1、实验实验 食品中大肠菌群的测定食品中大肠菌群的测定(MPN(MPN法法)参考 GB47893-2010食品安全国家标准大肠菌群MPN计数法xx职业技术学院生物工程学院职业技术学院生物工程学院农产品质量检测教研室农产品质量检测教研室 xx回顾相关知识回顾相关知识v 1 1、什么叫大肠菌群？、什么叫大肠菌群？食品中大肠菌群计食品中大肠菌群计数的卫生学意义是什么？数的卫生学意义是什么？v 2 2、什么是大肠菌群、什么是大肠菌群MPNMPN计数法？计数法？v 大肠菌群是指一群在一定培养条件下可发酵乳大肠菌群是指一群在一定培养条件下可发酵乳糖糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢、产酸产气的需氧和
2、兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。杆菌。v 该菌主要来源自人畜粪便，作为粪便污染指标该菌主要来源自人畜粪便，作为粪便污染指标评价食品卫生质量，具有广泛的卫生学意义。评价食品卫生质量，具有广泛的卫生学意义。v MPNMPN是对样品中活菌浓度的一种估计数。采用是对样品中活菌浓度的一种估计数。采用“逐级稀释至无菌逐级稀释至无菌”的方法进行。具体做法是对的方法进行。具体做法是对样品做连续系列稀释，接种于装有液体培养基的样品做连续系列稀释，接种于装有液体培养基的试管中培养，按照阳性管的管数和稀释度，对原试管中培养，按照阳性管的管数和稀释度，对原始样品中的被检菌作统计学估计。始样品中的被检菌作统计学估计。v
3、食品中大肠菌群数以每食品中大肠菌群数以每g g（mLmL）样品中大肠菌）样品中大肠菌群的最可能数来表示，即为大肠菌群群的最可能数来表示，即为大肠菌群MPNMPN值。值。一、实验目的一、实验目的v巩固食品中大肠菌群计数的卫生学意义巩固食品中大肠菌群计数的卫生学意义v掌握掌握MPNMPN计数法检验食品中大肠菌群的原理和计数法检验食品中大肠菌群的原理和方法方法vMPNMPN计数法包括计数法包括初发酵试验初发酵试验和和复发酵试验复发酵试验。v初发酵试验：利用大肠菌群能发酵乳糖产初发酵试验：利用大肠菌群能发酵乳糖产酸产气的原理。酸产气的原理。v复发酵试验：复发酵试验：牛胆粉和煌绿抑制非肠杆菌牛胆粉和煌绿
4、抑制非肠杆菌科细菌科细菌，再次进行乳糖发酵试验，经，再次进行乳糖发酵试验，经48h48h培培养产酸产气的，最终确定为大肠菌群阳性养产酸产气的，最终确定为大肠菌群阳性结果。结果。二、实验原理二、实验原理1 1、培养基：月桂基硫酸盐胰蛋白胨（、培养基：月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LSTLST）肉汤、煌绿乳糖）肉汤、煌绿乳糖胆盐（胆盐（BGLBBGLB）肉汤）肉汤2 2、仪器或其他用具：电子天平（感量、仪器或其他用具：电子天平（感量0.1g0.1g）、无菌不锈钢）、无菌不锈钢勺、无菌称量纸、无菌吸管（勺、无菌称量纸、无菌吸管（1 mL1 mL和和25 mL25 mL）、试管、三）、试管、三角瓶、无菌生理盐
5、水（角瓶、无菌生理盐水（9mL/9mL/管，管，225mL/225mL/三角瓶内含适量玻三角瓶内含适量玻璃珠）、无菌璃珠）、无菌1 mol/L NaOH1 mol/L NaOH、无菌、无菌1 mol/L HCl1 mol/L HCl、75%75%酒精酒精棉球、广口瓶、灭菌剪刀、灭菌镊子、酒精灯、精密棉球、广口瓶、灭菌剪刀、灭菌镊子、酒精灯、精密pH pH 试纸、恒温培养箱、高压灭菌锅、均质器、振荡器、接种试纸、恒温培养箱、高压灭菌锅、均质器、振荡器、接种环等。环等。四、实验器材四、实验器材 检样检样稀释稀释月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）36，24482h 不产气不
6、产气产气产气煌绿乳糖胆盐肉汤（煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）36，24482h 不产气不产气产气产气大肠菌群阴性大肠菌群阴性大肠菌群阳性大肠菌群阳性报告报告大肠菌群检验程图大肠菌群检验程图（新国标（新国标MPN法）法）五、实验步骤五、实验步骤1 1、样品处理：、样品处理：v固体和半固体食品：以无菌操作取固体和半固体食品：以无菌操作取25g样品，放入装样品，放入装有有225 mL生理盐水的三角瓶中，充分振荡，制成生理盐水的三角瓶中，充分振荡，制成1:10样品匀液无菌均质杯或无菌均质袋内，于样品匀液无菌均质杯或无菌均质袋内，于8000 r/min均质均质1min2min，制成，制成1:10样品匀液。
7、样品匀液。1 1、样品处理：、样品处理：v液体食品：以无菌吸管吸取样品液体食品：以无菌吸管吸取样品25mL放入装有放入装有225mL生理盐水的无菌玻璃瓶（瓶内预置适当数量生理盐水的无菌玻璃瓶（瓶内预置适当数量的玻璃珠）中，以的玻璃珠）中，以30cm幅度、于幅度、于7s内振摇内振摇25次（或次（或以机械振荡器振摇）以机械振荡器振摇）,制成制成1:10的样品匀液。的样品匀液。2 2、样品样品稀释稀释：1:1025g/ml样品1ml1ml1ml1:1001:1000 1:10000生理盐水注意：吸管尖端不要触及稀释液面，每递增稀释注意：吸管尖端不要触及稀释液面，每递增稀释1 1 次，换用次，换用1
8、1 支支1m1mL L无菌吸管。从制备样品匀液至样无菌吸管。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过品接种完毕，全过程不得超过15 min 15 min。3 3、初发酵初发酵试验：试验：记录在记录在24h24h和和48h48h内产气的内产气的LSTLST肉汤管数。未产气者肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。LST不产气（不产气（-）小导管里无气泡小导管里无气泡4 4、复发酵试验：、复发酵试验：注意：以注意：以48h48h2h2h为最终观察结果时限。为最终观察结果时限。结果也以此时为最终结果。结果也以此时为最终结果。LST产气（产
9、气（+）将产气的试管内将产气的试管内样品接种到样品接种到BGLB肉汤肉汤05 5、大肠菌群最可能数（、大肠菌群最可能数（MPNMPN）的报告：）的报告：根据经确证后的大肠菌群根据经确证后的大肠菌群LSTLST 阳性管数查阳性管数查MPNMPN表表，报告每报告每g g（mLmL）样品中大肠菌群）样品中大肠菌群MPNMPN值。值。1g(mL)检样中最大可能数（检样中最大可能数（MPN）表）表-4201100333948.7272124,1001801100233424.5201122,00090460133423.7150121,00042240033424.5202021,00090290323
10、423.61410243040210223381.49.200242037150123424.5160314201893023424.51512142040160313423.61102142037120213383.6111112001775113201.37.4011180943013383.6112011801764203181.37.21011108.738103180.173.6001944.623003383.69.4030948.736132181.26.2020948.729032181.26.1110948.735222110.153.0010948.7281229.60.1
11、53.0100424.5210229.5-3.0000高高低低0.0010.010.10高高低低0.0010.010.1095%置信区间置信区间MPN阳性管数阳性管数95%置信区间置信区间MPN阳性管数阳性管数六、实验结果与分析六、实验结果与分析v经查经查MPNMPN表，样品中大肠菌群数为表，样品中大肠菌群数为 MPN/gMPN/g（mLmL）阳性管数0.100.010.001LST发酵管BGLB证实管分析分析一些主要食品卫生指标（微生物）一些主要食品卫生指标（微生物）食品种类食品种类细菌个数细菌个数/mL（g）大肠菌群大肠菌群MPN致病菌致病菌酱类、醋类酱类、醋类500030，醋不得检出，醋
12、不得检出不得检出不得检出腐乳类、豆豉、酱腐乳类、豆豉、酱菜类菜类30不得检出不得检出豆腐干、豆腐、豆豆腐干、豆腐、豆腐干腐干5000070不得检出不得检出凉粉凉粉50030不得检出不得检出消毒牛乳、甜炼乳消毒牛乳、甜炼乳3000040不得检出不得检出全脂奶粉全脂奶粉500040不得检出不得检出瓶装汽水、果汁饮瓶装汽水、果汁饮料料1005不得检出不得检出全啤酒全啤酒100050不得检出不得检出发酵酒（熟啤酒、发酵酒（熟啤酒、黄酒、葡萄酒）黄酒、葡萄酒）503不得检出不得检出罐头制品、微生物指标规定无致病菌及微生物引起的腐败现象罐头制品、微生物指标规定无致病菌及微生物引起的腐败现象七、实验思考七、实验思考v1.MPN1.MPN计数法测定食品中大肠菌群数与计数法测定食品中大肠菌群数与实际值相等吗？为什么？实际值相等吗？为什么？v2.2.大肠菌群的检验为什么要经过复发酵大肠菌群的检验为什么要经过复发酵才能证实？才能证实？v3.3.当实验结果在当实验结果在MPNMPN表中无法查到表中无法查到MPNMPN值，值，该怎么办？该怎么办？
