1、第六章第六章 仪器分析仪器分析上海市医药学校上海市医药学校Office:Office:药物分析课题组药物分析课题组2模块一模块一 紫外分光光度法紫外分光光度法第二节第二节 分光光度法分光光度法学习内容：学习内容：v 理解比色法和分光光度法的基本原理；理解比色法和分光光度法的基本原理；v了解紫外分光光度计的基本原理了解紫外分光光度计的基本原理 v学会紫外分光光度计的保养；学会紫外分光光度计的保养；工作内容：工作内容：v规范操作规范操作722s分光光度计分光光度计v 规范操作规范操作755B紫外分光光度计紫外分光光度计3工作任务一工作任务一v使用使用722S722S型分光光度计测定高锰酸钾的吸收光
2、线型分光光度计测定高锰酸钾的吸收光线v使用使用722S722S型分光光度计测定高锰酸钾溶液的浓度型分光光度计测定高锰酸钾溶液的浓度 绘制标准曲线绘制标准曲线 测定未知样品的吸光度测定未知样品的吸光度 求算未知样品的浓度求算未知样品的浓度 思考题的讨论思考题的讨论 完成实训报告书完成实训报告书4任务一：任务一：722S722S型分光光度计的操作步骤型分光光度计的操作步骤v 开机、预热开机、预热 v 确定滤光片位置确定滤光片位置 本仪器备有减少杂散光，提高本仪器备有减少杂散光，提高340340380nm380nm波段光度准确性的滤光片，波段光度准确性的滤光片，位于样品室内侧，用一拨杆来改变位置。位
3、于样品室内侧，用一拨杆来改变位置。当测试波长在当测试波长在340340380nm380nm波段内如作高精度测试可将拨杆推向前，波段内如作高精度测试可将拨杆推向前，通常可不使用此滤光片，可将拨杆置在通常可不使用此滤光片，可将拨杆置在4004001000nm1000nm位置。位置。5v 调整波长调整波长 使用仪器上波长调节旋钮，即可方便地调整仪器当前测试波长，使用仪器上波长调节旋钮，即可方便地调整仪器当前测试波长，具体波长由旋钮左侧的显示窗显示，读波长数时目光垂直观察。具体波长由旋钮左侧的显示窗显示，读波长数时目光垂直观察。v 调整功能键调整功能键 TRANS.TRANS.透射比透射比 ABS.A
4、BS.吸光度吸光度 FACT.FACT.浓度因子浓度因子 CONC.CONC.浓度直读浓度直读任务一：任务一：722S722S型分光光度计的操作步骤型分光光度计的操作步骤6v 调整透光率调整透光率 功能键放置于功能键放置于“T T”调调100%100%：将用作背景的空白样：将用作背景的空白样品置入样品室光路中盖下试样品置入样品室光路中盖下试样盖（同时打开光门），按下盖（同时打开光门），按下“100%T100%T”键即能自动调整键即能自动调整100%T100%T（一次有误差时可加按一（一次有误差时可加按一次）。次）。调调0%0%：打开试样盖（关闭光门：打开试样盖（关闭光门）或用不透光材料在样品室
5、中）或用不透光材料在样品室中遮断光路，然后按遮断光路，然后按“0%0%”键，键，即能自动调整零位。即能自动调整零位。任务一：任务一：722S722S型分光光度计的操作步骤型分光光度计的操作步骤7v 测定吸光度测定吸光度 功能键放置于功能键放置于“A A”改变试样槽位置让不同样品进入光路改变试样槽位置让不同样品进入光路 仪器标准配置中试样槽架是四位置的，用仪器前面的仪器标准配置中试样槽架是四位置的，用仪器前面的试样槽拉杆来改变，打开样品室盖以便观察样品槽中试样槽拉杆来改变，打开样品室盖以便观察样品槽中的样品位置最靠近测试者的为的样品位置最靠近测试者的为“0 0”位置，依次向外拉位置，依次向外拉出
6、相应的为出相应的为“1 1”“”“2 2”“”“3 3”位置，当拉杆到位时有定位置，当拉杆到位时有定位感，到位时请前后轻轻推动一下以确定定位正确。位感，到位时请前后轻轻推动一下以确定定位正确。读取数值并记录。读取数值并记录。任务一：任务一：722S722S型分光光度计的操作步骤型分光光度计的操作步骤8任务二：吸收光谱曲线的绘制任务二：吸收光谱曲线的绘制教师演示教师演示v 标准溶液的配制标准溶液的配制 准确称取高锰酸钾（基准）准确称取高锰酸钾（基准）0.125g,0.125g,在小烧杯中溶解，定量移入在小烧杯中溶解，定量移入1000mL1000mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀。容量瓶中，加
7、蒸馏水稀释至刻度，摇匀。v 试样准备试样准备 吸取上述标准溶液吸取上述标准溶液20mL20mL于于50mL50mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀v 测定测定 1cm1cm比色皿，以蒸馏水作空白比色皿，以蒸馏水作空白 波长选择：波长选择：450450、460460、480480、500500、520520、525525（此处多选几点）、（此处多选几点）、530530、540540、560560、580580、600600 分别测定个波长下的吸光度分别测定个波长下的吸光度A A。v 绘制吸收光谱曲线绘制吸收光谱曲线 以波长为横坐标，以吸收度为纵坐标，绘制曲线以
8、波长为横坐标，以吸收度为纵坐标，绘制曲线 找出最大波长找出最大波长maxmax。0(nm)525A9任务三：标准曲线的绘制任务三：标准曲线的绘制学生分组实训学生分组实训v标准系列溶液标准系列溶液 取取6 6只只25ml25ml的容量瓶，分别精密加入高锰酸钾标准溶液的容量瓶，分别精密加入高锰酸钾标准溶液0.000.00、1.001.00、2.002.00、3.003.00、4.004.00、5.00ml,5.00ml,加蒸馏水稀释加蒸馏水稀释至刻度，摇匀至刻度，摇匀v测定测定 波长选定为波长选定为maxmax，以以1 1号为空白号为空白 依次测定依次测定2 26 6号标准系列比色液的吸光度号标准
9、系列比色液的吸光度A A值。值。v绘制标准曲线绘制标准曲线 以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。准曲线。10任务四：样品的测定任务四：样品的测定学生分组实训学生分组实训v样品试液的配制样品试液的配制 取取1 1只只25ml25ml的容量瓶，精密加入高锰酸钾样品液的容量瓶，精密加入高锰酸钾样品液5.00ml,5.00ml,（约含（约含KMnOKMnO4 40.5mg0.5mg）,加蒸馏水稀释至刻度，摇匀。加蒸馏水稀释至刻度，摇匀。v测定吸光度测定吸光度 在相同条件下，测定样品的吸光度在相同条件下，测定样品的吸光度v计算计算 从标准曲线上查出相应浓度
10、的从标准曲线上查出相应浓度的KMnOKMnO4 4 浓度，即为样品比色液的浓度。浓度，即为样品比色液的浓度。11概述概述v光谱分析光谱分析含义：根据物质对光的选择性吸收及光的吸收定律含义：根据物质对光的选择性吸收及光的吸收定律对物质进行定性和定量分析的分析方法。对物质进行定性和定量分析的分析方法。分类：比色法、分光光度法分类：比色法、分光光度法v比色法比色法含义：比色分析法（简称比色法）就是通过比较有含义：比色分析法（简称比色法）就是通过比较有色物质溶液颜色深浅测定物质含量的分析方法。色物质溶液颜色深浅测定物质含量的分析方法。分类：目视比色法、光电比色法分类：目视比色法、光电比色法12v目视比
11、色法目视比色法 标准系列比色液标准系列比色液 样品液与标准液比色样品液与标准液比色概述概述一致一致13v 分光光度法分光光度法 含义：含义：根据物质对一定波长光线的吸收程度已确定物质含量的分析根据物质对一定波长光线的吸收程度已确定物质含量的分析方法。运用棱镜或光栅作为分光器，用光电管和检流计测量溶液透方法。运用棱镜或光栅作为分光器，用光电管和检流计测量溶液透射光的强度，并直接表示出透光率和吸收度，从而求得被测液浓度射光的强度，并直接表示出透光率和吸收度，从而求得被测液浓度或含量。或含量。分类：紫外可见分光光度法、红外分光光度法分类：紫外可见分光光度法、红外分光光度法一、概述一、概述14一、比色
12、法和分光光度法特点一、比色法和分光光度法特点v灵敏度高灵敏度高 适用于测量微量物质，最低浓度为适用于测量微量物质，最低浓度为1010-5-5-10-10-7-7mol/Lmol/L，v有一定的准确度有一定的准确度 比色法相对误差为比色法相对误差为5-20%5-20%，分光光度法的相对误差为，分光光度法的相对误差为2%-5%2%-5%v操作简便，测定快速操作简便，测定快速 只需要几分钟到十几分钟，甚至更短只需要几分钟到十几分钟，甚至更短v应用范围广应用范围广 几乎所有的无机离子和许多有机化合物均可直接或几乎所有的无机离子和许多有机化合物均可直接或间接地用比色法或分光光度法测定间接地用比色法或分光
13、光度法测定15二、比色法和分光光度法的原理二、比色法和分光光度法的原理比色法和分光光度法的依据是物质对光的选择吸收比色法和分光光度法的依据是物质对光的选择吸收v 光的基本性质光的基本性质光的波长与其能量或频率成反比关系光的波长与其能量或频率成反比关系 光的波长越短，频率或能量越高光的波长越短，频率或能量越高光的波长越长，频率或能量越低光的波长越长，频率或能量越低波粒二象性波粒二象性ChhEE光子的能量；h普朗克常数；C光的传播速度光的频率，Hz；光的波长，nm16二、比色法和分光光度法的原理二、比色法和分光光度法的原理v 常用波长来表示各种不同的电磁辐射常用波长来表示各种不同的电磁辐射v 人眼
14、睛能觉察到的波段称为可见光，波长范围人眼睛能觉察到的波段称为可见光，波长范围400-400-760nm760nmv 红外线红外线(760nm)(760nm)、紫外线（、紫外线（400nm400nm）、）、X X射线射线v 按照电磁波波长大小顺序可把电磁波划分成几个区按照电磁波波长大小顺序可把电磁波划分成几个区域，叫做光谱区域，由各光谱区域按顺序排成的系域，叫做光谱区域，由各光谱区域按顺序排成的系列叫做列叫做电磁波谱电磁波谱17电磁波谱电磁波谱181.1.光的性质光的性质v 单一波长的光称为单色光单一波长的光称为单色光v 由不同波长的光混合而成的光称为由不同波长的光混合而成的光称为复复合光合光v
15、 让一束白光通过棱镜，可分解为红、让一束白光通过棱镜，可分解为红、橙、黄、绿、青、蓝、紫七种颜色的橙、黄、绿、青、蓝、紫七种颜色的光，这种现象称为光，这种现象称为光的色散光的色散v 将两种适当颜色的单色光按一定强度将两种适当颜色的单色光按一定强度比例混合可成为白光，这两种单色光比例混合可成为白光，这两种单色光称为称为互补色光互补色光。19互补色光互补色光202.2.吸收光谱吸收光谱v 吸收光谱曲线吸收光谱曲线v 将不同波长的单色光依次通过一定浓度的溶液，测量每一将不同波长的单色光依次通过一定浓度的溶液，测量每一波长下溶液对各种单色光的吸收程度（吸收度波长下溶液对各种单色光的吸收程度（吸收度A
16、A），然后），然后以波长（以波长（）为横坐标、吸收度（）为横坐标、吸收度（A A）为纵坐标作图，即）为纵坐标作图，即得一吸收光谱曲线。得一吸收光谱曲线。v 吸收度最大处所对应的波长称为最大吸收波长，吸收度最大处所对应的波长称为最大吸收波长，maxmax物质吸收不同波长的光的特性物质吸收不同波长的光的特性只与溶液中只与溶液中物质的结构有关物质的结构有关,与溶液的与溶液的浓度无关浓度无关.不同物质的光谱曲线不同不同物质的光谱曲线不同吸收光谱曲线作为定性的依据吸收光谱曲线作为定性的依据A/nm525021 将不同波长的单色光依将不同波长的单色光依次通过一定浓度的溶液，次通过一定浓度的溶液，测量每一波
17、长下溶液对测量每一波长下溶液对各种单色光的吸收程度各种单色光的吸收程度（A A），以波长（），以波长（）为）为横坐标，吸光度为纵坐横坐标，吸光度为纵坐标得到的一条曲线。标得到的一条曲线。浓度越大，吸收峰越高无关与溶液浓度Cmax峰谷吸收光谱曲线吸收光谱曲线max22LI0ItIa I I0 0=I=Ia a+I+It t透光率透光率吸光度吸光度%1000IITtTATAlg 1lg或或3.3.光的吸收定律光的吸收定律23朗伯朗伯-比尔定律比尔定律v 含义含义 当一束平行的单色光通过当一束平行的单色光通过均匀、无散射均匀、无散射现象的溶液时，在单色光强度、溶现象的溶液时，在单色光强度、溶液温度等
18、条件不变的情况下，溶液的吸光度与溶液的液温度等条件不变的情况下，溶液的吸光度与溶液的浓度浓度和液层的和液层的厚度厚度的乘积成正比的乘积成正比。v 应用范围应用范围 适用于适用于单色光单色光和和一定范围的一定范围的低低浓度浓度溶液溶液 溶液浓度过大，透光性质发生变化，吸光度与浓度不成正比关系溶液浓度过大，透光性质发生变化，吸光度与浓度不成正比关系 波长较宽的混合光影响光的互补吸收，也会使测定产生误差波长较宽的混合光影响光的互补吸收，也会使测定产生误差A=KcL24吸收系数吸收系数(K)(K)也称吸光系数也称吸光系数v百分吸收系数（比吸收系数）百分吸收系数（比吸收系数）v摩尔吸收系数摩尔吸收系数
19、=v=A=K c L=c(g/100mL)L(cm)AA c(mol/L)L(cm)10M浓度为浓度为1%(g/100mL)的溶液的溶液厚度为厚度为1cm时的吸光度，时的吸光度，单位是单位是mL/(gcm)浓度为浓度为1mol/L的溶液的溶液厚度为厚度为1cm时的吸光度，时的吸光度，单位是单位是L/(molcm)25v吸收系数在一定条件下是常数吸收系数在一定条件下是常数v与入射光的波长、物质的性质、溶剂、温度及仪与入射光的波长、物质的性质、溶剂、温度及仪器的质量等因素有关器的质量等因素有关v数值越大，表明有色溶液对光越容易吸收，测定数值越大，表明有色溶液对光越容易吸收，测定的灵敏度越高的灵敏度
20、越高v一般一般值在值在10103 3以上，即可进行分光光度测定以上，即可进行分光光度测定v吸收系数是定性和定量分析的重要依据吸收系数是定性和定量分析的重要依据26应用应用v氯霉素（氯霉素（M=323.15g/molM=323.15g/mol）的水溶液，在）的水溶液，在278nm278nm处有最处有最大吸收，设用纯品配制大吸收，设用纯品配制100mL100mL含氯霉素含氯霉素2.00mg2.00mg的溶液的溶液，以，以1cm1cm的吸收池，在的吸收池，在278nm278nm处测得吸光度为处测得吸光度为0.6140.614，求求和和v有一浓度一定的溶液，用有一浓度一定的溶液，用1cm1cm吸收池进
21、行测定时，其吸收池进行测定时，其透光率为透光率为60%60%，若改用，若改用2cm2cm的吸收池进行测定，求其吸的吸收池进行测定，求其吸光度和透光率光度和透光率v有一浓度为有一浓度为2.52.51010-4-4mol/Lmol/L的的KMnOKMnO4 4溶液在溶液在525nm525nm的摩的摩尔吸收系数为尔吸收系数为32003200，当吸收池的厚度为，当吸收池的厚度为1cm1cm时，计算时，计算其吸光度及透光率各为多少？其吸光度及透光率各为多少？271 1、标准曲线法、标准曲线法CALCKA样样样样同上条件同上条件固定条件固定条件查得查得测定测定曲线曲线作作分别测定分别测定CACAA 前提前
22、提固定条件固定条件光强度、溶液温度等光强度、溶液温度等K不变不变统一溶液的厚度统一溶液的厚度L不变不变过程：过程：配制标准系列配制标准系列 样品样品28例：例：芦丁含量测定芦丁含量测定（1 1）分别移取）分别移取0.2000mg/mL0.2000mg/mL的标样的标样 0 05mL25mL5mL25mL（2 2）取样品）取样品3.0mg25mL3.0mg25mL29学习小结学习小结通过本课程的学习，你将掌握如下内容了吗？通过本课程的学习，你将掌握如下内容了吗？v光谱分析法的含义及分类光谱分析法的含义及分类v分光光度法的原理分光光度法的原理v朗伯朗伯-比尔定律的计算（一）比尔定律的计算（一）作业：作业：第第128128页：页：1 1、2 2、3 3、4 4、7 7、8 8、
