒性试验方法二、亚慢性毒性试验方法4.观察指标观察指标（2）生理生化指标）生理生化指标 血常规：红细胞数（血常规：红细胞数（RBC）、白细胞数（）、白细胞数（WBC）、）、血红蛋白量（血红蛋白量（Hb）、红细胞压积容量（）、红细胞压积容量（PCV）、）、白细胞分类数（白细胞分类数（DC）、血凝时间）、血凝时间 血液生化指标：血清总蛋白（血液生化指标：血清总蛋白（TG）、白蛋白）、白蛋白（ALB）、血糖（）、血糖（GLU）、血清尿素氮（）、血清尿素氮（BUN）、）、总胆红素（总胆红素（T-BIL）、肌酐（）、肌酐（Crea）、总胆固醇）、总胆固醇（T-C
22、HO）、总甘油三酯（）、总甘油三酯（TG）、）、LDL、VLDL、HDL、谷丙转氨酶（、谷丙转氨酶（SGPT）、谷草转氨酶）、谷草转氨酶（SGOT）、碱性磷酸酶（）、碱性磷酸酶（ALP）等）等 尿指标：外观、尿指标：外观、pH值、尿蛋白、尿糖、尿潜血等值、尿蛋白、尿糖、尿潜血等第二节第二节 亚慢性和慢性毒性作用和评价亚慢性和慢性毒性作用和评价二、亚慢性毒性试验方法二、亚慢性毒性试验方法4.观察指标观察指标（3）病理学检查）病理学检查 尸检尸检 脏器系数脏器系数 定义：又称脏定义：又称脏/体比值，指某个脏器湿重在每体比值，指某个脏器湿重在每100g体重中所占的质量。体重中所占的质量。举例：肝举例
23、：肝/体比，即（全肝湿重体比，即（全肝湿重/体重）体重）100 意义：增加则表明有充血、水肿、增生、肥大等意义：增加则表明有充血、水肿、增生、肥大等 减小则表明出现萎缩、退行性变化等减小则表明出现萎缩、退行性变化等 组织学检查组织学检查第二节第二节 亚慢性和慢性毒性作用和评价亚慢性和慢性毒性作用和评价二、亚慢性毒性试验方法二、亚慢性毒性试验方法4.观察指标观察指标（4）特异指标）特异指标 定义：指受试物对机体亚慢性毒性定义：指受试物对机体亚慢性毒性作用本质的特征性指标。作用本质的特征性指标。获得方法获得方法 （1）分析急性毒作用特征，初步发）分析急性毒作用特征，初步发现主要危害的组织系统或靶器
24、官，现主要危害的组织系统或靶器官，从而发现敏感或特异的指标从而发现敏感或特异的指标 （2）进行文献检索，参考一些化学）进行文献检索，参考一些化学物的某些特殊基团具有的特定毒性，物的某些特殊基团具有的特定毒性，利用其化学结构中的共性来选择亚利用其化学结构中的共性来选择亚慢性毒性指标慢性毒性指标第二节第二节 亚慢性和慢性毒性作用和评价亚慢性和慢性毒性作用和评价三、慢性毒性试验方法三、慢性毒性试验方法实验动物实验动物的选择的选择染毒染毒途径途径剂量选择与剂量选择与分组分组观察观察指标指标第二节第二节 亚慢性和慢性毒性作用和评价亚慢性和慢性毒性作用和评价三、慢性毒性试验方法三、慢性毒性试验方法1.实验
25、动物的选择实验动物的选择（1）种系选择）种系选择 啮齿类首选大鼠，非啮齿类选啮齿类首选大鼠，非啮齿类选犬和猴犬和猴（2）性别：一般雌雄各半）性别：一般雌雄各半（3）年龄）年龄 大鼠和小鼠为初断奶者大鼠和小鼠为初断奶者 小鼠小鼠3w，1012g；大鼠；大鼠34w，5070g；犬犬46 month（4）数量）数量 每组小动物每组小动物40只，大动物只，大动物8只只第二节第二节 亚慢性和慢性毒性作用和评价亚慢性和慢性毒性作用和评价三、慢性毒性试验方法三、慢性毒性试验方法2.染毒途径染毒途径 与人类接触途径相似，一般采用经口喂饲方法与人类接触途径相似，一般采用经口喂饲方法3.剂量设计与分组剂量设计与分
26、组慢性毒性试验剂量设计参考值慢性毒性试验剂量设计参考值参考剂量名称参考剂量名称亚慢性阈剂量亚慢性阈剂量LD50MTD高剂量高剂量1/51/21/101/2中剂量中剂量1/501/101/1001/4低剂量低剂量1/1001/1000_第二节第二节 亚慢性和慢性毒性作用和评价亚慢性和慢性毒性作用和评价三、慢性毒性试验方法三、慢性毒性试验方法4.观察指标观察指标（1）以亚慢性毒性试验的观察指标为基础，优先）以亚慢性毒性试验的观察指标为基础，优先采用亚慢性毒性试验筛选出来的敏感、特异指标。采用亚慢性毒性试验筛选出来的敏感、特异指标。（2）注意）注意 试验前对预计观察指标，尤其是生理生化指标进试验前对
27、预计观察指标，尤其是生理生化指标进行正常值测定，废弃个体差异大的动物行正常值测定，废弃个体差异大的动物 试验期间进行动态观察的各项指标应与对照组同试验期间进行动态观察的各项指标应与对照组同步测定步测定 所采用的各种化验方法应精确、可靠，且进行质所采用的各种化验方法应精确、可靠，且进行质量控制量控制（3）了解毒性反应的可逆程度）了解毒性反应的可逆程度第二节第二节 亚慢性和慢性毒性作用和评价亚慢性和慢性毒性作用和评价四、亚慢性和慢性毒性试验结果评价四、亚慢性和慢性毒性试验结果评价1.亚慢性毒性评价亚慢性毒性评价 试验中最敏感指标的试验中最敏感指标的NOAEL和和LOAEL（1）NOAEL小于人的可
28、能摄入量的小于人的可能摄入量的100倍，表倍，表示毒性较强，应予放弃；示毒性较强，应予放弃；（2）NOAEL大于大于100倍而小于倍而小于300倍，继续进行倍，继续进行慢性毒性试验；慢性毒性试验；（3）NOAEL大于或等于大于或等于300倍者，不必进行慢倍者，不必进行慢性试验，直接进行毒性评价。性试验，直接进行毒性评价。第二节第二节 亚慢性和慢性毒性作用和评价亚慢性和慢性毒性作用和评价四、亚慢性和慢性毒性试验结果评价四、亚慢性和慢性毒性试验结果评价2.慢性毒性评价慢性毒性评价 试验中最敏感指标的试验中最敏感指标的NOAEL和和LOAEL。计算慢性毒性作用带（计算慢性毒性作用带（Zch）（1）N
29、OAEL小于或等于人群的可能摄入量的小于或等于人群的可能摄入量的50倍者，表示毒性较强，应予放弃；倍者，表示毒性较强，应予放弃；（2）NOAEL大于大于50倍而小于倍而小于100倍，需相关专倍，需相关专家共同评议是否用于食品；家共同评议是否用于食品；（3）NOAEL大于或等于大于或等于100倍者，则予考虑允倍者，则予考虑允许使用于食品，并制定卫生标准。许使用于食品，并制定卫生标准。第三节第三节 食品中化学物质的致突变作用及评价食品中化学物质的致突变作用及评价12概述概述致突变作用的类型致突变作用的类型致突变作用的机制及后果致突变作用的机制及后果致突变作用的评价方法致突变作用的评价方法4321致
30、突变作用的评价方法致突变作用的评价方法v一、观察项目的选择一、观察项目的选择 1.1.观察的效应终点类型观察的效应终点类型 遗传学终点的分类遗传学终点的分类基因突变基因突变染色体畸变染色体畸变DNADNA损伤等其他遗传损伤的检测损伤等其他遗传损伤的检测致突变作用的评价方法致突变作用的评价方法v二、主要的致突变试验二、主要的致突变试验 1.1.基因突变检测方法基因突变检测方法微生物试验微生物试验哺乳动物细胞基因突变试验哺乳动物细胞基因突变试验果蝇伴性隐性致死试验果蝇伴性隐性致死试验转基因动物突变试验转基因动物突变试验 鼠伤寒沙门菌鼠伤寒沙门菌/组氨酸回复突变试验组氨酸回复突变试验（Ames试验）
31、试验）大肠杆菌大肠杆菌WP2回复突变试验回复突变试验 酵母菌正向酵母菌正向/回复突变试验回复突变试验致突变作用的评价方法致突变作用的评价方法v二、主要的致突变试验二、主要的致突变试验 1.1.基因突变检测方法基因突变检测方法 微生物试验微生物试验AmesAmes试验试验 指示微生物：指示微生物：鼠伤寒沙门菌组氨酸缺陷突变株鼠伤寒沙门菌组氨酸缺陷突变株 原理：原理：利用若干不同基因型的组氨酸缺陷型菌株，每个菌株利用若干不同基因型的组氨酸缺陷型菌株，每个菌株具有其独特的回复突变具有其独特的回复突变“靶点靶点”顺序，可以由不同类型的顺序，可以由不同类型的碱碱基置换基置换和和移码移码诱变剂诱发回复突变
32、。诱变剂诱发回复突变。鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌原养型（原养型（his+）正向突变正向突变回复突变回复突变组氨酸营养缺陷组氨酸营养缺陷性突变株（性突变株（his-）受试物受试物代谢活化系统代谢活化系统致突变作用的评价方法致突变作用的评价方法v二、主要的致突变试验二、主要的致突变试验 1.1.基因突变检测方法基因突变检测方法 微生物试验微生物试验AmesAmes试验试验这组检测菌株含有下列突变：这组检测菌株含有下列突变：组氨酸基因突变组氨酸基因突变 脂多糖屏障丢失脂多糖屏障丢失（rfa）：）：大分子待测物能穿透菌膜进大分子待测物能穿透菌膜进入菌体，从而抑制其生长，而野生型菌株则不受影响入菌体，
33、从而抑制其生长，而野生型菌株则不受影响 紫外线切除修复系统缺失紫外线切除修复系统缺失（uvrB）：）：紫外线照射后紫外线照射后不能生长不能生长 抗药性标抗药性标记记R：某些菌株具有抗氨苄青霉素的质粒，：某些菌株具有抗氨苄青霉素的质粒，提高检出的灵敏性，假若测试菌照常在氨苄青霉素提高检出的灵敏性，假若测试菌照常在氨苄青霉素/四环四环素平板上生长，则具有素平板上生长，则具有pAQI质质粒。粒。致突变作用的评价方法致突变作用的评价方法v二、主要的致突变试验二、主要的致突变试验 1.1.基因突变检测方法基因突变检测方法 微生物试验微生物试验AmesAmes试验试验致突变作用的评价方法致突变作用的评价方
34、法v二、主要的致突变试验二、主要的致突变试验 1.1.基因突变检测方法基因突变检测方法 微生物试验微生物试验AmesAmes试验试验活化系统活化系统S9S9混合液混合液 将一组雄性大鼠进行腹腔注射芳香族化合物（如将一组雄性大鼠进行腹腔注射芳香族化合物（如多氯联苯）油溶液等，以诱导肝脏酶系的活性，多氯联苯）油溶液等，以诱导肝脏酶系的活性，4d4d后后杀鼠取肝脏。杀鼠取肝脏。匀浆后匀浆后9000g9000g离心，所得的上清液（离心，所得的上清液（S9S9）加上）加上NADPNADP及葡萄糖及葡萄糖-6-6-磷酸等辅助因子即制成。磷酸等辅助因子即制成。致突变作用的评价方法致突变作用的评价方法v二、主
35、要的致突变试验二、主要的致突变试验 1.1.基因突变检测方法基因突变检测方法 微生物试验微生物试验AmesAmes试验试验优点优点 方法灵敏，检出率高，有约方法灵敏，检出率高，有约90%90%的化学致癌物都可获的化学致癌物都可获得阳性结果；方法简便、易行，不需特殊器材，容易推得阳性结果；方法简便、易行，不需特殊器材，容易推广。广。缺点缺点 微生物的微生物的DNADNA修复系统比哺乳动物简单，基因不如哺修复系统比哺乳动物简单，基因不如哺乳动物多，不能完全代表哺乳动物的实际情况。乳动物多，不能完全代表哺乳动物的实际情况。致突变作用的评价方法致突变作用的评价方法v二、主要的致突变试验二、主要的致突变
36、试验 1.1.基因突变检测方法基因突变检测方法 微生物试验微生物试验大肠杆菌大肠杆菌WP2WP2回复突变试验回复突变试验指示微生物：指示微生物：大肠杆菌的色氨酸缺陷型菌株大肠杆菌的色氨酸缺陷型菌株 原理：与原理：与Ames试验相似试验相似 检测诱变剂类型：碱基替换检测诱变剂类型：碱基替换 特点：特点：WP2 pKM101所能检测的诱变剂能够覆盖大量的所能检测的诱变剂能够覆盖大量的TA102特异诱变剂；特异诱变剂；WP2uurA/pKM101在诱变性检测上在诱变性检测上具有与具有与TA102一致敏感性，且对丙烯酸酯类衍生物和氯乙一致敏感性，且对丙烯酸酯类衍生物和氯乙酸酯类衍生物的遗传毒性检测具有
37、特异性。酸酯类衍生物的遗传毒性检测具有特异性。致突变作用的评价方法致突变作用的评价方法v二、主要的致突变试验二、主要的致突变试验 1.1.基因突变检测方法基因突变检测方法 微生物试验微生物试验酵母菌正向酵母菌正向/回复突变试验回复突变试验 可检测的类型：正向突变、回复突变、有丝分裂重组和可检测的类型：正向突变、回复突变、有丝分裂重组和非整倍体非整倍体4种类型种类型 缺点：很多具有遗传毒性的分子不能透过酵母菌的细胞缺点：很多具有遗传毒性的分子不能透过酵母菌的细胞膜，而不能达到膜，而不能达到DNA靶分子靶分子酵母的酵母的ADE1ADE1、ADE2ADE2菌株菌株少量腺嘌呤少量腺嘌呤的培养基的培养基
38、白色菌落白色菌落酵母的酵母的ADE1ADE1、ADE2ADE2突变菌株突变菌株少量腺嘌呤少量腺嘌呤的培养基的培养基红色菌落红色菌落嘌呤生物嘌呤生物合成阻滞合成阻滞致突变作用的评价方法致突变作用的评价方法v二、主要的致突变试验二、主要的致突变试验 1.基因突变检测方法基因突变检测方法 哺乳动物细胞基因突变试验哺乳动物细胞基因突变试验试验原理（如右图）试验原理（如右图）突变频率突变频率：指观察到的突变细胞：指观察到的突变细胞数与存活细胞数的比值。数与存活细胞数的比值。常用的试验方法常用的试验方法 小鼠淋巴瘤（小鼠淋巴瘤（L5178Y）细胞苷）细胞苷激酶位点（激酶位点（TK）突变检测）突变检测 中国
39、仓鼠卵巢（中国仓鼠卵巢（CHO）细胞及）细胞及中国仓鼠肺（中国仓鼠肺（V79）细胞次黄嘌呤）细胞次黄嘌呤-鸟嘌呤转磷酸核糖基酶位点（鸟嘌呤转磷酸核糖基酶位点（HGPRT）突变检测）突变检测细胞细胞+受试物受试物代谢活代谢活化系统化系统细胞传代细胞传代6-TG或或TFT形成集落形成集落未形成集落未形成集落计算计算突变频率突变频率以评价以评价受试物的致突变性受试物的致突变性6-TG：6-硫代鸟嘌呤；硫代鸟嘌呤；TFT：三氟胸腺：三氟胸腺致突变作用的评价方法致突变作用的评价方法v二、主要的致突变试验二、主要的致突变试验 1.1.基因突变检测方法基因突变检测方法 哺乳动物细胞基因突变试验哺乳动物细胞基
40、因突变试验 TK基因基因 位于常染色体位于常染色体 TK基因位点突变可反映基因位点突变可反映 HGPRT基因基因 位于位于X染色体，半合子状态，能被必需的基因隐蔽染色体，半合子状态，能被必需的基因隐蔽 应用受限：大范围的缺失、同源有丝分裂重组、染色应用受限：大范围的缺失、同源有丝分裂重组、染色体断裂和数目改变一般不表现出突变克隆增加体断裂和数目改变一般不表现出突变克隆增加基因突变基因突变基因缺失基因缺失基因转变基因转变基因易位基因易位有丝分裂重组有丝分裂重组致突变作用的评价方法致突变作用的评价方法v二、主要的致突变试验二、主要的致突变试验 1.1.基因突变检测方法基因突变检测方法 果蝇伴性隐性
41、致死试验果蝇伴性隐性致死试验优点：优点：果蝇体内对化学物的生物转化能力与哺乳动物相似果蝇体内对化学物的生物转化能力与哺乳动物相似，世代周期短、繁殖率高、饲养方便、经济、判断突变终，世代周期短、繁殖率高、饲养方便、经济、判断突变终点客观、不需活化等。点客观、不需活化等。缺点：缺点：与哺乳动物差异较大，染毒方式与剂量计算等都与与哺乳动物差异较大，染毒方式与剂量计算等都与哺乳动物试验不同。哺乳动物试验不同。结果判定：结果判定：阴性结果判定和外推要要慎重阴性结果判定和外推要要慎重致突变作用的评价方法致突变作用的评价方法v二、主要的致突变试验二、主要的致突变试验 1.1.基因突变检测方法基因突变检测方法
42、 果蝇伴性隐性致死试验果蝇伴性隐性致死试验原理：原理：隐性基因在伴性遗传中的交叉遗传性，即雄蝇的隐性基因在伴性遗传中的交叉遗传性，即雄蝇的X染染色体传给色体传给F1代雌蝇，又通过代雌蝇，又通过F1代传给代传给F2代雄蝇。代雄蝇。位于位于X染色体上的隐性基因能在半合型情况下于雄蝇染色体上的隐性基因能在半合型情况下于雄蝇中表现出来。中表现出来。利用眼色性状由利用眼色性状由X染色体上的基因决定，并与染色体上的基因决定，并与X染色染色体的遗传相关联的特征来作为观察在体的遗传相关联的特征来作为观察在X染色体上基因突染色体上基因突变的标记，以野生型雄蝇（红色圆眼）染毒，与变的标记，以野生型雄蝇（红色圆眼）
43、染毒，与Basc（Muller-5）雌蝇（淡杏色棒眼）交配。有隐性致死时，）雌蝇（淡杏色棒眼）交配。有隐性致死时，在在F2代中没有红色圆眼的雄蝇。代中没有红色圆眼的雄蝇。致突变作用的评价方法致突变作用的评价方法v二、主要的致突变试验二、主要的致突变试验 1.1.基因突变检测方法基因突变检测方法 转基因动物致突变检测转基因动物致突变检测转基因动物转基因动物：指基因组中整合有用实验方法导入的指基因组中整合有用实验方法导入的DNA，并能遗传给后代的一类动物。，并能遗传给后代的一类动物。常用动物常用动物：BigBlue小鼠，以大肠杆菌小鼠，以大肠杆菌LacI为靶基因；为靶基因；Muta-Mouse小鼠
44、，以大肠杆菌小鼠，以大肠杆菌LacZ为靶基因为靶基因 试验方法试验方法：染毒后先抽提不同器官或组织的基因组：染毒后先抽提不同器官或组织的基因组DNA，然后把纯化的基因组然后把纯化的基因组DNA与噬菌体体外包装抽提物混合，与噬菌体体外包装抽提物混合，而将导入的基因载体包装进噬菌体中。用这些噬菌体感染而将导入的基因载体包装进噬菌体中。用这些噬菌体感染大肠菌，可形成噬菌斑，通过噬菌斑颜色变化进行突变的大肠菌，可形成噬菌斑，通过噬菌斑颜色变化进行突变的判断并获得突变子。判断并获得突变子。致突变作用的评价方法致突变作用的评价方法v二、主要的致突变试验二、主要的致突变试验 2.2.染色体畸变试验染色体畸变
45、试验 染色体畸变分析试验染色体畸变分析试验啮齿类动物骨髓细胞染色体畸变试验啮齿类动物骨髓细胞染色体畸变试验啮齿类动物睾丸细胞染色体畸变试验啮齿类动物睾丸细胞染色体畸变试验体内试验体内试验体外试验体外试验CHO中国仓鼠卵巢细胞中国仓鼠卵巢细胞CHL中国仓鼠肺细胞中国仓鼠肺细胞V97细胞细胞外周血淋巴细胞外周血淋巴细胞致突变作用的评价方法致突变作用的评价方法v二、主要的致突变试验二、主要的致突变试验 2.2.染色体畸变试验染色体畸变试验 微核试验微核试验（MNT）微核微核：染色体的断片或者整条染色体在细胞分裂过程中：染色体的断片或者整条染色体在细胞分裂过程中未按正常程序进入细胞核而滞留在细胞质中的
46、染色质小未按正常程序进入细胞核而滞留在细胞质中的染色质小题。题。来源来源断片或无着丝粒染色体环在细胞分裂后期不能定向移断片或无着丝粒染色体环在细胞分裂后期不能定向移动，遗留在细胞质中动，遗留在细胞质中有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带着丝粒的染色有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带着丝粒的染色体环和断片在细胞分裂后期被留在细胞质中体环和断片在细胞分裂后期被留在细胞质中致突变作用的评价方法致突变作用的评价方法v二、主要的致突变试验二、主要的致突变试验 2.2.染色体畸变试验染色体畸变试验 微核试验微核试验（MNT）微核试验微核试验：通过观察受试物能够产生微核，并检出：通过观察受试物能够产生微核，并
47、检出DNADNA断断裂剂和非整倍体诱变剂的试验。裂剂和非整倍体诱变剂的试验。用于检测的细胞用于检测的细胞植物细胞植物细胞哺乳类动物细胞哺乳类动物细胞非哺乳类动物细胞非哺乳类动物细胞紫露草花粉母细胞紫露草花粉母细胞蚕豆根尖蚕豆根尖鱼红细胞鱼红细胞蟾蜍红细胞蟾蜍红细胞骨髓细胞、肝细胞骨髓细胞、肝细胞脾细胞、淋巴细胞脾细胞、淋巴细胞红细胞红细胞致突变作用的评价方法致突变作用的评价方法v二、主要的致突变试验二、主要的致突变试验 2.2.染色体畸变试验染色体畸变试验 微核试验（微核试验（MNT）体内试验体内试验：啮齿类动物骨髓多染红细胞微核试验：啮齿类动物骨髓多染红细胞微核试验成红细胞成红细胞排出主核排
48、出主核多染红细胞多染红细胞（PCEPCE）保持嗜碱保持嗜碱性性24h正染红细胞正染红细胞（NCENCE）外周血外周血微核留在微核留在胞浆中胞浆中致突变作用的评价方法致突变作用的评价方法v二、主要的致突变试验二、主要的致突变试验 2.2.染色体畸变试验染色体畸变试验 微核试验微核试验（MNT）啮齿类动物骨髓多染红细胞微核试验啮齿类动物骨髓多染红细胞微核试验剂量及分组剂量及分组实验动物选择：每组实验动物选择：每组8 8只，雌雄各半只，雌雄各半试验过程：染毒、处死、取骨髓、涂片、固定、染色试验过程：染毒、处死、取骨髓、涂片、固定、染色后，每鼠计数后，每鼠计数10001000个个PCEPCE的微核细胞
49、率的微核细胞率高剂量组：高剂量组：LD50/7的的80%低剂量组：低剂量组：LD50/7的的40%阴性对照组阴性对照组阳性对照组（环磷酰胺）阳性对照组（环磷酰胺）注：注：LD50/7为在为在7d使使50%动物死亡的剂量动物死亡的剂量致突变作用的评价方法致突变作用的评价方法v二、主要的致突变试验二、主要的致突变试验 2.2.染色体畸变试验染色体畸变试验 微核试验（微核试验（MNT）体外试验：细胞质分裂阻断法微核试验体外试验：细胞质分裂阻断法微核试验新进展：利用流式细胞仪和图像分析系统进行自动化新进展：利用流式细胞仪和图像分析系统进行自动化微核检测微核检测PBCCHLCHOV79细胞染毒细胞染毒培
50、养后期培养后期细胞松弛素细胞松弛素B B双核细胞双核细胞微核试验微核试验致突变作用的评价方法致突变作用的评价方法v二、主要的致突变试验二、主要的致突变试验 2.2.染色体畸变试验染色体畸变试验 显性致死试验显性致死试验显性致死突变显性致死突变：指生殖细胞染色体发生结构和数目异：指生殖细胞染色体发生结构和数目异常的遗传学损伤，此种损伤不影响受精，但可导致受精常的遗传学损伤，此种损伤不影响受精，但可导致受精卵在着床前死亡或胚胎的早期死亡。卵在着床前死亡或胚胎的早期死亡。剂量及分组剂量及分组三个处理组：最高剂量为三个处理组：最高剂量为LD50的的1/101/3阴性对照组阴性对照组阳性对照组阳性对照组
